Name: gP2S, מערכת ניהול מידע לניסויי CryoEM (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 13 min 1 s
Description: למדו כיצד להשתמש במערכת gP2S לניהול ניסויי CryoEM, כולל רישום דגימות, רשתות, מיקרוסקופיה ומודלים אטומיים. המערכת תומכת בשיתוף פעולה ובאיכות נתונים גבוהה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים מודים לכל שאר חברי צוות הפיתוח של GP2S שעבדו על הפרויקט מאז הקמתו: רפאל אודזיאלה, סזרי קז'יז'אנובסקי, פזמיסלב סטנקובסקי, יאצ'ק זימסקי, פיוטר סוצ'יקי, קרולינה פאג'וק, יואוט ונדן איידן, דמיאן מירז'ינסקי, מיכאל וויטקובסקי, פיוטר פיקוסה, אנה סורדקה, קמיל לוצק וארתור קוסאק. אנו מודים גם לריימונד הא וקלאודיו צ'יפרי שעזרו להרכיב את הצוות ולעצב את הפרויקט.

1. הגדרת gP2S לעבודה
<ol><li>היכנס ל- gP2S. לאחר כניסה מוצלחת, המסך הראשי מוצג. הערה: בפינה השמאלית העליונה, שם המשתמש מוצג - לחץ על זה כדי להתנתק. סרגל הניווט בצד שמאל מורכב מבורר פרוייקטים (למעלה), קבוצה של פריטי ניווט המפרטים את סוגי הישויות הניסיוניים המגדירים את זרימת העבודה cryoEM (דוגמאות, רשתות, הפעלות מיקרוסקופיה, הפעלות עיבוד, מפות ומודלים) וקישור למקטע הגדרות של היישום.</li>
	<li>לפני שניתן יהיה לרשום ניסויים כלשהם, אכלס את המקטע הגדרות במידע אודות הפרוייקטים, הציוד, המתכלים, התוכנות והפרוטוקולים הנמצאים בשימוש במתקן cryoEM. ניתן לעדכן הגדרות בכל עת על-ידי הוספת כלים ופרוייקטים חדשים ועל-ידי עריכת הערכים הקיימים; עם זאת, בדיוק כמו כל הישויות ב- gP2S, אין אפשרות למחוק ישויות הגדרות לאחר יצירתן.</li>
</ol>2. קבע תצורה של פרוייקט אחד לפחות
<ol><li>נווט אל הגדרות > פרוייקטים.</li>
	<li>לחץ על צור פרוייקט חדש.</li>
	<li>הקלד תווית פרוייקט.</li>
	<li>לחץ על שמור.</li>
</ol>3. הגדר לפחות מכונת טיפול משטחית אחת.
הערה: מכונות טיפול פני השטח משמשות לשינוי תכונות פני השטח של רשתות EM - לרוב הם פולטי זוהר או חומרי ניקוי פלזמה.
<ol><li>מתוך סעיף ציוד, בחר מכונת טיפול פני השטח.</li>
	<li>לחץ על צור מחשב חדש.</li>
	<li>הזן תווית, שתשמש לזיהוי המחשב בהמשך.</li>
	<li>ספק את היצרן, הדגם והמיקום שלו.</li>
	<li>לחץ על שמור.</li>
</ol>4. רשום לפחות סוג רשת אחד.
הערה: סוגי רשת נועדו לזהות מודלים של רשתות (למשל, "2-μm סרט פחמן חורי על רשתות נחושת 300-רשת"), לא אצוות ספציפיות או הרבה רשתות
<ol><li>מהמקטע חומרים מתכלים בחר סוג רשת.</li>
	<li>לחץ על צור סוג רשת חדש.</li>
	<li>הזן תווית, יצרן ותיאור של סוג רשת.</li>
	<li>לחץ על שמור.</li>
</ol>5. רשום לפחות מכונת ויטריפיקציה אחת
<ol><li>במקטע ציוד, בחר מכונת ויטריפיקציה.</li>
	<li>לחץ על צור מחשב חדש.</li>
	<li>ספק את היצרן, הדגם והמיקום שלו.</li>
	<li>לחץ על שמור.</li>
</ol>6. רשום לפחות נייר סופג אחד
<ol><li>מהמקטע חומרים מתכלים בחר נייר סופג.</li>
	<li>לחץ על צור נייר סופג חדש.</li>
	<li>הקלד תווית נייר סופג, יצרן ודגם.</li>
	<li>לחץ על שמור.</li>
</ol>7. רשום לפחות התקן אחסון קריו אחד
<ol><li>במקטע ציוד, בחר התקן אחסון Cryo.</li>
	<li>לחץ על צור התקן אחסון חדש.</li>
	<li>הזן את היצרן, הדגם והמיקום של ההתקן.</li>
	<li>הגדר את המתגים הדו-מצביים כדי לציין אם התקן האחסון שנוסף כולל צילינדרים, צינורות ו/או תיבות. הערה: אם כן, gP2S יאפשר למשתמשים לציין מזהי גליל, צינור ו/או תיבה רלוונטיים בהמשך כאשר משתמשים ירשום את מיקומי האחסון עבור רשתות בודדות. עם חתיכות לעיל של ציוד מתכלים להגדיר, ניתן ליצור שלושה סוגים של פרוטוקולים - טיפול פני השטח, כתם שלילי Vitrification.</li>
</ol>8. רשום לפחות פרוטוקול טיפול משטחי אחד
<ol><li>במקטע פרוטוקולים, בחר טיפול פני השטח.</li>
	<li>לחץ על צור פרוטוקול חדש.</li>
	<li>הזן תווית כדי לזהות את הפרוטוקול.</li>
	<li>בחר אחת ממכונות הטיפול פני השטח.</li>
	<li>ציין הגדרות המשמשות במהלך פרוטוקול זה: משך זמן, זרם וקוטביות של הפריקה, ולחץ כמו גם כל תוספים באטמוספירה.</li>
	<li>לחץ על שמור.</li>
</ol>9. צור לפחות פרוטוקול כתם שלילי אחד
<ol><li>במקטע פרוטוקולים, בחר כתם שלילי.</li>
	<li>לחץ על צור פרוטוקול חדש.</li>
	<li>הזן תווית פרוטוקול.</li>
	<li>תאר את הכתם על-ידי מתן ערכים עבור שמו, ה- pH וריכוז מלח המתכת הכבדה.</li>
	<li>ציין את זמן הדגירה של הכתם לפני הכתם.</li>
	<li>הזן תיאור טקסט חופשי של הפרוטוקול.</li>
	<li>לחץ על שמור.</li>
</ol>10. רשום לפחות פרוטוקול הקפאת רשת אחד
<ol><li>במקטע פרוטוקולים, בחר באפשרות ויטריפיקציה.</li>
	<li>לחץ על צור פרוטוקול חדש.</li>
	<li>הזן תווית פרוטוקול.</li>
	<li>בחר את מכונת הוויטריפיקציה הרלוונטית מהרשימה הנפתחת.</li>
	<li>בחר את נייר ההפחתה המשמש בפרוטוקול זה.</li>
	<li>לאחר מכן, לספק את המידע הניסיוני הנותר: לחות יחסית, טמפרטורה, כוח כתם, מספר כתמים, זמן כתם, זמן המתנה, זמן ניקוז, מספר יישומי מדגם.</li>
	<li>הזן תיאור של טקסט חופשי.</li>
	<li>לחץ על שמור. הערה: לאחר קביעת התצורה של הפרוטוקולים, ניתן ליצור הן רשתות קריו והן רשתות כתם שלילי. כדי להשתמש ב- gP2S כדי להקליט את השלבים הבאים בזרימת העבודה, החל מהפעלות מיקרוסקופיה, יש צורך להגדיר מיקרוסקופ, גלאי אלקטרונים ומחזיק מדגם.</li>
</ol>11. רשום לפחות מיקרוסקופ אחד
<ol><li>במקטע ציוד, בחר מיקרוסקופ.</li>
	<li>לחץ על צור מיקרוסקופ חדש.
</li>
	<li>הקלד תווית מיקרוסקופ.</li>
	<li>ספק את היצרן, הדגם והמיקום שלו.</li>
	<li>בחר אילו מתחי האצה מוגדרים ושישים במיקרוסקופ זה, מתוך הרשימה המוגדרת מראש של 80, 120, 200 ו- 300 kV.</li>
	<li>ציין את רשימת המלבן ("C2") ואת פתחי האובייקטים המותקנים. הערה: עבור כל סוג, ניתן להגדיר עד 4 חריצי צמצם, שאחד מהם מוגדר כצמצם ברירת המחדל עבור מיקרוסקופ זה. במקרה של פתחים אובייקטיביים, לציין כי אחד או יותר של החריצים נלקחים על ידי צלחת פאזה, ובמקרה זה הפרמטר קוטר מושבת.</li>
	<li>ציין אם מיקרוסקופ זה מצויד במטען אוטומטי או דורש מחזיק כניסה צדדית.</li>
	<li>ציין אם המיקרוסקופ מצויד במסנן אנרגיה.</li>
	<li>ספק ערכי ברירת מחדל עבור מתח מיצוי, הגדרת עדשות אקדח, גודל ספוט ורוחב חריץ של מסנן אנרגיה (אם רלוונטי). הערכים שסופקו ישמשו כאשר משתמשים ייצרו הפעלות מיקרוסקופיה.</li>
</ol>12. רשום לפחות גלאי אלקטרונים אחד
<ol><li>מתוך המקטע ציוד, בחר גלאי אלקטרונים.</li>
	<li>לחץ על יצירת גלאי אלקטרונים חדש.</li>
	<li>הזן תווית, יצרן ודגם.</li>
	<li>בחר מתוך רשימה נפתחת של המיקרוסקופ שעליו מותקן גלאי זה.</li>
	<li>הוסף לפחות הגדלה אחת מכויל עבור שילוב זה מיקרוסקופ גלאי:<ol>
<li>תחת הגדלות, בחר הוסף חדש.</li>
		<li>ספק ערכי הגדלה נומינליים ומכוילים כאחד.</li>
		<li>חזור על שלבים אלה עבור כל הגדרות ההגדלה הצפויות. הגדרות הגדלה אלה יהיו זמינות מאוחר יותר בבורר נפתח עבור משתמשים המבצעים רישום של הפעלות מיקרוסקופיה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>השתמש בתיבות סימון כדי לציין אם הגלאי מסוגל לספור אלקטרונים, שבר מינון ורזולוציית-על.</li>
	<li>לבסוף, ספק מפרטים נוספים של הגלאי: גורם ספירה לפי אלקטרונים (המספר הממוצע של ספירות שנרשמו על-ידי אלקטרון אירוע), הממד הליניארי של כל פיקסל (ב- μm) ומספרי השורות והעמודות של פיקסלים.</li>
	<li>לחץ על שמור
</li>
</ol>13. אם יש מיקרוסקופ אחד או יותר הדורשים מחזיקי מדגם כניסה צדדית, לרשום מחזיקי מדגם זמין gP2S.
<ol><li>במקטע ציוד, בחר מחזיק לדוגמה.</li>
	<li>לחץ על צור מחזיק חדש.</li>
	<li>הזן תווית, יצרן, דגם ומיקום.</li>
	<li>ציין את ההטיה המרבית (במעלות) עבור מחזיק הדגימה.</li>
	<li>השתמש בתיבות הסימון כדי לציין אם הוא מסוגל להחזיק רשתות EM קריוגניות והאם הוא מסוגל להטות ציר כפול.</li>
	<li>מתוך רשימה נפתחת, בחר את כל המיקרוסקופים שבהם ניתן להשתמש במחזיק זה. הערה: פעולה זו תבטיח שרק מחזיקים רלוונטיים יופיעו כאשר משתמשים רושמים מפגשי מיקרוסקופיה באמצעות מיקרוסקופים של כניסה צדדית.</li>
	<li>לחץ על שמור.</li>
