Name: פרוטוקול דיסקציה אוטומטי להעשרת גידולים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: למד פרוטוקול דיסקציה אוטומטי להעשרת אזורי גידול ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה מ-FFPE או רקמות קפואות. השיטה משפרת דיוק ושחזוריות לחילוץ חומצות גרעין וריצוף אקסום שלם.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות לקרמינה אספיריטו ורובין א. טיילור על תמיכתם בפיתוח דיסקציה אוטומטית, כמו גם לצוות המעבדה המרכזית לפתולוגיה של Genentech שתמך בעבודה זו.

לפני תחילת העבודה, השג דגימות רקמות מתאימות על פי פרוטוקולי מועצת הביקורת המוסדית (IRB). כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של Genentech, Inc.
1. הכנת רקמות ושקופיות
<ol><li>בחר בלוקי FFPE או רקמות קפואות טריות והשתמש בשיטת העיבוד המתאימה להלן.</li>
	<li>חותכים מקטעי בלוק רקמה לשקופיות זכוכית טעונות חיובית בעובי הרצוי. חתכו באופן סדרתי את רקמת ה-FFPE בסרטים עם קטע הייחוס הראשון שנחתך בעובי המתאים לצביעת H&E (כלומר, 4 מיקרומטר) ואחריו 1-4 מקטעים בעובי הנע בין 4-20 מיקרומטר בהתאם לצורך וזמינות הרקמה. אספו את חלקי הרקמה לשקופיות מיקרוסקופ זכוכית טעונות חיובית. הערה: יש להכתים באופן מיידי קטעי רקמות ייחוס קפואות טריות עם המטוקסילין ו- Eosin (H&E) באמצעות פרוטוקולים שגרתיים עבור חלקים קפואים והמקטעים הקפואים הלא מוכתמים המוחזקים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד שהם נחוצים לקציר.</li>
	<li>אפשרו לכל מקטעי ה-FFPE להתייבש בטמפרטורת החדר למשך הלילה.</li>
	<li>אופים את שקופיות הייחוס של FFPE בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר מכן מכתימים עם H&E באמצעות פרוטוקולים שגרתיים.</li>
	<li>סרוק את השקופיות המוכתמות H&E על תמונת שקופיות שלמה בהגדלה של פי 20 ומעלה.</li>
	<li>הוסף הערות לתמונות השקופיות הסרוקות עבור אזורי גידול בעלי עניין באמצעות פלטפורמת צפייה שסופקה על ידי ספק או צופה בקוד פתוח. ייצא ביאורים אלה כצילום מסך בהגדלה נמוכה או שמור אותם כקובץ מטה-נתונים המכיל קואורדינטות פיקסל X-Y המתאימות לקודקודים מצולעים. הערה: הראשון פחות מאתגר מבחינה טכנית לעבוד איתו, אך האחרון מציע יתרונות באוטומציה של תהליכים.</li>
	<li>צור מסכות דיגיטליות של אזורי העניין המבוארים בהתאם לגישה שבה נעשה שימוש וייצא את הביאורים הידניים. הערה: אם נעשה שימוש בצילום מסך/תמונה של הביאורים, ניתן להשתמש בתוכנת עיבוד תמונה פשוטה כדי לבחור אזור ולהשלים את הבחירה כולה. שימוש בקואורדינטות X-Y עבור כל ROI דורש שימוש בשפת תכנות כדי לקרוא הן את נתוני התמונה והן את קואורדינטות המצולע כדי ליצור תמונה עם מאג נמוך עם אזורים מלאים של עניין. על המשתמש לעבוד עם ספק כלי הנתיחה האוטומטי כדי ליצור תהליך המבוסס על זמינות התוכנה והצרכים האישיים שלו. אם סריקה, ביאור שקופיות דיגיטלי ו/או יצירת מסיכה דיגיטלית אינם זמינים, ניתן לבצע ביאור זהיר בשקופית באמצעות סמן ולהשתמש בו במקום מסיכה דיגיטלית כתמונת ייחוס. פסאודו-קוד ליצירת מסיכה דיגיטלית סופק בקובץ משלים 1.</li>
</ol>2. כריתת רקמות אוטומטית
<ol><li>מקם את שקופיות רקמת הדגימה הלא מוכתמות על הבמה במיקומי השקופית הראשונה עד הרביעית בעת שימוש בהפניה דיגיטלית לשקופיות. בעת שימוש בביאור בשקופית במקום באפשרות דיגיטלית, מקם את שקופיות הרקמה לדוגמה שאינן מוכתמות על הבמה במיקומי השקופית השנייה עד הרביעית עם שקופית ייחוס במיקום הראשון.</li>
	<li>צור עבודת כרסום באמצעות תוכנת כריתת הרקמות האוטומטית: בחירת עבודה > יצירת מזהה מקרה > עבודה חדשה > > שם עבודת הטחינה; עבור אל עובי > עובי המקטע באמצעות הכרטיסייה חץ למעלה או למטה; לאחר מכן עבור אל הכנת רקמות > paraffinized או Deparaffinized, הפניה תמונה > מקובץ > ייבוא תמונה > קובץ לייבוא מהתפריט הנפתח כהפניה הדיגיטלית, אם רלוונטי. בחר מהבמה עבור הפניה לשקופית על הבמה. לאחר השלמת השדות, סרוק את השלב על-ידי בחירה בלחצן Scan Stage בפינה השמאלית התחתונה כדי ללכוד כל שקופית רקמת דגימה במיקום הראשון עד הרביעי.</li>
	<li>בחר את אזור הרקמה ללכידת תמונה.<ol>
