ביצוע מדידות FRET מדויקות ומדויקות באמצעות smfBox קוד פתוח

פרוטוקול זה מאפשר לכל אחד לערוך ניסויי FRET של מולקולה אחת כדי למדוד מרחקים מוחלטים מדויקים בתוך biomolecules באמצעות smfBox, שהוא מכשיר זול, חזק, קוד פתוח. smFRET מאפשר לך להסתכל על מולקולה אחת בכל פעם, ולא על הממוצע מיליארדים רבים של מולקולות, כך שאתה יכול לאפיין את הקונפורמציות השונות שהם מאמצים. היופי בשיטה זו הוא שניתן להשתמש בה כדי לשפוך אור על המבנה והדינמיקה של מערכות ביומולקולריות רבות.

לדוגמה, קיפול חלבונים, אינטראקציות DNA חלבון, ואלוסטריה DNA. לפני תחילת ניתוח, הפעל את מרכז בקרת הלייזר ואשר כי הגל הרציף לסירוגין מצב זרם קבוע נבחר. כוח על שני הלייזרים.

הפעל תוכנת רכישת smOTTER ואשר כי כל מכשיר מוגדר כראוי. כדי ליישר את נתיב הפליטה, מניחים טיפה של שמן טבילה על המטרה ומניחים בזהירות כיסוי נקייה על העדשה האובייקטיבית, מורידים בזווית לשמן כדי למנוע לכידת בועות אוויר בין זכוכית הכיסוי למטרה. לאחר מכן להוסיף 10 microliters של 100 ננומולארי Cy3B צבע למרכז זכוכית הכיסוי.

בלוח מחזורי הלייזר, הגדר את לייזר התורם לאפס, 45 על, ו 55 כבוי. הגדר את לייזר הקבלה ל 50 כבוי, 45 על, וחמש כבוי. הגדר את עירור הלייזר לסירוגין או תקופת ALEX ל- 100 מיקרו-שניות.

פתח את הכרטיסיה מיקוד Z. בלוח הרכישה, החלף את הלייזרים כדי לחיות והפעל את המצלמה. כוונן את החשיפה כך שנקודת אור תופיע מוקפת באופן מרכזי ברקע שחור.

החל ממיקום Z נמוך, הגדל את הגובה עד שנקודת האור תגיע לגודלו המינימלי. לאחר מכן להעלות את הגובה עד 20 מיקרומטר נוספים כדי למקד את הלייזר במדגם מעל השמן לכסות זכוכית. כאשר המדגם מגיע לפוקוס, לעצור את המצלמה.

במרכז הבקרה omicron, להנמיך את כוח הלייזר הירוק תוך ניטור סולם ציר y בכרטיסיית היישור של smOTTER עד הקריאה משני הגלאים הוא ציין, שינוי קנה המידה לפי הצורך. לאחר מכן פתחו את ארבעת הברגים בחלק הקדמי של ה- smfBox כדי להסיר את הלוח הקדמי. כדי ליישר את חור הסיכה, סובב את ידית ה- X במיקום חור הסיכה תוך כדי צפייה באות בכרטיסיית היישור כדי להגדיל את האות בירוק ואדום.

סובבו את ידית ה-Y כדי ליישר את חור הסיכה בכיוון השני, ואז חזרו לכפתור X כדי לבדוק עלייה נוספת באות. כדי ליישר את עדשת חור הסיכה, סובב את ידית X העדשה בכיוון אחד כדי להקטין את האות, ולאחר מכן סובב את ידית ה- Pinhole X באותו כיוון כדי להחזיר את האות לרמה המקורית. אם האות המרבי החדש גבוה מבעבר, המשך להזיז באופן איטרטיבי הן את חור הסיכה והן את ידיות העדשה בכיוון זה.

אם האות נמוך מבעבר, הזז את הידיות בכיוון ההפוך, ולאחר מכן חזור על היישור באמצעות ידיות חור הסיכה והעדשה Y. ליישור עדשת הפוטודיודה של המפולת, החל מפוטודיודה המפולת הירוקה, הזז את ידית X עד שהאות הירוק יהיה בשיאו. חזור על שינוי האות עבור ידית Y.