</ol>14. ציין את התבנית שבה יופיע gP2S בהגדרת שם הספריה המשויך לכל הפעלת מיקרוסקופיה.
הערה: זה יכול להיות מאוד שימושי יש gP2S באופן אוטומטי ליצור שם ספריה לאחסון של נתוני תמונה שנרשמו במהלך הפעלת מיקרוסקופיה. פעולה זו מבטיחה מתן שמות שיטתי ועשיר במידע לספריות אחסון. ציין את התבנית שבה יופיע gP2S בהגדרת שם הספריה המשויך לכל הפעלת מיקרוסקופיה.
<ol><li>במקטע ניהול, בחר הגדרות.</li>
	<li>ערוך את מחרוזת התבנית של שם הספריה. הערה: מחרוזת זו עשויה להכיל את המשתנים הבאים: תווית פרוייקט, מזהה רשת, תווית רשת, תווית הפעלת מיקרוסקופיה, מזהה הפעלת מיקרוסקופיה, תאריך התחלה של הפעלת מיקרוסקופיה, שעת התחלה של הפעלת מיקרוסקופיה ותווית מיקרוסקופ, המופרדת באמצעות ${}. מלבד משתנים אלה, תבניות שם ספריה עשויות להכיל את רוב התווים. תבנית שם הספריה המשמשת כברירת מחדל, לדוגמה, היא ${GridLabel}_${MicroscopyStartDate}_${ProjectLabel}_${מיקרוסקופלאבל}_grid_${GridID}_session_${מיקרוסקופיהSessionID}. כעת, הגדרות מספיקות מוגדרות כדי לאפשר רישום של ישויות ניסיוניות עד וכולל מפגשי מיקרוסקופיה.</li>
</ol>15. רשום תוכנה לעיבוד תמונה הזמינה למשתמשים.
הערה: פעולה זו תאפשר רישום של הפעלות עיבוד וסוגי ישויות מאוחרים יותר (מפות ומודלים).
<ol><li>בחר עיבוד תמונה.</li>
	<li>לחץ על צור תוכנה חדשה לעיבוד תמונה.</li>
	<li>הקלד את שם התוכנה</li>
	<li>פרט את כל הגירסאות הזמינות למשתמשים:<ol>
<li>תחת גירסאות תוכנה, בחר הוסף חדש.</li>
		<li>הזן את גירסת התוכנה. הערה: פעולה זו תאפשר למשתמשים לציין בדיוק באיזו גירסה של התוכנה הם השתמשו כדי להגיע לתוצאות שלהם בעת רישום הפעלות עיבוד תמונה. פעולה זו משלימה את התצורה הדרושה של gP2S. משתמשים צריכים כעת להיות מסוגלים ללכוד במדויק מטה-נתונים מרכזיים המתארים את ניסויי מיקרוסקופ אלקטרונים שלהם, כמתואר בסעיף הבא.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Primer+to+Single-Particle+Cryo-Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li>
<li>High-End Cryo-EMs Worldwide. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.google.com/maps/d/u/0/viewer?mid=1eQ1r8BiDYfaK7D1S9EeFJEgkLggMyoaT">https://www.google.com/maps/d/u/0/viewer?mid=1eQ1r8BiDYfaK7D1S9EeFJEgkLggMyoaT</a> (2021).</li>
<li>Renaud, J. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+in+drug+discovery%3A+achievements%2C+limitations+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM in drug discovery: achievements, limitations and prospects.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 17 (7), 471-492 (2018).</li>
<li>Alewijnse, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+managing+large+CryoEM+facilities%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Best practices for managing large CryoEM facilities.</a> Journal of Structural Biology. 199 (3), 225-236 (2017).</li>
<li>Rees, I., Langley, E., Chiu, W., Ludtke, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMEN2%3A+An+Object+Oriented+Database+and+Electronic+Lab+Notebook%5BTitle%5D)+AND+%22Microscopy+and+Microanalysis%22%5BJournal%5D)">EMEN2: An Object Oriented Database and Electronic Lab Notebook.</a> Microscopy and Microanalysis. 19 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Delagenière, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ISPyB%3A+an+information+management+system+for+synchrotron+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography.</a> Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).</li>
<li>dela Rosa-Trevín, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scipion%3A+A+software+framework+toward+integration%2C+reproducibility+and+validation+in+3D+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Scipion: A software framework toward integration, reproducibility and validation in 3D electron microscopy.</a> Journal of Structural Biology. 195 (1), 93-99 (2016).</li>
<li>EMPIAR deposition manual. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ebi.ac.u/pdbe/emdb/empiar/depostion/manual/#manScipion">https://www.ebi.ac.u/pdbe/emdb/empiar/depostion/manual/#manScipion</a> (2021).</li>
<li>Iudin, A., Korir, P. K., Salavert-Torres, J., Kleywegt, G. J., Patwardhan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EMPIAR%3A+a+public+archive+for+raw+electron+microscopy+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">EMPIAR: a public archive for raw electron microscopy image data.</a> Nature Methods. 13 (5), 387-388 (2016).</li>
<li>Vue.js. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://vuejs.org">https://vuejs.org</a> (2021).</li>
<li>Spring Boot. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://spring.io/projects/spring-boot">https://spring.io/projects/spring-boot</a> (2021).</li>
<li>Lightweight Directory Access Protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ldap.com">https://ldap.com</a> (2021).</li>
<li>Vue CLI. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cli.vuejs.org">https://cli.vuejs.org</a> (2021).</li>
<li>Element, A Desktop UI Library. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://element.eleme.io">https://element.eleme.io</a> (2021).</li>
<li>Sass. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://sass-lang.com/">https://sass-lang.com/</a> (2021).</li>
<li>Karma. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://karma-runner.github.io/">http://karma-runner.github.io/</a> (2021).</li>
<li>Node.js. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://nodejs.org/">https://nodejs.org/</a> (2021).</li>
<li>Java. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.java.com/">https://www.java.com/</a> (2021).</li>
<li>Apache Tomcat. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://tomcat.apache.org/">http://tomcat.apache.org/</a> (2021).</li>
<li>Hibernate. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://hibernate.org">https://hibernate.org</a> (2021).</li>
<li>Swagger UI. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://swagger.io/tools/swagger-ui/">https://swagger.io/tools/swagger-ui/</a> (2021).</li>
<li>JUnit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://junit.org/junit4/">https://junit.org/junit4/</a> (2020).</li>
<li>Apache Maven Project. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://maven.apache.org/">https://maven.apache.org/</a> (2020).</li>
<li>MySQL. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mysql.com/">https://www.mysql.com/</a> (2020).</li>
<li>mongoDB. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.mongodb.com/">https://www.mongodb.com/</a> (2020).</li>
<li>Apache license, version 2.0. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.apache.org/licenses/license-2.0">https://www.apache.org/licenses/license-2.0</a> (2004).</li>
<li>mysql Docker Official Image. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://hub.docker.com/_/mysql">https://hub.docker.com/_/mysql</a> (2021).</li>
<li>mongo Docker Official Image. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://hub.docker.com/_/mongo">https://hub.docker.com/_/mongo</a> (2021).</li>
<li>openmicroscopy apacheds. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://hub.docker.com/r/openmicroscopy/apacheds">https://hub.docker.com/r/openmicroscopy/apacheds</a> (2021).</li>
</ol>