<li>אם אתם משתמשים בהפניה על הבמה, גררו את התיבה מפינה אחת להפך כדי ליצור אזור מלבני מעל הרקמה. בחר את הבועה העגולה מתחת לאזור המלבני כדי לצלם את תמונת הפניה לבמה. אם אתם משתמשים בתמונת ייחוס דיגיטלית, הוסיפו את שכבת-העל של התמונה באזור המלבני שנבחר. שנה את גודל ההפניה הדיגיטלית ויישר אותה בצורה גסה בזום הקורס כדי להתאים בצורה הטובה ביותר לגודל ולמיקום מעל רקמת הדגימה.</li>
		<li>העתק שדה מלבן זה לשקופיות רקמות דגימה שנותרו במיקומי השקופית השנייה עד הרביעית על-ידי בחירת אפשרות ההעתקה בפינה השמאלית העליונה של תמונת ההפניה. יישרו את גודלם ושינו את גודלם באופן גס לפי הצורך. הערה: בעת שימוש בתמונת הפניה בשקופית במקום במסכה דיגיטלית, בחר איזו שקופית על הבמה צריכה לשמש כהפניה.</li>
	</ol></li>
	<li>יישור השקופיות של ההפניה והדוגמאות<ol>
<li>כאשר תמונת ההפניה מיושרת באופן גס בשקופיות דגימת רקמות בכל מיקומי השקופיות, בחר בלחצן Scan Stage בפינה השמאלית התחתונה של המסך כדי לעבור לשלב ההתאמה העדינה. בחר את מיקום השלב הראשון ואת סמל הכלי 'שינוי צורה' (הסמל השלישי למטה בסרגל הכלים הימני) כדי לבצע התאמות יישור וזום עדינות של ההפניה כך שיתאימו בצורה הטובה ביותר לכיסוי השקופית לדוגמה. השתמש בסרגל ההזזה הפניה לדוגמה בתחתית המסך המתחלף בין תמונת ייחוס לתמונה לדוגמה יחד עם התכונה Zoom In ו - Zoom Out כדי להתאים ולהשיג יישור של כל מיקום שקופית. שכפל תהליך זה במיקומי השקופית השנייה עד הרביעית לדוגמה.</li>
	</ol></li>
	<li>בחר את אזור הטחינה של אזור העניין<ol>
<li>לאחר שהושגה שכבת-על אופטימלית של כל אחד מארבעת מיקומי השקופיות, ציירו את הכינויים של נתיב הטחינה באמצעות סמל הכלי 'בורר הצבעים ' (הסמל העשירי למטה בסרגל הכלים הימני) בחלק הצבעוני של תמונת הייחוס במסכה. בחר בתיבה הרחב לדומה אם שקופיות או אזורים מרובים מבוארים לצורך כריתה ולאחר מכן בחר בלחצן קבל ביאור(ים) בפינה הימנית התחתונה כדי לצייר נתיבי כרסום לשקופיות לדוגמה.</li>
		<li>בחר את נתיב הטחינה במיקום השקופית הראשון. הערה: כאשר נתיב הטחינה נבחר במיקום השקופית הראשון, הוא יועתק למיקומי השקופיות הנותרים ויחושב השימוש בקצה הטחינה. השימוש בקצה הטחינה בפינה השמאלית העליונה מחושב על סמך השטח המכוסה וגודל הקצה שנבחר. אם מחושבים יותר מארבע עצות, ניתן לבחור גודל טיפ גדול יותר כדי ללכוד את ההחזר על ההשקעה המבואר. ניתן לבחור או לשנות את גודל העצה בצד שמאל של המסך תחת החץ 'קצה כרסום', והשימוש בקצה יחושב מחדש.</li>
		<li>כאשר מחושב נתיב הטחינה, אסוף את ההחזר על ההשקעה המבואר עם ארבעה טיפים או פחות לכרסום. בחר בלחצן Setup Stage בפינה השמאלית התחתונה של המסך כדי לבקש טעינה מהירה של קצוות כרסום מצינורות איסוף הממוקמים בייעודם הנכון על הבמה.</li>
	</ol></li>
	<li>מלאו את המאגר ב-3.0 מ"ל של מאגר הנתיחה המתאים ביותר לסוג הרקמה (FFPE או קפואה טרייה) וערכת מיצוי חומצות גרעין במורד הזרם, ובחרו בלחצן Dissect בפינה הימנית התחתונה של המסך. השתמש בשמן מינרלי בדרגה מולקולרית או במאגר מתאים מתוך ערכות מיצוי של חומצות גרעין הזמינות באופן מסחרי. הערה: ניתוח אוטומטי של שקופיות ואזורי עניין נבחרים מתחיל לאחר מכן ודגימות נאספות על ידי המכשיר. ראש היחידה יאסוף קצוות כרסום מהחלק האחורי של הבמה וימלא בנוזל דיסקציה מהמאגר. לאחר מכן הטיפים מסתובבים לאורך נתיב הטחינה ושואפים לרקמת דגימה משקופיות עד להשלמתן או מלאה. הדגימה שנאספה עם נוזל דיסקציה מחולקת לאחר מכן לצינורות איסוף הממוקמים בחלק האחורי של הבמה.</li>
	<li>לאחר השלמת הנתיחה האוטומטית, הסר את צינורות האיסוף ואת מגלשות הדגימה המנותקות מהבמה והנח אותן במדף צינורות ובמדף החלקות, בהתאמה. הערה: יש לקחת יבולים קפואים טריים ישירות למיצוי חומצות גרעין בהתאם להוראות היצרן ויש להכתים את החלקים הקפואים הטריים שלאחר הנתיחה לאחר הניתוח באופן מיידי באמצעות פרוטוקולים שגרתיים למקטעים קפואים.</li>
	<li>יש לאפות את שקופיות הרקמה המנותקות בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות ולאחר מכן להכתים ב-H&E באמצעות פרוטוקולים שגרתיים.</li>
	<li>סרוק את הפוסט שנחתך H&E מוכתם בשקופיות על תמונת שקופיות שלמה בהגדלה ו/או ארכיון של פי 20 לקבלת הפניה של הרקמה שלא נאספה ונשארה על השקופית. הערה: ראה שלב 1.5 לעיל לקבלת אפשרויות סריקה חלופיות.</li>
</ol>3. מיצוי חומצות גרעין
<ol><li>בריכה וכדור את הרקמה. בצע את מיצוי חומצות הגרעין באמצעות ערכה זמינה מסחרית ופעל לפי הוראות היצרן.</li>
</ol>

