פרוטוקול דיסקציה אוטומטי להעשרת גידולים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה
29 במרץ 2021
ביאור דיגיטלי עם דיסקציה אוטומטית של רקמות מספק גישה חדשנית להעשרת הגידול במקרים של תכולת גידול נמוכה וניתן להתאמה הן לסוגי פרפין והן לסוגי רקמות קפואות. זרימת העבודה המתוארת משפרת את הדיוק, יכולת השכפול והתפוקה וניתן ליישם אותה הן על הגדרות המחקר והן על ההגדרות הקליניות.
בידוד או העשרה של אזורים קטנים מפוזרים בעלי עניין מ- FFPE, או חומר קפוא טרי, ניתן להשיג עם דיסקציה אוטומטית במהירות וביעילות רבה יותר מאשר בשיטות מסורתיות. מיצוי של חומר גנומי מ-FFPE, או רקמות קפואות טריות, הוא דרישה למעבדות מחקר קליניות ותרגומיות רבות. דיסקציה אוטומטית ממלאת פער משמעותי בין כריתת מאקרו למיקרו דיסקציה של לכידת לייזר.
כדי להתחיל, הוסף את הערות השקופיות הסרוקות עבור אזורי הגידול המעניינים, באמצעות פלטפורמת צפייה המסופקת על ידי הספק, או צופה בקוד פתוח. מקם את שקופית רקמת הדגימה הלא מוכתמת על הבמה במיקום השקופית הראשונה עד הרביעית בעת שימוש בהפניה לשקופית דיגיטלית. צור משימת כרסום באמצעות תוכנת ניתוח הרקמות האוטומטית על-ידי פתיחת רשימת משימות, ולאחר מכן בחר צור עבודה חדשה והזן את מזהה המקרה ואת השם כדי להזין את שם המשרה.
עבור אל עובי ובחר עובי מקטע באמצעות הכרטיסיה חץ למעלה או למטה. לאחר מכן, עבור אל הכנת רקמות, ובחר Paraffinized, או Deparaffinized. בחר תמונת הפניה "מתוך הקובץ, ויבא תמונה.
לאחר מכן, בחר את הקובץ לייבוא מהתפריט הנפתח כהפניה הדיגיטלית. סרוק את השלב על-ידי בחירה בלחצן שלב הסריקה בפינה השמאלית התחתונה כדי ללכוד כל שקופית רקמת דגימה במיקום הראשון עד הרביעי. עבור ההפניה על הבמה, גרור את התיבה כדי ליצור אזור מלבני מעל הרקמה, ובחר את הבועה העגולה מתחת לאזור המלבני כדי לצלם את תמונת הפניה לבמה.
העתק שדה מלבן זה לשקופיות רקמות הדגימה הנותרות במיקומי השקופית השנייה עד הרביעית על-ידי בחירה באפשרות ההעתקה בפינה השמאלית העליונה של תמונת ההפניה. לאחר מכן, יישרו את גודלכם ושינו את גודלם לפי הצורך. עבור תמונת ההפניה הדיגיטלית, הוסיפו את שכבת-העל של התמונה באזור המלבני שנבחר.
לאחר מכן, שנה את גודל ההפניה הדיגיטלית ויישר אותה בצורה גסה, כמובן, זום, כך שיתאים בצורה הטובה ביותר לגודל ולמיקום מעל רקמת הדגימה. העתק שדה מלבן זה לשקופיות רקמות הדגימה הנותרות במיקומי השקופית השנייה עד הרביעית על-ידי בחירה באפשרות ההעתקה בפינה השמאלית העליונה של תמונת ההפניה. לאחר מכן, יישרו את גודלכם ושינו את גודלם לפי הצורך.
בחר בלחצן שלב הסריקה בפינה השמאלית התחתונה כדי לעבור לשלב הכוונון העדין. בחר את מיקום השלב הראשון ואת סמל הכלי 'שינוי צורה' בסרגל הכלים הימני, כדי לבצע התאמות יישור וזום עדינות של ההפניה כך שיתאימו בצורה הטובה ביותר לכיסוי השקופית לדוגמה. השתמש בהפניה לפס הזזה לדוגמה בתחתית המסך, תוך מעבר בין ההפניה לתמונות לדוגמה.
בנוסף, תכונת ההגדלה וההגדלה כדי להתאים ולהשיג את היישור של כל מיקום שקופית. לאחר השגת שכבת-העל האופטימלית לדוגמה, צייר את הכינויים של נתיב הטחינה על החלק הצבעוני של תמונת הייחוס במסכה על-ידי בחירת סמל הכלי בורר הצבעים בסרגל הכלים הימני. צייר את נתיבי הטחינה לשקופיות לדוגמה על-ידי בחירה בלחצן קבל ביאורים בפינה השמאלית התחתונה של המסך.