כל הכותבים הם קבלנים עם או עובדים של רוש או של חברת הבת שלה Genentech.

כאשר נעשה שימוש נכון ועקבי, gP2S מסייע להשיג רישום נכון של מטה-נתונים באיכות גבוהה על-ידי אכיפת ההקלטה של מטה-נתונים ניסיוניים קריטיים באמצעות מודלי נתונים מובנים ואוצר מילים מוגדר, אך הערך המוסף של זה ממומש במלואו רק כאשר רמה גבוהה של תאימות מושגת במעבדה. הפרוטוקול לעיל אינו מכסה כיצד להשיג זאת. מצאנו כי טכניקת אכיפה יעילה הייתה שמפעילי מיקרוסקופ יסרבו לאסוף נתונים על רשתות שאינן רשומות ב- gP2S. זה הניע את הציות מהר מאוד והניח את הקרקע להופעתו, במהלך החודשים הבאים, של גוף גדול של פרטים ניסיוניים מפורטים ומדויקים וזיכרון תאגידי. לאחר כמה חודשים של שימוש, הערך של קורפוס של מטה-נתונים המאוחסנים gP2S הפך כל כך ברור לרוב המשתמשים כי תאימות נשאר גבוה ללא התערבות מפורשת.
מינוף מלא של זיכרון קולקטיבי זה דורש שהמטה-נתונים המאוחסנים ב- gP2S יהיו נגישים למערכות חיצוניות וישויכו בקלות לנתונים (מיקרוגרפים) ולתוצאות הניסיוניים (מפות ודגמים). הפרוטוקול לעיל אינו מתאר כיצד לשלב gP2S עם אינפורמטיקה ומערכות עיבוד נתונים אחרות. הפשוטים ביותר הם אינטגרציות פוטנציאליות באמצעות ה- API של מנוחה העורפית של gP2S, אשר אינם דורשים כל שינוי של gP2S. לדוגמה, כל מחשב השולט בגלאי איסוף הנתונים שלנו מפעיל סקריפט אשר מעת לעת מבצע שאילתה על נקודת הקצה של gP2S "getItemByMicroscope" תחת בקר REST של ניהול הפעלת מיקרוסקופיה, כדי לבדוק אם הפעלת מיקרוסקופיה נמשכת במיקרוסקופ שלה. אם כן, קובץ ה- Script מאחזר מ- gP2S את שם ספריית אחסון הנתונים המתאים (כפי שתצורתו נקבעה בדף הגדרות, ראה לעיל) ויוצר ספריה בהתקן אחסון הנתונים המקומי באמצעות שם זה. פעולה זו מבטיחה מתן שמות שיטתי לספריות אחסון נתונים ומפחיתה את הסיכון לשגיאה עקב שגיאות הקלדה.
למרות שהם כבר העירו במקור של הגירסה הציבורית של gP2S, אינטגרציות נוספות מעורבים gP2S לצרוך נתונים של מערכות חיצוניות אפשריים גם. במעבדה שלנו, הפריסה שלנו של gP2S משתלבת עם (i) מערכת ניהול פרוייקטים, כך שכל פרויקט המוגדר ב- gP2S יכול להיות מקושר לפרויקט תיקים כלל-ארגוני, וניתן להציג מטה-נתונים מהתיק בתוך gP2S; (ii) מערכת רישום חלבונים, כך שכל חלבון שנוסף ל- gP2S מקושר, באמצעות מזהה המאוחסן באופן מקומי, לקבוצה שלמה של רשומות המפרטות את מקור החלבון, כוללות פרטים על הביולוגיה המולקולרית הרלוונטית, מערכת הביטוי והטיהור; (iii) מערכת ניהול תרכובת מולקולה קטנה, המאפשרת ל- gP2S להציג מידע מפתח אודות כל ליגנד, כגון המבנה הכימי שלו. שינויי הקוד הדרושים כדי לאפשר שילובים אלה מתוארים בסעיף "שילוב" של מסמך README-BUILD.md הזמין ממאגר gP2S (https://github.com/arohou/gP2S).
הגרסה הנוכחית של gP2S יש מגבלות, הראשון ביניהם הוא מודל נתונים פשטני מדי frontend עבור מבנה (מודל) תצהיר. זה הושאר בכוונה במצב "barebones" בגירסה ששוחררה של gP2S כי תצהיר מבנה מלא ותכונת אימות נמצא כעת בפיתוח יחד עם תמיכה קריסטלוגרפיה רנטגן. החלטה עיצובית נוספת הייתה לא ליישם כל הרשאה או מערכת הרשאות: לכל המשתמשים ב- gP2S יש גישה שווה לתכונות ולנתונים שלה. זה עשוי להפוך אותו בחירה גרועה עבור מתקנים המשרתים קבוצות משתמשים עם אינטרסים מתחרים ודרישות סודיות, אבל לא היה דאגה למתקן שלנו.
הפיתוח של הגרסה הביתית שלנו של gP2S נמשך ומקווים כי גרסת הקוד הפתוח המתוארת כאן תהיה שימושית לקבוצות cryoEM אחרות, וכי חלקם עשויים לתרום הצעות, או שיפורי קוד בעתיד. פיתוחים עתידיים בעלי ערך גבוה יכולים למשל להתמקד באינטגרציות עם ציוד מעבדה (רובוטי ויטריפיקציה, מיקרוסקופים אלקטרונים), תוכנה (למשל כדי לקצור מטה-נתונים של עיבוד תמונה) ומאגרים ציבוריים חיצוניים (למשל כדי להקל על תצהירים על מבנים).
לאוסף השיטתי של מטה-נתונים איכותיים המופעלים על ידי שימוש שגרתי ב-gP2S במעבדה ובמתקן cryoEM יכולה להיות השפעה משמעותית וחיובית על היכולת לתבוע פרויקטים מרובים במקביל על פני תקופה של שנים. ככל שיוקמו יותר ויותר קבוצות ומתקנים משותפים וריכוזיים של cryoEM, אנו צופים שהצורך במערכות ניהול מידע כגון gP2S ימשיך לגדול.