<ol><li>Cho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+recommendations+for+precision+cancer+therapy+using+next+generation+sequencing%3A+a+comprehensive+single+cancer+center%27s+experiences%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Tissue recommendations for precision cancer therapy using next generation sequencing: a comprehensive single cancer center's experiences.</a> Oncotarget. 8 (26), 42478-42486 (2017).</li>
<li>Smits, A. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+estimation+of+tumor+cell+percentage+for+molecular+testing+by+pathologists+is+not+accurate%5BTitle%5D)+AND+%22Modern+Pathology%3A+An+Official+Journal+of+the+United+States+and+Canadian+Academy+of+Pathology%2C+Inc%22%5BJournal%5D)">The estimation of tumor cell percentage for molecular testing by pathologists is not accurate.</a> Modern Pathology: An Official Journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 27 (2), 168-174 (2014).</li>
<li>Poole-Wilson, P. A., Langer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH+on+ionic+exchange+and+function+in+rat+and+rabbit+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effect of pH on ionic exchange and function in rat and rabbit myocardium.</a> The American Journal of Physiology. 229 (3), 570-581 (1975).</li>
<li>Viray, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective%2C+multi-institutional+diagnostic+trial+to+determine+pathologist+accuracy+in+estimation+of+percentage+of+malignant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">A prospective, multi-institutional diagnostic trial to determine pathologist accuracy in estimation of percentage of malignant cells.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 137 (11), 1545-1549 (2013).</li>
<li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+in+Barrett%27s+Esophagus%3A+Laser+capture+versus+whole+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gene Expression in Barrett's Esophagus: Laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).</li>
<li>Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M. E., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contaminating+cells+alter+gene+signatures+in+whole+organ+versus+laser+capture+microdissected+tumors%3A+a+comparison+of+experimental+breast+cancers+and+their+lymph+node+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases.</a> Clinical & Experimental Metastasis. 25 (1), 81-88 (2008).</li>
<li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctions+in+gastric+cancer+gene+expression+signatures+derived+from+laser+capture+microdissection+versus+histologic+macrodissection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genomics%22%5BJournal%5D)">Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection.</a> BMC Medical Genomics. 4, 48(2011).</li>
<li>Klee, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+sample+acquisition+and+linear+amplification+on+gene+expression+profiling+of+lung+adenocarcinoma%3A+laser+capture+micro-dissection+cell-sampling+versus+bulk+tissue-sampling%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genomics%22%5BJournal%5D)">Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling.</a> BMC Medical Genomics. 2, 13(2009).</li>
<li>Civita, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+and+RNA-seq+analysis%3A+High+sensitivity+approaches+to+explain+histopathological+heterogeneity+in+human+glioblastoma+FFPE+archived+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection and RNA-seq analysis: High sensitivity approaches to explain histopathological heterogeneity in human glioblastoma FFPE archived tissues.</a> Frontiers in Oncology. 9, 482(2019).</li>
<li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection.</a> Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).</li>
<li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection%3A+molecular+analysis+of+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278 (5342), 1481-1483 (1997).</li>
<li>Hunt, J. L., Finkelstein, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissection+techniques+for+molecular+testing+in+surgical+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microdissection techniques for molecular testing in surgical pathology.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 128 (12), 1372-1378 (2004).</li>
<li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1, 586-603 (2006).</li>
<li>Grafen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+expression-based+microdissection+of+formalin-fixed+lung+cancer+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%3B+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Optimized expression-based microdissection of formalin-fixed lung cancer tissue.</a> Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 97 (7), 863-872 (2017).</li>
<li>Javey, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((innovative+tumor+tissue+dissection+tool+for+molecular+oncology+diagnostics%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Molecular+Diagnnostics%3A+JMD%22%5BJournal%5D)">innovative tumor tissue dissection tool for molecular oncology diagnostics.</a> The Journal of Molecular Diagnnostics: JMD. (21), 1525-1578 (2021).</li>
<li>Adey, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mill+based+instrument+and+software+system+for+dissecting+slide-mounted+tissue+that+provides+digital+guidance+and+documentation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Clinical+Pathology%22%5BJournal%5D)">A mill based instrument and software system for dissecting slide-mounted tissue that provides digital guidance and documentation.</a> BMC Clinical Pathology. 13 (1), 29(2013).</li>
</ol>