ללכוד ולאסוף את אזור העניין המבואר עם ארבעה טיפים כרסומים או פחות כאשר מחושב נתיב הטחינה. השימוש בקצה הטחינה בפינה השמאלית העליונה מחושב על סמך השטח המכוסה, וגודל הקצה שנבחר. ניתן לשנות את גודל הקצה תחת חץ קצה הטחינה, והשימוש בקצה יחושב מחדש.
כאשר נתיב הטחינה נבחר במיקום השקופית הראשון, הוא יועתק למיקומי השקופיות הנותרים. בחר בלחצן "שלב ההתקנה" בפינה הימנית התחתונה של המסך לטעינה מהירה של קצות הטחינה מצינורות האיסוף בייעודם הנכון על הבמה. מלאו את המאגר בשלושה מיליליטרים של מאגר דיסקציה מתאים לסוג הרקמה, ולמיצוי חומצות גרעין במורד הזרם.
לאחר מכן, בחר בלחצן Dissect" בפינה השמאלית התחתונה של המסך. לאחר הנתיחה האוטומטית, הסר את צינורות האיסוף ואת שקופיות הדגימה המנותקות מהבמה. מקם את צינורות האיסוף במדף הצינורות, ואת המגלשות במדף השקופיות.
הפורמלין המוכתם של H&E, הפרפין הקבוע משובץ, ומקטעי כבד עכבר קפואים טריים המכילים סרטן מעי גס גרורתי ב-xenografts נסרקו על גבי מצלמת שקופיות שלמה בהגדלה של פי 20, ושימשו כשקופיות הייחוס. שקופיות הייחוס המוכתמות של H&E הוסתרו והוסוו באופן דיגיטלי לאזורי הגידול לצורך כריתה ומיצוי חומצות גרעין. שקופיות הדגימה שלאחר הניתוח הוכתמו ב-H&E כדי לאשר את אזורי הנתיחה בשקופיות של 10 מיקרומטר ו-20 מיקרומטר.
מדדים שנתפסו הדגימו את ההצלחה של הנתיחה האוטומטית ומיצוי חומצות גרעין. כאשר מנסים פרוטוקול זה, יש לזכור כי השגת שכבת-על מדויקת יחסית של ביאור על השקופיות הלא מוכתמות חשובה לבידוד תחומי העניין.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לדיסקציה אוטומטית של רקמות להעשרת אזורי גידול מרקמות בעלות תכולת גידול נמוכה, במטרה להקל על הפקת חומצות גרעין באיכות גבוהה ליישומים המשכיים כגון ריצוף של כל האקסום (whole exome sequencing). השיטה מנצלת שכבות של התחמות דיגיטליות על גבי שקופיות לא צבועות, ובכך משפרת את הדיוק, השחזוריות והתפוקה בהשוואה לדיסקציה מקרוסקופית מסורתית ולמיקרודיסקציה באמצעות לכידה בלייזר (laser capture microdissection).
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- פתולוגיה מולקולרית
- טכנולוגיית דיסקציה של רקמות
- ניתוח גנומי
רקע
- רקמות עם תכולת גידול נמוכה (<20% גידול) מניבות לעיתים קרובות חומר שאינו מספיק לבדיקות המשך מהימנות.
- מאקרו-דיסקציה (macro-dissection) מסורתית תלויה במבצע והיא אינה מדויקת, בעוד שמיקרו-דיסקציה באמצעות לכידה בלייזר (laser capture microdissection) גוזלת זמן ויקרה.
- דיסקציה אוטומטית של רקמות מציעה פתרון המשלב סימון דיגיטלי עם כרסום אוטומטי ומדויק.
- העשרה מדויקת של אזורי גידול היא קריטית עבור זרימות עבודה של ריצוף קליני ומחקרי.
מטרת המחקר
- להדגמת פרוטוקול להעשרה אוטומטית של אזורי גידול ברקמות FFPE או רקמות קפואות טריות.
- לשיפור היעילות והשחזוריות של חיתוך רקמות לצורך מיצוי חומצות גרעיניות.
- לאפשר הפקה של נתונים באיכות גבוהה מדגימות עם תכולת גידול נמוכה עבור יישומי רצף.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- סימון דיגיטלי (annotation) של אזורי גידול על גבי שקופיות ייחוס סרוקות שצבעו ב-H&E, באמצעות תוכנה ייעודית או תוכנה בקוד פתוח.
- החלה של הסימונים הדיגיטליים על גבי שקופיות רקמה ללא צבע לצורך מיקוד מדויק.
- שאיפה אוטומטית (milling) של האזורים המסומנים באמצעות להב בקוטר 250 µm2 בחתכים של FFPE או רקמה קפואה טרייה בעובי של עד 20 µm.
- איסוף הרקמה המבודדת לצורך הפקת חומצות גרעין וביצוע רצף גנום מלא של האקסומים (whole exome sequencing) בהמשך.