ניהול מידע במתקני cryoEM החל משנת 2014 בערך, מספר מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגניים (cryoEM)1 מתקנים גדל באופן נפיץ, עם לפחות 300 מערכות high-end מותקן ברחבי העולם2, כולל במספר בחברות התרופות, המשקף תפקיד גדל והולך עבור cryoEM בגילוי סמים3. המשימות של מתקנים אלה, ואת הדרישות שלהם למעקב אחר נתונים וניהולשונים 4. חלקם, למשל מרכזי cryoEM לאומיים, מואשמים בקבלת רשתות EM, איסוף ערכות נתונים והחזרת נתונים למשתמשים לצורך קביעת מבנה, אולי לאחר עיבוד תמונה אוטומטי. במתקנים כאלה, מעקב אחר מקור הרשת, הקשר שלה להצעת משתמש או מענק, והשושלת מרשת לקבוצת נתונים היא קריטית, אך גורמים אחרים, כגון שיטת הטיהור של דגימת החלבון או תהליך קביעת המבנה בסופו של דבר, הם פחות, או בכלל לא, רלוונטיים. במתקנים אחרים, כגון מתקנים אקדמיים מקומיים, כל משתמש קצה אחראי על הכנת הדגימות והרשתות שלו, ניהול המיקרוסקופיה, ניהול הנתונים הגולמיים ועיבודם ופרסום התוצאות. אין צורך מחמיר במעקב אחר מטה-נתונים בחלק של מתקן כזה מאחר שתפקידו זה מתקיים על-ידי משתמש הקצה או החוקר הראשי שלו.
במתקן cryoEM שלנו, הטיפול והאופטימיזציה של דגימות, רשתות, פרוטוקולי איסוף ועיבוד נתונים, ותוצאות (מפות, מודלים) מרוכז על פני פרויקטים רבים על קבוצה קטנה של מתרגלים. זה מציב אתגרים בניהול נתונים ניסיוני (meta).. יש ללכוד ולשמר במדויק את שושלת המבנים הניסיוניים, החל מהמודל האטומי וכלה בזהות המדויקת של חלבונים וליגנדים, דרך פרמטרים להכנת רשת ופרוטוקולי איסוף נתונים. מטה-נתונים אלה חייבים להיות זמינים למספר אופרטורים אנושיים. לדוגמה, אדם שעושה עיבוד תמונה ייתכן שיהיה צורך לדעת איזה מבנה של חלבון שימש ומה היו הפרמטרים הדמיה, למרות שהם לא טיהרו את החלבון ולא אספו את נתוני cryoEM עצמם; מערכות אינפורמטיקה כגון daemons ניהול נתונים אוטומטי צריך לזהות את הפרויקט שעבורו מיקרוסקופ אוסף כעת נתונים על מנת להקצות כראוי ובשיטתיות שמות ספריות.
מספר מערכות לניהול מידע זמינות לתמיכה במתקני cryoEM. אולי השלם ביותר ביניהם הוא EMEN25, המשלב תכונות של מחברת מעבדה אלקטרונית, מערכת ניהול מידע, וכמה אלמנטים של כלי ניהול תהליכים עסקיים. ISPyB6,ששימש בסנכרון רבים, נבנה במקור כדי לתמוך בקווי הרנטגן לקריסטלוגרפיה, תומך כעת גם באיסוף נתוני cryoEM. Scipion7 הוא עטיפה עשירה ורבת עוצמה סביב חבילות עיבוד תמונה, המאפשר למשתמשים להקליט זרימות עבודה עיבוד תמונה ולשתף אותם, למשל באמצעות המאגר הציבורי EMPIAR8,9, והוא משולב גם עם ISPyB כדי לאפשר עיבוד נתונים cryoEM תוך כדי תנועה.
כאן אנו מתארים gP2S (עבור חלבון Genentech למבנה), מערכת ניהול מידע קריום מודרנית וקלת משקל שנבנתה כדי לתמוך בזרימת העבודה מחלבון מטוהר וליגנד מולקולה קטנה ועד למודל האטומי הסופי.
מבט כולל על gP2S gP2S היא מערכת לניהול מידע cryoEM ידידותית למשתמש, המאפשרת רישום רשומות מדויק עבור מעבדות cryoEM ומתקנים מרובי משתמשים מרובי פרוייקטים. מתבצע מעקב אחר הישויות הבאות, קשרי הגומלין שלהן והמטה-נתונים המשויכים להן: פרוייקטים, ציוד, חומרים מתכלים, פרוטוקולים, דגימות, רשתות, הפעלות מיקרוסקופיות, הפעלות עיבוד תמונה, מפות ומודלים אטומיים. משתמשים יכולים גם להוסיף הערות טקסט חופשי, באופן אופציונלי כולל קבצים מצורפים, המאפשר ביאור עשיר של כל ישות הרשומה ב- gP2S. החזית תוכננה כדי להקל על השימוש עם התקני מסך מגע ונבדקה בהרחבה על 12.9" iPad Pros, מה שמאפשר להשתמש gP2S על ספסל המעבדה בעת הכנת דגימות ורשתות (איור 1), כמו גם במחשב בעת הפעלת מיקרוסקופ, עיבוד תמונות או הדגמים הפקדה. כל דף בחזית שואף להפחית הזנת נתונים ידנית על ידי הגדרה מראש של פרמטרים לערכי ברירת מחדל הגיוניים במידת האפשר.
הקצה העורפי של gP2S כולל מספר נקודות קצה של REST API (ממשק תיכנות יישומים של העברת מצב REpresentational), המאפשרות לשלב gP2S בזרימות עבודה ובקבצי Script קיימים. מודל הנתונים נועד לאפשר לכידה מדויקת של זרימות עבודה שליליות של כתמים והקפאה, כולל הסתעפות, לדוגמה עם מדגם אחד המשמש במספר רשתות, נתונים ממספר מפגשי מיקרוסקופיה הממוזגים להפעלה אחת של עיבוד נתונים, או הפעלת עיבוד נתונים אחת המניבה מספר מפות.
ארכיטקטורת מערכת gP2S הוא יישום קלאסי בן שלוש שכבות (איור 2). בארכיטקטורה מודולרית זו, המערכת מחולקת לשלוש שכבות נפרדות, שכל אחת מהן אחראית לביצוע חובות נפרדות, וכל אחת מהן ניתנת להחלפה או ניתנת לשינוי ללא תלות באחרים. (1) שכבת המצגת (או החזית) מספקת למשתמש גישה באמצעות דפדפן אינטרנט (נבדק בהרחבה עם Chrome ו- Safari), מאפשרת יצירה ושינוי של רכיבי זרימת עבודה (כולל אימות נתונים) ומציגה נתונים ניסיוניים כישויות בודדות, רשימות מבוססות פרוייקט ודוחות זרימת עבודה מלאים. (2) שכבת השירות (או הקצה העורפי) משמשת כשכבת ביניים בין ממשק המשתמש למערכת האחסון - היא מחזיקה בלוגיקה עסקית מרכזית, חושפת את ה- API של השירות המשמש את החזית, משתלבת עם אחסון נתונים ומערכת LDAP (פרוטוקול גישה לספריה קלת משקל) לאימות משתמשים, ומספקת בסיס לשילוב נוסף עם מערכות חיצוניות. (3) שכבת ההתמדה (גישה לנתונים) אחראית לאחסון נתונים ניסיוניים, הערות משתמש וקבצים מצורפים.
טכנולוגיות ומסגרות מרכזיות על מנת להקל על פיתוח, הקמה ותחזוקה של יישום gP2S, נעשה שימוש במספר טכנולוגיות ומסגרות בפרויקט. החשובים ביותר הם: Vue.js 2.4.210 עבור frontend ו SpringBoot 1.311 עם מוטבע Tomcat 8 שרת עבור backend. היישום משתמש במסדי נתונים MySQL 5.7 ו- MongoDB 4.0.6 לאחסון ו- LDAP12 לאימות. כברירת מחדל, כל חלקי רכיבים אלה נשלחים ונפרסים כיישום אחד.