צ'ארלס א' האבנאר, אוליבר זיל, ג'ף איסטהאם, ג'פרי האנג, ג'ניפר גילטנן, ניקולס לונסברי, דניאל אורפר, סרג'אן סטורניו ואיימי א' לו הם עובדים ובעלי מניות של ג'ננטק ורוש ומאנה ג'אבי ועמנואל נאורי הם עובדים ובעלי מניות של רוש.

מוצג כאן פרוטוקול ליישום של ביאור דיגיטלי וכריתה אוטומטית לנתח אזורי גידול מתכולת גידול נמוכה FFPE או רקמות קפואות טריות להעשרת הגידול והשימוש בו ב- WES. שילוב של ביאור דיגיטלי ויצירת מסכה עם דיסקציה אוטומטית מפחית באופן משמעותי את הזמן והמומחיות המעשיים הנדרשים הנפוצים בשיטות קלאסיות של העשרת גידולים, כולל מאקרודיסקציה ידנית ו-LCM. הפרוטוקול מדגים אפשרות העשרת גידולים בעלת פוטנציאל חשוב לטווח בינוני המאפשרת לא רק העשרה נמוכה של תכולת הגידול, אלא גם העשרה במקרים בהם קשה לנתח קיני גידול מבוזרים הרחק מהרקמה הנורמלית של הגי...