תוצאות עיקריות
- ניתוח אוטומטי מבודד ביעילות אזורי גידול קטנים ומפוזרים מרקמות בעלות תכולת גידול נמוכה.
- צביעת H&E לאחר הניתוח מאשרת הסרה מדויקת של האזורים שסומנו.
- מדדי איסוף מעידים על העשרה מוצלחת ומיצוי של חומצות גרעיניות.
- הפרוטוקול מגביר את התפוקה ומפחית את השימוש בשקופיות בהשוואה לשיטות ידניות.
מסקנות
- ניתוח רקמה אוטומטי משפר את הדיוק וההדירות בהעשרת גידולים מדגמיות בעלות תוכן נמוך.
- השיטה מגשרת על הפער בין מקרו-דיסקציה (macro-dissection) לבין מיקרו-דיסקציה באמצעות לייזר (laser capture microdissection).
- היא מתאימה הן ליישומים קליניים והן למחקר הדורשים חומצות גרעין באיכות גבוהה לצורך ריצוף.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה עבור מנהלים
ניתוח אוטומטי להעשרת גידולים ברקמות בעלות תכולת גידול נמוכה נותן מענה לצוואר בקבוק קריטי ביצירת חומצות גרעין באיכות גבוהה עבור בדיקות גנומיות המשך. על ידי הפחתת השונות התלויה במשתמש והגדלת התפוקה, פרוטוקול זה משפר את הביטחון החזוי ואת ההדירות בממשק שבין מחקר גילוי למחקר תרגומי. שילובו תומך בקבלת החלטות מותאמת סיכונים ובקידום פורטפוליו בצינורות מו"פ הממוקדים באונקולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בידוד מדויק של אזורי גידול, ובכך תומך בתיקוף יעיל של המטרה בדגימות רקמה הטרוגניות.
- מפחית עמימות ביולוגית על ידי שיפור טוהר חומר הכניסה לניתוחים מולקולריים.
- מקל על בדיקת השערות בביטחון על ידי מזעור זיהום מרקמות שאינן גידול.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מכין דגימות מועשרות המתאימות לבדיקות סטנדרטיות המשך, כגון רצף דור הבא (next generation sequencing).
- משפר את הדירות הבדיקה על ידי אוטומציה של שלבי בחירת הרקמה והניתוח.
- תומך בזרימות עבודה ניתנות להרחבה על ידי הגדלת התפוקה והפחתת השימוש בשקפיות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את הכנת הדגימה לדרישות של גילוי ותיקוף של סמנים ביולוגיים (biomarkers) תרגומיים.
- מבטיחה רציפות משלב רכישת הרקמה ועד להפקת נתונים גנומיים במודלים פרה-קליניים.
- מפחיתה סיכונים במחקרים תרגומיים על ידי אספקת חומרי מוצא של חומצות גרעין באיכות גבוהה, המועשרים בתאים גידוליים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול נתיחה אוטומטי זה מותאם לשלב שבין השגת הרקמה לבין מיצוי חומצות גרעיניות, ומאפשר הכנה אמינה של דגימות עבור רצף ופרופיילינג מולקולרי, הן בזרימות עבודה של גילוי והן בזרימות עבודה תרגומית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך במחקרים מונחי-השערה על ידי מתן אפשרות לבידוד מדויק של אזורי עניין מרקמות מורכבות.
- סריקה: מספק העשרה כמותית הניתנת לשחזור ומתאימה לבדיקות ריצוף בספיקות גבוהות.
- אנליטיקה: מספק מדדי איסוף ואישור לאחר הקצירה כדי לתקף את איכות הדגימה ואת הצלחת ההעשרה.
- מחקר תרגומי: מגשר בין עיבוד דגימות פרה-קליני וקליני באמצעות שיטות העשרה סטנדרטיות וניתנות להרחבה.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע יכולת בלתי תלויה בפלטפורמה, הניתנת להתאמה לסוגי רקמות שונים ולשאלות מחקר מגוונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בניתוחים מולקולריים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של העשרה של רקמות, המשפרת את השחזוריות ואת התפוקה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי המשך התהליך (go/no-go) על ידי הבטחת קלט באיכות גבוהה לבדיקות המשך.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים על ידי הפחתת שונות הקשורה לדגימות במחקרים גנומיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות באנוטציה של פתולוגיה דיגיטלית ובהפעלה של תוכנה לדיסקציה אוטומטית.
- נדרשת גישה למיכשור תואם של דימות, אנוטציה וכרסום (milling).
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרמטרי האנוטציה והדיסקציה לצורך הדירות (reproducibility).
- ניתן להתאמה לרקמות FFPE וכן לרקמות קפואות טריות ממקורות בעליים או אנושיים.
- תלוי בהנחה ומיישור מדויקים של האנוטציות הדיגיטליות להשגת העשרה אופטימלית.