בסך הכל היישום משתמש במאות ספריות שונות במישרין או בעקיפין. הבולטים שבהם רשומים בטבלה 1.
מודל נתונים ניתן להבחין בין שלושה סוגים של ישויות במודל הנתונים gP2S (איור 3): ישויות זרימת עבודה הקשורות לנתונים שנאספו במהלך ניסויים (לדוגמה, דוגמאות או הפעלות מיקרוסקופיות); ישויות ציוד ופרוטוקול המתארות נתונים הנפוצים בכל הפרוייקטים (למשל, מיקרוסקופים או פרוטוקולי ויטריפיקציה); ישויות אחרות הממלאות תפקידים תומכים או טכניים במערכת (למשל, הערות או ערכי ברירת מחדל).
הבסיס של עץ הנתונים של זרימת העבודה הוא הישות Project. כל פרויקט מורכב ממספר חלבונים ו/או ליגנדים שהם אבני בניין ליצירת ישויות לדוגמה. ניתן להשתמש בכל דגימה ליצירת רשתות מרובות המשמשות בתורן בהפעלות מיקרוסקופיות (רשת אחת לכל הפעלת מיקרוסקופיה). האחרונים מוקצים לעיבוד הפעלות שיכולות להניב המפה אחת או יותר. הישות האחרונה בעץ היא המודל האטומי, שנוצר באמצעות המפה אחת או יותר. כתוצאה מכך, כל ישות הקשורה לזרימת עבודה, מחלבון למודל, מחויבת תמיד לפרוייקט מסוים באמצעות אבותיו. עיצוב כזה יוצר צבירות נתונים שקל לעבד על-ידי מודול החזית או על-ידי מערכות חיצוניות המשתמשות ב- API.
בנוסף לנתוני זרימת עבודה קיימות ישויות המתארות ציוד המשמש בניסויים או בפרוטוקולים שעקבו אחריהם בעת הכנת רשתות. הגדרת ישויות אלה היא תנאי מוקדם ליצירת ישויות זרימת עבודה ניסיוניות כגון רשתות, מיקרוסקופיה והפעלות עיבוד.
הסוג האחרון של ישות נתונים, הנקרא באופן קולקטיבי "אחר", משמש למטרות טכניות (לדוגמה, קבצים מצורפים או ערכי ברירת מחדל). קטגוריה זו כוללת ישויות הערה שניתן לקשר לכל זרימת עבודה או ישויות ציוד/פרוטוקול.
זמינות תוכנה גרסת הקוד הפתוח של gP2S זמינה תחת רישיון אפאצ'י גרסה2.0 26, מ https://github.com/arohou/gP2S. תמונת Docker להפעלת gP2S זמינה מ- https://hub.docker.com/r/arohou/gp2s. סניף מקור סגור של gP2S נמצא בפיתוח מתמשך ב Roche & Genentech.
הפעלת יישום gP2S קיימות שתי דרכים להפעלת gP2S: כגורם מכיל של docker או כיישום Java עצמאי. הבחירה האופטימלית תהיה תלויה בסביבת פריסת היעד. לדוגמה, אם היכולת להתאים אישית או לשפר את הקוד כך שיתאים לצרכים ספציפיים של המשתמשים רצויה, יש לבנות מחדש תחילה את היישום כולו. במקרה זה, מומלץ להפעיל gP2S כיישום עצמאי.
גורם מכיל של Docker הדרך הקלה ביותר להתחיל לעבוד עם יישום gP2S היא להפעיל אותו כשירות Docker. לשם כך, תמונת דוקר ייעודית הוכנה ופורסמה במאגר Docker Hub ("https://hub.docker.com/r/arohou/gp2s"). הפעלת תמונת gP2S תלויה בגישה למסדי נתונים של MySQL ו- MongoDB ולשרת LDAP. עבור סביבה שאינה סביבת ייצור, מומלץ להפעיל את כל יחסי התלות הללו כיישומי Docker מרובי גורמים מכילים יחד עם יישום gP2S. כדי להפוך את זה לחלק, קובץ חיבור docker (https://github.com/arohou/gP2S/blob/master/docker-compose.yml) הכולל את כל התצורות הדרושות של הסביבה הסופית הוכן וניתן במאגר gP2S GitHub (https://github.com/arohou/gP2S). תמונות docker הבאות הן תלות: mysql27, mongodb28, apacheds29.
בתצורת ברירת המחדל, כל הנתונים המאוחסנים, הן ישויות והן קבצים מצורפים יימחקו בעת הסרת הגורמים המכילים של docker. כדי לשמור על הנתונים, יש להשתמש באמצעי אחסון של docker, או ביישום gP2S שיש לחבר למופעי מסד נתונים ייעודיים (MySQL ו- MongoDB). הגורם המכיל של שרת LDAP של ApacheDS מגיע עם משתמש מנהל מערכת שתצורתו נקבעה מראש (סיסמה: סוד). יש להשתמש באישורים אלה כדי להיכנס ליישום gP2S כאשר הוא מופעל כשירות Docker. עבור סביבות ייצור ניתן להשתמש באותו קובץ חיבור docker כדי לפרוס gP2S (ומכולות אחרות במידת הצורך) כשירותים לפלטפורמת תזמור מכולות של Docker Swarm.
התהליך המלא של הפעלת gP2S כגורם מכיל של Docker, כולל כל הפרטים לגבי התצורה הנכונה מתואר במאגר gP2S GitHub ומכסה את הנושאים הבאים:
• הפעלת יישום gP2S מנוקב עם כל יחסי התלות. • גישה ליישום gP2S, מסד נתונים ו- LDAP. • עדכון שירות gP2S בגירסה חדשה. • הסרת יישום gP2S. • קביעת תצורה של התמדה בנתונים. • חיבור יישום gP2S מנוקב למסדי נתונים ייעודיים או לשרת LDAP. • פרטי תצורה
יישום Java עצמאי אפשרות נוספת להפעיל את יישום gP2S היא לבנות חבילת Java עצמאית. יש לנקוט בגישה זו אם הפעלת גורמים מכילים של Docker אינה אפשרית. בניית יישום gP2S דורשת התקנת ערכת פיתוח Java גירסה 8 ומעלה. תהליך הבנייה כולו מנוהל על ידי הכלי Maven, המסופק בבסיס הקוד במאגר GitHub. תצורת הבנייה מוכנה לבנות תחילה את החלק החזיתי, לאחר מכן להעתיק אותו למקורות העורפיים ולאחר מכן לבנות אותו כיישום סופי. בדרך זו, אין צורך להתקין כלים או ספריות אחרים על מנת להכין חבילת gP2S מתפקדת במלואה. כברירת מחדל, תוצאת הבנייה היא חבילת JAR (מאוחסנת מקומית) ותמונת Docker (נדחפת למאגר שהוגדר בקובץ .xml הפונפון של מייבן). חשוב לזכור כי יש לספק מידע הדרוש להתחברות למערכות חיצוניות (מסדי נתונים ושרת LDAP) בקובץ תצורה מתאים לפני בניית החבילה.
לאחר יצירת חבילת gP2S JAR, היא מכילה את כל יחסי התלות ומידע התצורה הדרושים להפעלת היישום, כולל שרת היישומים Tomcat המארח את המערכת. אם החבילה נבנתה עם קבצי תצורה מרובים, ניתן להפעיל אותה במצבים שונים מבלי לבנות אותה מחדש.
מאגר gP2S GitHub כולל תיאור מלא של תהליך הבנייה וההפעלה של gP2S כיישום עצמאי ומכסה את הנושאים הבאים:
• בניית gP2S באמצעות הכלי מייבן • בנייה והפעלה עם מסדי נתונים מוטבעים • בנייה והפעלה עם יחסי תלות שנפרסו כמכלי docker • בנייה וריצה עם מאגרי מידע ייעודיים • קביעת תצורה של אימות