ריצוף הדור הבא (NGS) מנוצל יותר ויותר הן לטיפול בחולים והן לחקר הסרטן כדי לסייע בהנחיית טיפולים ובהקלה על גילוי מדעי. רקמה היא לעתים קרובות מוגבלת ודגימות קטנות עם תוכן גידול משתנה משמשים באופן שגרתי. הלימות הגידול ושלמותו, אם כן, נותרו מחסום להשגת נתונים משמעותיים. דגימות עם אחוזי גידול נמוכים יותר עלולות לגרום לקושי להבחין בין וריאנטים אמיתיים לבין ממצאי ריצוף ולעתים קרובות אינן זכאיות ל- NGS1. העשרת גידולים של מקרים בעלי תכולת גידול נמוכה, אלה הנמוכים מ-20%, הוכחה כמסייעת להניב מספיק חומר על מנת לייצר נתוני ריצוף הניתנים לשחזור ולהבטיח שגרסאות בתדר נמוך לא יחמיצו 2,3. עם זאת, המגבלות ישתנו בהתאם לפלטפורמות המשמשות והשימוש המתוכנן בנתונים שנוצרו.
באופן מסורתי, העשרה של אזורי גידול למיצוי מתבצעת על ידי מקרודיסקציה ידנית או מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר (LCM) של שקופיות מוטבעות פרפין קבועות פורמלין (FFPE). מקרו-דיסקציה ידנית, או גירוד אזורי רקמה מוגדרים משקופיות, מאפשרת להסיר אזורי גידול לשימוש בבדיקות במורד הזרם בעלות נמוכה יחסית, אך עם דיוק נמוך ודיוק נמוך 2,4. דיוק טכני מינימלי יכול להיות יעיל מאוד במקרים של תכולת גידול גבוהה יותר בהם קיימים חלקים גדולים של גידול ו/או אובדן רקמות מינימלי אינו משפיע באופן משמעותי על התוצאות, אך מקרים של תכולת גידול נמוכה או מקרים עם גידול מפוזר יותר דורשים דיוק מוגבר. LCM הומצא אפוא בשנות ה-90 של המאה ה-20 והפך לדרך רבת ערך להסיר במדויק אזורים קטנים, מוגדרים ומיקרוסקופיים של רקמה משקופיות פרפין קבוע פורמלין (FFPE) 5,6,7,8. ניתן להשתמש ב-LCM כדי לאסוף אוכלוסיות של תאים בודדים כאשר ההטרוגניות המורכבת של הדגימה קיימת9 ומאפשרת איסוף של אוכלוסיות תאים שבעבר היה קשה להפריד. עם זאת, LCM דורש מכונות יקרות הדורשות מומחיות טכנית נרחבת וזמן מעשי 10,11,12,13,14.
המכשיר המשמש לניתוח אוטומטי של רקמות הוא בעל דיוק בין זה של LCM (~10 מיקרומטר) לבין מקרו-דיסקציות (~1 מ"מ)15. בנוסף, הוא מציג הן דרישות עלות והן דרישות מומחיות טכניות בין זו של מקרודיסקציה ו- LCM ונועד לבצע העשרת רקמות מהירה משקופיות FFPE רציפות כדי להקל על החסרונות של שיטות קודמות15. כריתה אוטומטית באופן זה משתמשת בביאורים דיגיטליים או בשכבות-על של תמונות ייחוס שקופיות על הבמה על גבי שקופיות רקמה לא מוכתמות בחתך סדרתי לצורך ניתוח והעשרה של אזורי עניין. המכשיר משתמש בקצות כרסום להב מסתובב מפלסטיק, צינורות איסוף של 1.5 מ"ל וניתן להשתמש בו עם מספר נוזלים שונים לצורך כריתה כדי לאסוף אזורי עניין לבדיקות במורד הזרם הכוללות מיצוי גרעין וריצוף. קצה הטחינה הפלסטי המסתובבת משתמש במאגרי חבית מזרקים פנימיים וחיצוניים ובוכנה לאיסוף חיץ, ואז טוחן ואוסף רקמות16. קוטר גודל קצה הטחינה המשתנה (250 מיקרומטר, 525 מיקרומטר, 725 מיקרומטר) יכול לאפשר כריתה של אזורי רקמה נפרדים לצורך השוואה, אזורים מולטיפוקליים שניתן לאגד או אזורים קטנים בודדים משקופיות FFPE בודדות או מרובות. ניתן להתאים את עוביי המקטעים המשמשים לקציר על סמך צרכי הניסוי האינדיבידואליים והמשתמשים יכולים להבטיח שאזורי העניין לא התרוקנו על ידי ביצוע H&E נוסף בקטע טורי אחד מיד לאחר הקטע האחרון ששימש לקציר.
כריתה אוטומטית זוהתה כדרך להעשיר את תכולת הגידול במקרים של תכולת גידול נמוכה ובדקנו והרחבנו את הפונקציונליות המיועדת של מכשיר כריתת רקמות אוטומטי, המשווק כיום לשימוש בדגימות קליניות של FFPE בעובי של עד 10 מיקרומטר. העבודה מראה כי ניתן ליישם כריתה אוטומטית הן על FFPE והן על מקטעי רקמות קפואות טריות של בני אדם או בעלי חיים בעובי של עד 20 מיקרומטר למטרות מחקר. הפרוטוקול גם מדגים גישה לביאור דיגיטלי ולאוטומציה של כריתה להעשרת גידולים ברקמות עם תכולת גידול נמוכה ו/או מקרים של גידול מקונן ומפוזר שבו מקרו-דיסקציה משמעותית היא מאתגרת או לא אפשרית ומראה הן איכות והן תפוקה של חומצת גרעין המספיקה ל-NGS. לפיכך, דיסקציה אוטומטית יכולה לספק דיוק ברמה בינונית ותפוקה מוגברת להעשרת גידולים, וניתן ליישם אותה גם כדי להעשיר אזורי עניין אחרים או לשלב אותה עם פלטפורמות אחרות כדי לענות על שאלות מחקריות או קליניות.

<table><tbody><tr><td>Agilent SureSelectXT</td><td>Agilent</td><td>G9611A</td><td></td></tr><tr><td>AVENIO Millisect Fill Station</td><td>Roche</td><td>8106533001</td><td></td></tr><tr><td>AVENIO Millisect Instrument, Base</td><td>Roche</td><td>8106568001</td><td></td></tr><tr><td>AVENIO Millisect Instrument, Head</td><td>Roche</td><td>8106550001</td><td></td></tr><tr><td>AVENIO Millisect Tips Small</td><td>Roche</td><td>8106509001</td><td></td></tr><tr><td>AVENIO Millisect PC</td><td>Roche</td><td>8106495001</td><td></td></tr><tr><td>BioAnalyzer</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 5427R</td><td>Eppendorf</td><td>22620700</td><td>מיקרו-צנטריפוגה</td></tr><tr><td>מאגר דגירה</td><td>Promega</td><td>D920D</td><td></td></tr><tr><td>Leica Autostainer XL</td><td>Leica</td><td>ST5010</td><td>מכתים אוטומטיים</td></tr><tr><td>שמן מינרלי בדרגה מולקולרית</td><td>סיגמא</td><td>M5904-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Promega</td><td>V302B</td><td>מאגר עיכול</td></tr><tr><td>Qiagen AllPrep DNA / RNA מיני ערכת</td><td>Qiagen</td><td>80284</td><td></td></tr><tr><td>RLT Plus מאגר</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus שקופיות מיקרוסקופ טעון חיובית</td><td>Thermo Scientific</td><td>6776214</td><td></td></tr></tbody></table>

פרוטוקול דיסקציה אוטומטי להעשרת גידולים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה

Automated Dissection Protocol for Tumor Enrichment in Low Tumor Content Tissues

העשרת גידולים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה, אלה שמתחת לתכולת הגידול של 20% בהתאם לשיטה, נדרשת כדי להפיק נתונים איכותיים באופן משוחזר עם בדיקות רבות במורד הזרם כגון ריצוף הדור הבא. כריתת רקמות אוטומטית היא מתודולוגיה חדשה שהופכת ומשפרת את העשרת הגידולים ברקמות הנפוצות והנמוכות הללו על ידי הפחתת חוסר הדיוק התלוי במשתמש של ניתוח מאקרו מסורתי ומגבלות זמן, עלות ומומחיות של מיקרו-דיסקציה של לכידת לייזר על-ידי שימוש בשכבת-על של ביאור תמונה דיגיטלי על גבי שקופיות לא מוכתמות. כאן, ביאורים דיגיטליים של המטוקסילין ואאוזין (H&E) משמשים כדי להתמקד באזורי גידול קטנים באמצעות להב בקוטר 250 מיקרומטר2 בפרפין קבוע פורמלין לא מוכתם משובץ (FFPE) או מקטעים קפואים טריים בעובי של עד 20 מיקרומטר להעשרת גידולים אוטומטית לפני מיצוי חומצות גרעין וריצוף אקסום שלם (WES). כריתה אוטומטית יכולה לקצור אזורים מבוארים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה מקטעים בודדים או מרובים למיצוי חומצות גרעין. הוא גם מאפשר לכידה של מדדי איסוף נרחבים לפני ואחרי הקציר תוך שיפור הדיוק, יכולת השכפול והגדלת התפוקה תוך ניצול של פחות שקופיות. הפרוטוקול המתואר מאפשר ביאור דיגיטלי עם דיסקציה אוטומטית על FFPE של בעלי חיים ו/או בני אדם או רקמות קפואות טריות עם תכולת גידול נמוכה ויכול לשמש גם לכל אזור העשרת עניין כדי להגביר את ההלימה ליישומי ריצוף במורד הזרם בתהליכי עבודה קליניים או מחקריים.

נבחרו מקטעי כבד של עכברי FFPE ו-FF המכילים סרטן מעי גס גרורתי בנצרי קסנוגרפט. המקטעים הוכתמו ב-H&amp;E (איור 1A,E,I) ונסרקו על תמונת שקופיות שלמה בהגדלה של פי 20. פתולוג ציין באופן דיגיטלי אזורי גידול מעניינים ומסכה נוצרה באמצעות תוכנה מסחרית ועוצבה כתמונת ייחוס דיגיטלית של png (איור 1B,F,J). שקופיות דגימה לא מוכתמות בעובי 10 מיקרומטר ו-20 מיקרומטר הונחו על הבמה ונתיחה אוטומטית בוצעה כמתואר לעיל. רקמות קפואות טריות נאספו במאגר ל...

ביאור דיגיטלי עם דיסקציה אוטומטית של רקמות מספק גישה חדשנית להעשרת הגידול במקרים של תכולת גידול נמוכה וניתן להתאמה הן לסוגי פרפין והן לסוגי רקמות קפואות. זרימת העבודה המתוארת משפרת את הדיוק, יכולת השכפול והתפוקה וניתן ליישם אותה הן על הגדרות המחקר והן על ההגדרות הקליניות.

Tumor enrichment in low tumor content tissues, those below 20% tumor content depending on the method, is required to generate quality data reproducibly ...