חזור לידית X, נע קדימה ואחורה כדי למצוא את נקודות הסף שבהן האות מתחיל ליפול. השאר את האות בעמדה באמצע הדרך בין שתי הנקודות האלה. מצא את מיקום אמצע הדרך עבור ידית Y ולחזור על היישור עבור פוטודיודה מפולת אדומה.

לפני ניתוח המדגם הראשון, לנקות את הבמה עם רקמת ניקוי עדשה ספוג מתנול, ניגוב בעדינות על פני המטרה מקצה לקצה ולהחיל שלוש עד ארבע טיפות של שמן טבילה על מרכז המטרה. הוסף 10 מיקרוליטרים מסוג אחד אולטרה-דור מים למרכז זכוכית כיסוי נקייה ונטר את עקבות המים כדי לאשר כי לא נצפו אותות פלואורסצנטיים. לאחר מכן השתמש פינצטה בסוף גומי כדי להסיר בזהירות את הכיסוי ולחדש את שמן טבילה במידת הצורך.

כדי להבטיח קבלת נתונים של מולקולה אחת, לאחר דילול המדגם, בחר ריכוז שבו נצפים פרצים אחד עד חמישה פרצים לשנייה בלוח המעקב החי. כאשר הריכוז המתאים נקבע, לחץ על 8 עד 9 מ"מ מבודדי סיליקון בקוטר 8 מ"מ למרכז זכוכית כיסוי חדשה והוסף בזהירות 10 מיקרוליטרים של מדגם למרכז, תוך הימנעות ממגע עם הסיליקון. מניחים בחוזקה את הכיסוי השנייה על המבודדים עד שנוצר חותם.

בדוק את הסטוצ'יומטריה החיה לעומת היסטוגרמה יעילות FRET כדי לבחון אם המדגם מתנהג כצפוי. בחלונית 'הגדרות שמירה', הזן את המידע עבור השם והפרטים לדוגמה, תוויות התורם והמקבל, המאגר, אורכי הגל של עירור התורם והמקבל, אורכי גל זיהוי וכוח לייזר, שיוך למשתמש הקצה ולמשתמש. בלוח הרכישה, הזן את אורך הניסוי תוך דקות ובחר מרווח שמירה מתאים כדי לצמצם כל אובדן נתונים פוטנציאלי במקרה של שגיאה.

בחר שמור כוחות לייזר במידת הצורך ולאחר מכן לחץ על התחל כדי להתחיל לרכוש את הנתונים. בתוצאה חיובית, בין חמישה לפרץ אחד יושג לשניה. בתוצאה שלילית, יותר מדי או מעט מדי התפרצויות נצפו באותה מסגרת זמן.

לאחר איסוף וניתוח, התוויית ההקצנה צריכה להתאים לתקופת ALEX של ההתקנה הניסיונית. מעקב הזמן משמש להערכה איכותית שריכוז המדגם סביר. התוויית הרקע מציגה את ההתפלגות של תקופות השהיית הבין-פוטון עם התאמה ליניארית לזמנים הארוכים יותר כדי להעריך את קצב הרקע.

ניתן להשתמש במעקב הרקע כדי לזהות אם חלו שינויים במדגם לאורך תקופת הניסוי. היסטוגרמה יעילות SToichiometry לעומת FRET נוצרים, בחירה עבור כל המינים ומינים מתויגים כפליים. היסטוגרמה יעילות FRET 1D נוצר עם התאמת גאוס של הנתונים.

אז הריכוז של המדגם כאן הוא המפתח. אם זה גבוה מדי, אתה לא עושה ניסוי של מולקולה אחת יותר, ואילו אם זה נמוך מדי, זה ייקח יותר מדי זמן כדי לקבל את הנתונים. זה איפשר את קביעת המבנים של ביומולקולים דינמיים, אשר לא ניתן היה לקבוע על ידי שיטות אחרות כמו NMR או קריסטלוגרפיה.