gp2s, מערכת ניהול מידע לניסויי cryoem

gP2S, an Information Management System for CryoEM Experiments

מיקרוסקופ אלקטרונים קריוגניים (cryoEM) הפך לחלק בלתי נפרד מפרויקטים רבים לגילוי תרופות מכיוון שקריסטלוגרפיה של יעד החלבון אינה תמיד ברת השגה וקריום מספקת אמצעי חלופי לתמיכה בתכנון ליגנד מבוסס מבנה. כאשר מתמודדים עם מספר רב של פרויקטים נפרדים, ובתוך כל פרויקט מספר גדול פוטנציאלי של מבנים משותפים חלבון ליגנד, רישום מדויק שמירה במהירות הופך מאתגר. פרמטרים ניסיוניים רבים מכווננים לכל מטרה, כולל בשלבי הכנת הדגימה, הכנת הרשת והמיקרוסקופיה. לכן, שמירת רשומות מדויקת יכולה להיות חשובה ביותר כדי לאפשר רבייה לטווח ארוך, ולאפשר עבודת צוות יעילה, במיוחד כאשר שלבים של זרימת העבודה cryoEM מבוצעים על ידי אופרטורים שונים. כדי לסייע בהתמודדות עם אתגר זה, פיתחנו מערכת ניהול מידע מבוססת אינטרנט עבור cryoEM, הנקראת gP2S. 
היישום עוקב אחר כל ניסוי, מדגם למודל אטומי סופי, בהקשר של פרויקטים, רשימה של אשר נשמרת ביישום, או חיצונית במערכת נפרדת. אוצר מילים מבוקר המוגדר על-ידי המשתמש של חומרים מתכלים, ציוד, פרוטוקולים ותוכנות מסייע לתאר כל שלב בזרימת העבודה cryoEM באופן מובנה. gP2S ניתן להגדרה באופן נרחב, ובהתאם לצרכי הצוות, עשוי להתקיים כמוצר עצמאי או להיות חלק ממערכת אקולוגית רחבה יותר של יישומים מדעיים, שילוב באמצעות API REST עם כלי ניהול פרוייקטים, יישומים העוקבים אחר ייצור חלבונים או של ליגנדים מולקולות קטנות, או יישומים לאוטומציה של איסוף ואחסון נתונים. משתמשים יכולים לרשום פרטים של כל הפעלת רשת ומיקרוסקופיה כולל מטא-נתונים ניסיוניים וערכי פרמטרים מרכזיים, ושושלת היוחסין של כל חפץ ניסיוני (מדגם, רשת, הפעלת מיקרוסקופיה, מפה וכו ') נרשמת. gP2S משמש כמארגן זרימת עבודה ניסיוני cryoEM המאפשר שמירת רשומות מדויקת עבור צוותים, והוא זמין תחת רישיון קוד פתוח.

gP2S הוא יישום אינטרנט למעקב אחר ניסויי cryoEM. התכונות העיקריות שלו מתוארות, כמו גם השלבים הדרושים להתקנה וקביעת התצורה של היישום. לאחר קביעת התצורה, היישום מאפשר לרשום במדויק מטה-נתונים הקשורים לניסויי כתם והקפאה שליליים.

gP2S, מערכת ניהול מידע לניסויי CryoEM

Cryogenic electron microscopy (cryoEM) has become an integral part of many drug-discovery projects because crystallography of the protein target is not ...