בידוד או העשרה של אזורים קטנים מפוזרים בעלי עניין מ- FFPE, או חומר קפוא טרי, ניתן להשיג עם דיסקציה אוטומטית במהירות וביעילות רבה יותר מאשר בשיטות מסורתיות. מיצוי של חומר גנומי מ-FFPE, או רקמות קפואות טריות, הוא דרישה למעבדות מחקר קליניות ותרגומיות רבות. דיסקציה אוטומטית ממלאת פער משמעותי בין כריתת מאקרו למיקרו דיסקציה של לכידת לייזר.כדי להתחיל, הוסף את הערות השקופיות הסרוקות עבור אזורי הגידול המעניינים, באמצעות פלטפורמת צפייה המסופקת על ידי הספק, או צופה בקוד פתוח. מקם את שקופית רקמת הדגימה הלא מוכתמת על הבמה במיקום השקופית הראשונה עד הרביעית בעת שימוש בהפניה לשקופית דיגיטלית. צור משימת כרסום באמצעות תוכנת ניתוח הרקמות האוטומטית על-ידי פתיחת רשימת משימות, ולאחר מכן בחר צור עבודה חדשה והזן את מזהה המקרה ואת השם כדי להזין את שם המשרה.עבור אל עובי ובחר עובי מקטע באמצעות הכרטיסיה חץ למעלה או למטה. לאחר מכן, עבור אל הכנת רקמות, ובחר Paraffinized, או Deparaffinized. בחר תמונת הפניה "מתוך הקובץ, ויבא תמונה.לאחר מכן, בחר את הקובץ לייבוא מהתפריט הנפתח כהפניה הדיגיטלית. סרוק את השלב על-ידי בחירה בלחצן שלב הסריקה בפינה השמאלית התחתונה כדי ללכוד כל שקופית רקמת דגימה במיקום הראשון עד הרביעי. עבור ההפניה על הבמה, גרור את התיבה כדי ליצור אזור מלבני מעל הרקמה, ובחר את הבועה העגולה מתחת לאזור המלבני כדי לצלם את תמונת הפניה לבמה.העתק שדה מלבן זה לשקופיות רקמות הדגימה הנותרות במיקומי השקופית השנייה עד הרביעית על-ידי בחירה באפשרות ההעתקה בפינה השמאלית העליונה של תמונת ההפניה. לאחר מכן, יישרו את גודלכם ושינו את גודלם לפי הצורך. עבור תמונת ההפניה הדיגיטלית, הוסיפו את שכבת-העל של התמונה באזור המלבני שנבחר.לאחר מכן, שנה את גודל ההפניה הדיגיטלית ויישר אותה בצורה גסה, כמובן, זום, כך שיתאים בצורה הטובה ביותר לגודל ולמיקום מעל רקמת הדגימה. העתק שדה מלבן זה לשקופיות רקמות הדגימה הנותרות במיקומי השקופית השנייה עד הרביעית על-ידי בחירה באפשרות ההעתקה בפינה השמאלית העליונה של תמונת ההפניה. לאחר מכן, יישרו את גודלכם ושינו את גודלם לפי הצורך.בחר בלחצן שלב הסריקה בפינה השמאלית התחתונה כדי לעבור לשלב הכוונון העדין. בחר את מיקום השלב הראשון ואת סמל הכלי 'שינוי צורה' בסרגל הכלים הימני, כדי לבצע התאמות יישור וזום עדינות של ההפניה כך שיתאימו בצורה הטובה ביותר לכיסוי השקופית לדוגמה. השתמש בהפניה לפס הזזה לדוגמה בתחתית המסך, תוך מעבר בין ההפניה לתמונות לדוגמה.בנוסף, תכונת ההגדלה וההגדלה כדי להתאים ולהשיג את היישור של כל מיקום שקופית. לאחר השגת שכבת-העל האופטימלית לדוגמה, צייר את הכינויים של נתיב הטחינה על החלק הצבעוני של תמונת הייחוס במסכה על-ידי בחירת סמל הכלי בורר הצבעים בסרגל הכלים הימני. צייר את נתיבי הטחינה לשקופיות לדוגמה על-ידי בחירה בלחצן קבל ביאורים בפינה השמאלית התחתונה של המסך.ללכוד ולאסוף את אזור העניין המבואר עם ארבעה טיפים כרסומים או פחות כאשר מחושב נתיב הטחינה. השימוש בקצה הטחינה בפינה השמאלית העליונה מחושב על סמך השטח המכוסה, וגודל הקצה שנבחר. ניתן לשנות את גודל הקצה תחת חץ קצה הטחינה, והשימוש בקצה יחושב מחדש.כאשר נתיב הטחינה נבחר במיקום השקופית הראשון, הוא יועתק למיקומי השקופיות הנותרים. בחר בלחצן "שלב ההתקנה" בפינה הימנית התחתונה של המסך לטעינה מהירה של קצות הטחינה מצינורות האיסוף בייעודם הנכון על הבמה. מלאו את המאגר בשלושה מיליליטרים של מאגר דיסקציה מתאים לסוג הרקמה, ולמיצוי חומצות גרעין במורד הזרם.לאחר מכן, בחר בלחצן Dissect" בפינה השמאלית התחתונה של המסך. לאחר הנתיחה האוטומטית, הסר את צינורות האיסוף ואת שקופיות הדגימה המנותקות מהבמה. מקם את צינורות האיסוף במדף הצינורות, ואת המגלשות במדף השקופיות.הפורמלין המוכתם של H&E, הפרפין הקבוע משובץ, ומקטעי כבד עכבר קפואים טריים המכילים סרטן מעי גס גרורתי ב-xenografts נסרקו על גבי מצלמת שקופיות שלמה בהגדלה של פי 20, ושימשו כשקופיות הייחוס. שקופיות הייחוס המוכתמות של H&E הוסתרו והוסוו באופן דיגיטלי לאזורי הגידול לצורך כריתה ומיצוי חומצות גרעין. שקופיות הדגימה שלאחר הניתוח הוכתמו ב-H&E כדי לאשר את אזורי הנתיחה בשקופיות של 10 מיקרומטר ו-20 מיקרומטר.מדדים שנתפסו הדגימו את ההצלחה של הנתיחה האוטומטית ומיצוי חומצות גרעין. כאשר מנסים פרוטוקול זה, יש לזכור כי השגת שכבת-על מדויקת יחסית של ביאור על השקופיות הלא מוכתמות חשובה לבידוד תחומי העניין.

automated-dissection-protocol-for-tumor-enrichment-low-tumor-content

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול בידוד אוכלוסיות מטוהרים מאוד של leukocytes כי החודרים גידולים. פרוטוקול זה הוא עיבוד ביוטק Miltenyi בפרוטוקול כדי לשפר את התשואה וטוהר לבידוד תאים של רקמת הגידול מורכב.

בידוד של תאים חיסוניים של גידולים ראשוניים

פרוטוקול זה מתאר דיסוציאציה לא אנזימטית מהירה של שברי רקמות אנושיות טריות לצורך הערכה איכותית וכמותית של תאי CD45+ (לימפוציטים/לויקוציטים) הקיימים ברקמות אנושיות נורמליות וממאירות שונות. בנוסף, ניתן לאסוף ולאחסן את הסופרנטנט המתקבל מהרקמה הראשונית הומוגנטית לצורך ניתוח או ניסויים נוספים.