כדי להיכנס ל- gP2S, הקלד את שם המשתמש והסיסמה שלך. בצד שמאל, באפשרותך לראות את סרגל הניווט המורכב מבורר פרוייקטים וקבוצה של פריטי ניווט המפרטת את סוגי הישויות הניסיוניים של זרימת העבודה CryoEMEM, דגימות המורכבות מחלבונים או ליגנדים או שילוב של שני אלה, רשתות, הפעלות מיקרוסקופיה, הפעלות עיבוד, מפות ודגמים. הרכיב האחרון בסרגל הניווט הוא קישור למקטע ההגדרות של היישום.כאן, תוכל להוסיף מספר ישויות שיאפשרו לך להקליט ניסויים ב- gP2S. מילויו יספק מידע עבור רשימות נפתחות שונות לשימוש ברחבי המערכת. כתב היד הנלווה כולל מידע מפורט על אופן ההתקנה וההגדרה של gP2S כך שניתן יהיה להשתמש בו לרישום ניסויים.בסרטון זה, אנו רק להמחיש אחד משלבי התצורה, כיצד לרשום מחזיק מדגם קריוגני, ולאחר מכן כדי להמחיש בפירוט רב יותר כיצד משתמשים יכולים לרשום ניסויים gP2S. ניתן להגדיר מחזיקי דגימה לאחר רישום מיקרוסקופים על-ידי ניווט למקטע המחזיק לדוגמה. בעת רישום מחזיק מדגם חדש, עליך לציין עם אילו מהמיקרוסקופים המוגדרים ניתן להשתמש בו, והאם ניתן להשתמש בו כדי להקריא דגימות.יישום gP2S הוא מונחה פרוייקט. משמעות הדבר היא שניתן ליצור את ישות זרימת העבודה רק בהקשר של פרוייקט. יש לבחור את הפרוייקט הרלוונטי מתוך רשימה נפתחת.בעת בחירת פרוייקט, מספר הישויות מכל סוג המשויכות לפרוייקט זה מוצג במקטע זרימת העבודה. ניתן לראות שבמקרה הספציפי הזה נרשמו 89 דגימות, 203 רשתות, 80 מפגשי מיקרוסקופיה, חמישה מפגשי עיבוד, שבע מפות ושני דגמים. בעת לחיצה על כל אחד מסוגי ישויות זרימת העבודה, לדוגמה הפעלות מיקרוסקופיות, מוצגת רשימה של ישויות אלה.רשימה זו מורכבת מתווית. ייתכן שיש גם דגל, כמו במקרה זה, כדי להראות אם זה היה מפגש קריו או מיקרוסקופיה כתם שלילי, ועד שישה שדות מטה-נתונים מרכזיים. במקרה של הפעלת מיקרוסקופיה, ניתן לראות איזו רשת תועדה, את מספר התמונות שנאספו, את שעות התאריך של ההתחלה והסיום של הפגישה, ואיזה מיקרוסקופ וגלאי שימשו.בחירת אחת הישויות המפורטות פותחת דף פרטים המפרט את כל המידע הזמין עבור פריט זה, אשר במקרה של הפעלות מיקרוסקופיה הוא הרבה. מתחת לפרטי המיקרוסקופיה, ניתן לראות רשימת סיכום של כל ישויות האבות, כגון רשתות ודוגמאות. זה מאפשר ניווט מהיר מאוד דרך השושלת של הישות המוצגת.בואו נקפוץ לדוגמניות כדי לדמיין את זה טוב יותר. לבסוף, ניתן להגיב על כל ישות ב- gP2S על-ידי בחירת הערות. כפי שניתן לראות עבור מודל מסוים זה, הערה אחת כבר קיימת.לחיצה עליו מראה מי ומתי יצר אותו. באפשרותך להוסיף הערה נוספת על-ידי הזנת טקסט חופשי ובמידת האופן אופציונלי צירוף קובץ אחד או יותר. כעת, לאחר שסיירנו בחלק העיקרי של האפליקציה, נדגים כיצד לרשום ישויות ניסיוניות במהלך ניסוי CryoEM.בשלב הראשון של זרימת העבודה, תתבקש לתאר את הדוגמה שלך. על מנת לעשות זאת, אתה צריך להגדיר תחילה לפחות מרכיב אחד, חלבון או ligand. הוספת חלבון חדש דורשת רק תווית חלבון, אך כדי לסייע בתיאור טוב יותר של החלבון, ניתן גם להוסיף מזהה טיהור.שדה זה יכול להכיל מספר אצווה רב או לשמש כמקום לתווית ברקוד. אם gP2S הותאם אישית כדי להשתלב עם מערכת רישום חלבונים, ניתן לאמת את מזהה PUR באופן אוטומטי ולהשתמש בו כדי לאחזר ולהציג מידע מפורט על כמות זו של חלבון. עבור ליגנדים, תווית וריכוז מלאי הם חובה ושני שדות אחרים הם אופציונליים, מזהה מנה של מושג ואצווה.מדגם מוגדר על ידי כל שילוב של חלבונים ו ligands ואת הריכוזים הסופיים שלהם. במקרה שלנו, ניצור מדגם המכיל חלבון אחד שנרשם בעבר ב- gP2S. קל למצוא רכיבים הודות לירידה הניתנת לחיפוש.אם אינך מוצא את הרכיב שלך, באפשרותך ליצור רכיב מאפס בשלב זה. באופן אופציונלי, באפשרותך גם לציין פרטים ניסיוניים אחרים של המדגם שלך, כגון זמן וטמפרטורה של דגירה, מאגר ותיאור פרוטוקול טקסט חופשי. כאשר המדגם שלך מוכן ואתה עושה רשתות, לנווט לרשתות וליצור אחד cryo חדש.בחר את סוג הרשת ואת פרוטוקול הטיפול במשטח המשמש, לדוגמה פרוטוקול פריקה זוהר. לאחר מכן ציינו אם אתם מכינים קריו או רשת כתמים שלילית ובחרו באחד מפרוטוקולי הוויטריפיקציה שהוגדרו מראש מהרשימה הנפתחת. לאחר מכן, בחר מהרשימה הנפתחת את הדוגמה שהחלת על הרשת.אם תבחר לדלל או לרכז את הדגימה שנבחרה, השתמש בדוגמה הדו-מצבית וציין את גורם הדילול או הריכוז הרלוונטי. עליך גם לציין את אמצעי האחסון המוחל על הרשת ובמידת הנראה לציין זמן דגירה. לבסוף, עליך להגדיר את מיקום האחסון ברשת.אם תרצה, שנה את תווית ברירת המחדל ושמור את הרשת. לאחר שרשמת את הרשתות שלך, תוכל לרשום ניסויים באיסוף נתונים על ידי יצירת מפגש מיקרוסקופיה. הטופס מורכב מארבעה חלקים: מידע בסיסי, הגדרות מיקרוסקופ, הגדרות חשיפה ובקרת מיקרוסקופ.המקטע הראשון מכיל מידע בסיסי, תווית, שנה את ערך ברירת המחדל אם תרצה בכך. שים לב שהמערכת ממלאת באופן אוטומטי את התאריך והשעה ההתחלתיים. תאריך ושעת הגימור הם אופציונליים מכיוון שכנראה תרשום את הפעלת המיקרוסקופיה בזמן שהניסוי שלך עדיין נמשך.אם ידועים לך התאריך והשעה לסיום, באפשרותך להקליד אותם באופן ידני או להשתמש בלחצן Now כדי להזין את התאריך והשעה הנוכחיים. לאחר מכן בחר באיזו רשת תצויד ובאיזה מיקרוסקופ נעשה שימוש. כברירת מחדל, המיקרוסקופ האחרון שנעשה בו שימוש בפרוייקט הנוכחי נבחר מראש.בחר גלאי ובמידת האופן, כמה תמונות נאספו. החלק השלישי של הפעלת המיקרוסקופיה מכיל מידע על הגדרות החשיפה. במקטע זה נרשמים המטא-נתונים הבאים: הגדלה, גודל ספוט, קוטר אזור מואר, קצב חשיפה, משך חשיפה ומספר מסגרות.אתה צריך לציין אם nanoprobe, מצב ספירה, שבר מינון, ורזולוציה סופר שימשו. הם מופעלים רק אם למיקרוסקופ ולגלאי שנבחרו יש תכונות אלה. לאחר הזנת גורם האיתור של הפיקסל, אם קיים, מספר פרמטרים חשובים מבחינה ניסיונית מחושבים תוך כדי תנועה ומוצגים.עבודת עיבוד תמונה נרשמת בהפעלת עיבוד. כל הפעלת עיבוד קשורה לפחות להפעלת מיקרוסקופיה אחת, אותה אתה בוחר מתוך רשימה נפתחת. ניתן להוסיף הפעלות מיקרוסקופיות נוספות אם תמזגו נתונים ממספר הפעלות במהלך העיבוד.עליך גם לציין אילו חבילות תוכנה שימשו לבחירת תווית התוכנה והגירסה שלה. יש גם מקום לכמה הערות קשורות. אתה צריך לספק את מספר המיקרוגרפים וחלקיקים הרים.באפשרותך גם לרשום את שם הספריה או את הנתיב המלא שבו ביצעת את העיבוד. לאחר שחזור תלת מימדי אחד או יותר הושגו, המפות ניתן להפקיד לתוך gP2S. כל מפה משויכת להפעלת עיבוד ומורכבת מקובץ המפה הממשי.gP2S מאפשר כל סוג קובץ. הזן מטה-נתונים מרכזיים כגון גודל הפיקסל, מומלץ הוא רמת מתאר לעיבוד פני השטח, איזו סימטריה החלת, מספר התמונות המשמשות ליצירת המפה והרזולוציה המשוערת בחלקים הטובים ביותר שלה, הרזולוציה הגלובלית הממוצעת והרזולוציה בחלקים הגרועים ביותר. כמו במקרה, בחלקים רבים של gP2S, כללי אימות לבדוק את הקלט שלך עבור טעויות ברורות.מפות עשויות להיות משויכות זו לזו באמצעות סוגים שונים של קשרי גומלין. בעת רישום שיוך כזה, עליך לבחור את סוג קשר הגומלין והמפה הקשורה. לאחר שהושג מודל אטומי, ניתן להפקיד אותו ב- gP2S.הוסף קובץ מודל, רזולוציה ומפה או רשימת מפות שממנה נגזר המודל. בנוסף, ניתן לציין כי דגם הוא גרסה מעודנת של דגם שהופקד בעבר. שנה את התווית ושמור את הרשומה.אם תשתף פעולה עם חוקרים אחרים שאין להם גישה ליישום, ייתכן שיהיה עליך ליצור מסמכי סיכום שתוכל לשתף לאחר מכן. למטרה זו, gP2S מספק פונקציונליות של דוח. פעולה זו יוצרת קובץ PDF הניתן להדפסה הכולל את כל המטה-נתונים המתארים את הישות ואת כל ישויות האבות שלה, כולל כל ההערות.תכונה זו היא בעלת ערך מיוחד בעקבות תצהיר המודל, שכן כל הנתונים ומטה-נתונים התחקות אחר השושלת של המודל האטומי הסופי כל הדרך חזרה חלבון ספציפי מולקולה קטנה ליגנד הרבה באמצעות מפגשי מיקרוסקופיה ורשתות זמינים במסמך יחיד. אבל מסמך PDF יכול להיווצר מכל עמוד תצוגה של פרטים. כפי שניתן לראות, gP2S מאפשר לך לעקוב אחר ישויות שונות מובנות היטב וקל לניווט.כפי שהוצג קודם לכן, אימות נתונים בעת רישום ישויות מסוימות תורם למטא-נתונים באיכות גבוהה יותר מכפי שניתן להשיג בגיליונות אלקטרוניים או במחברות קלאסיים. תודה שצפיתם. אנו מקווים וידאו זה יעודד אותך לנסות gP2S כמערכת ניהול מידע מעבדה עבור מעבדת CryoEM שלך.

gp2s-an-information-management-system-for-cryoem-experiments

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

שיטה correlative מיקרוסקופ אלקטרונים אור (קלם) מוחל על התמונה הנוצרות על-ידי וירוס תאיים מבנים באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) בתאים שנבחרו קודם לכן על ידי מיקרוסקופ אור (LM). באימות LM ו- EM משולבים כמו בגישה הדמיה היברידי להשיג תצלום המשולב של וירוס-פונדקאי אינטראקציות.

Correlative אלקטרון מיקרוסקופ אור (קלם) עבור מעקב אחר והדמיה חלבון נגיפי הקשורים מבנים בתאים הקפאה. מרותק למיטה

פרוטוקול זה מתאר טכניקות המשמשות לקביעת יון ערוץ מבנים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הקפאה, כולל מערכת baculovirus שנועדה להביע ביעילות גנים בתאים בתרבית של מינימום מאמץ, רעילות, חלבון החילוץ, טיהור, בדיקת איכות, הכנת הדוגמא רשת ו ההקרנה, כמו גם איסוף נתונים, עיבוד.

הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

כאן, אנו נתאר כיצד להשתמש את הסינון האוטומטי ואת אפשרויות של איסוף נתונים זמינים ב beamlines סינכרוטרון מסוימים. מדענים לשלוח דוגמאות cryocooled סינכרוטרון, ואת המאפיינים עקיפה מוקרנים, ערכות הנתונים נאספים וכוח עיבוד ומתבצע, במידת האפשר, פתרון מבנה — כל זאת ללא התערבות אנושית.

איסוף נתונים מקריסטלים של מקרומולקולות ביולוגיות ואפיון עצמאית לחלוטין

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר את השימוש ב- Spotiton, מערכת רובוטית חדשנית, כדי לספק שתי דוגמאות של עניין על רשת ננו-חוטים עצמית המערבבת לפחות 90 אלפיות השנייה לפני vitrification בקריוגן נוזלי.

הכנת רשת מיקרוסקופית קריו-אלקטרון למחקרים שנפתרו בזמן באמצעות מערכת רובוטית חדשנית, Spotiton

קביעת מבנה של מתחמים מקרומולקולריים באמצעות cryoEM הפכה לשגרה עבור סוגים מסוימים של חלבונים ומתחמים. כאן, צינור זה מסוכם (הכנה לדוגמה, סינון, רכישת נתונים ועיבוד) והקוראים מופנים למשאבים ומשתנים מפורטים נוספים שעשויים להשתנות במקרה של דגימות מאתגרות יותר.

מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית חלקיקית בודדת: מדגם למבנה

מיקרוסקופיה הקפאה-אלקטרונית של חלקיק יחיד דורשת חבילת תוכנה מתאימה וצנרת ידידותית למשתמש לרכישת נתונים אוטומטית בתפוקה גבוהה. כאן, אנו מציגים את היישום של חבילת תוכנה אוטומטית לחלוטין לרכישת תמונות, Latitude-S, וצינור מעשי לאיסוף נתונים של ביומולקולים משוקלים בתנאים במינון נמוך.

ידידותית למשתמש, תפוקה גבוהה ותוכנה אוטומטית לחלוטין לרכישת נתונים עבור מיקרוסקופיה קריו-אלקטרונית של חלקיק יחיד

מפות cryo-EM ברזולוציה גבוהה של מקרומולקולות יכולות להיות מושגות גם על ידי שימוש במיקרוסקופי TEM של 200 קילו-וולט. פרוטוקול זה מציג את שיטות העבודה המומלצות לקביעת יישור אופטיקה מדויק, סכימות איסוף נתונים ובחירת אזורי הדמיה החיוניים כולם לאיסוף מוצלח של מערכי נתונים ברזולוציה גבוהה באמצעות TEM של 200 kV.

איסוף שגרתי של מערכי נתונים cryo-EM ברזולוציה גבוהה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים של 200 KV

S1P מפעיל את ההשפעות הפיזיולוגיות המגוונות שלו באמצעות תת-משפחת קולטני S1P (S1PRs). כאן, צינור מתואר כדי להרחיב על המבנים והתפקוד של S1PRs.

צינור לחקר המבנים ומסלולי האיתות של קולטני ספינגוזין 1-פוספט

הפרוטוקול הנוכחי מתאר סכמה כללית וקלה ליישום לאיסוף נתונים מוטים של חלקיק יחיד בניסויי cryo-EM. הליך כזה שימושי במיוחד לקבלת מפת EM באיכות גבוהה עבור דגימות הסובלות מהטיה אוריינטציה מועדפת עקב היצמדות לממשק אוויר-מים.

איסוף נתוני Cryo-EM של חלקיק יחיד עם הטיית במה באמצעות Leginon

מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים (cryoEM) סינון רב רשתות הוא לעתים קרובות תהליך מייגע הדורש שעות של תשומת לב. פרוטוקול זה מראה כיצד להגדיר אוסף Leginon סטנדרטי ומסך אוטומטי חכם Leginon כדי להפוך תהליך זה לאוטומטי. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על רוב רשתות רדיד אלומיניום חורי cryoEM.

אוטומציית סינון מיקרוסקופיה Cryo-Electron על פני רשתות מרובות באמצעות Smart Leginon

למדו כיצד להשתמש במערכת gP2S לניהול ניסויי CryoEM, כולל רישום דגימות, רשתות, מיקרוסקופיה ומודלים אטומיים. המערכת תומכת בשיתוף פעולה ובאיכות נתונים גבוהה.

gP2S, מערכת ניהול מידע לניסויי CryoEM

גלה סרטונים נוספים