פרוטוקול פשוט ומהיר לללא אנזימי רקמות אנושיות טריות לנתק לניתוח להחדרה לימפוציטים

Xenografts הסרטני האנושי הוא vascularized ו הסתננו תאים ממוצא העכבר במהלך שלב צמיחת in vivo. כדי לעקוף את ההטיה הנגרמת על ידי תאי זיהום אלה במהלך ניתוח במורד זרם, פתחנו שיטה המאפשרת דלדול מקיף של כל תאי העכבר על ידי מיון תא מגנטי.

חסך בתאי עכבר מן xenografts גידול האנושי משפר משמעותי ניתוח במורד זרם של תאי יעד

כאן אנו מתארים שיטה כדי להפריד ולהעשיר את מרכיבי microenvironment המערכת החיסונית והחיסון של הגידול גידולים הוקמה תת עורית. טכניקה זו מאפשרת ניתוח נפרד של הגידול לחדור המערכת החיסונית ושברים -החיסון הגידול אשר יכולים להרשות אפיון מקיף של microenvironment מערכת החיסון הגידול.

העשרה ואפיון של Microenvironments המערכת החיסונית והחיסון של הגידול הוקמה גידולים מאתר תת עורית

מאמר זה מתאר שיטה לזהות שינויים של שבטים ושבטים תת-שבטיים בין דגימות שונות ממטופל נתון. למרות שהניסויים המתוארים כאן מתמקדים בסוג גידול מסוים, הגישה ישימה באופן כללי לגידולים מוצקים אחרים.

ניתוח נגעים השוואתית באמצעות גישה ממוקדת רצף

לייזר לחיתוך מיקרו (LMD) היא טכניקה רגישה ומאוד לגילוי שניתן להשתמש בה כדי לחשוף מסלולים כי בתווך glioma טרוגניות ופלישה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ממוטב כדי לבודד אזורים נפרדים מרקמת glioma באמצעות LMD לייזר ואחריו ניתוח טרנססקריפט.

לכידת לייזר מיקרודיסקציה של גלימה Subregions עבור אפיון מרחבית ומולקולרית של טרוגניות Intrאטומוראלי, הנחלים, ופלישה

פרוטוקול זה מציג שיטה להגדלת תכולת הגידול באחוזים של דגימות רקמה משובצות פרפין קבועות פורמלין.

שיפור תכולת הגידול באמצעות מקרו-דיסקציה של הגידול

פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה בתפוקה גבוהה לסגמנטציה מונחית בינה מלאכותית של אזורי עניין שאושרו על-ידי פתולוגיה מתמונות מוכתמות ודקות של מקטעי רקמה להעשרת אוכלוסיות תאים שנפתרו על-ידי היסטולוגיה באמצעות מיקרו-דיסקציה של לייזר. אסטרטגיה זו כוללת אלגוריתם חדשני המאפשר העברת תיחום המציין אוכלוסיות תאים בעלי עניין ישירות למיקרוסקופי לייזר.

מיקרו-דיסקציה מתועשת, מונחית בינה מלאכותית בלייזר לניתוח פרוטאומי בקנה מידה זעיר של המיקרו-סביבה של הגידול

פרוטוקול זה מתאר שיטה להקל על איסוף דגימות מדגימות כריתת ערמונית רדיקלית. המטרה היא למפות, לאפיין ולנתח במיקרו-מאקרו דגימות רקמה מהדגימות על סמך קריטריונים אנטומופתולוגיים לפני אחסונן בביובנק.

שיפור האמינות הביו-בנקאית של גידול הערמונית באמצעות טכניקת דגימה משופרת ואפיון היסטולוגי

הפרוטוקול מספק גישה אמינה ואופטימלית לבידוד גרעינים מדגימות גידולים מוצקים לצורך ריצוף מולטיומי באמצעות פלטפורמת 10x Genomics, כולל המלצות לתנאי דיסוציאציה של רקמות, שימור בהקפאה של תרחיפים חד-תאיים והערכה של גרעינים מבודדים.

בידוד גרעינים אופטימלי מדגימות גידול מוצק טרי וקפוא לריצוף מולטיומי

פרוטוקול זה מציג שיטה מפורטת לבידוד תליות חד-תאיות איכותיות הן מרקמת ריאות עכברית בריאה והן מגידולים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על scRNA-seq, ניתוח ציטומטריית זרימה, ובידוד תאים ראשוניים.

הכנה אופטימלית של רקמת ריאה נושאת גידול עכברוניים שלמים לצורך ציטומטריית זרימה וריצוף RNA חד-תאי

למד פרוטוקול דיסקציה אוטומטי להעשרת אזורי גידול ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה מ-FFPE או רקמות קפואות. השיטה משפרת דיוק ושחזוריות לחילוץ חומצות גרעין וריצוף אקסום שלם.

פרוטוקול דיסקציה אוטומטי להעשרת גידולים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה

גלה סרטונים נוספים