Name: 15 (15) N פיזור הרפיה CPMG לחקירת דינמיקה קונפורמטיבית חלבון על ציר הזמן μs-ms (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: חקור דינמיקה קונפורמטיבית של חלבונים באמצעות NMR פיזור הרפיה CPMG. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח קינטי ותרמודינמי מקיף של שיווי משקל קונפורמציונלי ברזולוציה אטומית ללא הכנת דגימה מיוחדת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי כספים מ NIGMS R35GM133488 ומ קרן הצדקה רוי ג'יי קרבר לV.V.

1. הכנת מדגם NMR
<ol><li>לבטא ולטהר 2H,15N-labled מדגם של החלבון של עניין. הערה: בעוד שמדגם חלבון בעל תווית N 15יכול לשמש לרכישת ניסוי CPMG RD, התייבשות (במידת האפשר) מגדילה באופן דרמטי את איכות הנתונים המתקבלים. פרוטוקולים לייצור חלבונים מיובשים זמינים בספרות13.</li>
	<li>חוצץ להחליף את דגימת החלבון המטוהר לתוך מאגר NMR degassed.</li>
	<li>העבר את דגימת NMR לתוך צינור NMR. הערה: יש למטב בזהירות את הריכוז של דגימת NMR על מנת למקסם את יחס האות לרעש ולמזער את התרחשותן של אינטראקציות חלבון-חלבון. באופן כללי, טווח הריכוז האופייני לניסויי CPMG הוא 0.1-1.0 מ"מ.</li>
</ol>2. הגדרה ראשונה של ניסוי NMR
<ol><li>הורד ובטל את ההסתעפות של הקבצים המשלימים.</li>
	<li>העתק את הקבצים bits.vv ו- trosy_15N_cpmg.vv (הממוקמים בתיקיה בשם pulseprogram) לספריית תוכניות הדופק (&lt;פת&gt;/exp/stan/nmr/רשימות/עמ'/משתמש). הערה: ודא שהנתיב ל- bits.vv המפורט בשורה הראשונה של הקובץ trosy_15N_cpmg.vv נכון.</li>
	<li>פתח תוכנת רכישה והעתק ניסוי H-15N HSQC שנערך בעבר לניסוי חדש באמצעות הפקודה edc.</li>
	<li>באמצעות pulprogהפקודה , לטעון את תוכנית הדופק trosy_15N_cpmg.vv לתוך הניסוי החדש שנוצר.</li>
	<li>הגדר את ניסוי CPMG באמצעות ההוראות שסופקו בסוף קובץ תוכנית הדופק (trosy_15N_cpmg.vv).</li>
</ol>3. הקמה שגרתית של ניסוי NMR
<ol><li>הציגו את המדגם במגנט ובצעו את כל השלבים הבסיסיים לרכישת כל ניסוי NMR: נעלו ושימו את הדגימה; להתאים ולכוונן את 1H ו 15N ערוצים.</li>
	<li>הגדר p1 ו p7 למשך של 1H ו 15N קשה 90° פולסים, בהתאמה. הערה: לקבלת תוצאות מיטביות, חשוב לכייל את הדופק של 15N 90° בזהירות רבה. כיול מושגת בדרך כלל באמצעות מדגם 100 מ"מ של 15אוריאה N-labeled ב DMSO כמתואר במדריך ספקטרומטר. בנוסף, ניתן לבדוק שוב את הכיול ישירות על דגימת NMR העובדת על ידי רכישת ההפרש הקבוע הראשון של ספקטרום H-15N HSQC שבו הדופק של 15N 90° של בלוק INEPT הראשון עובר לפולס של 180°. אם הכיול נכון, יש להשיג Null.</li>
	<li>בחלון הרכישה, הגדר את הרוחב המרכזי והספקטרלי עבור הממדים 1H ו- 15N. הערה: מרכז את הספקטרום 1H בתדר של אות המים לדיכוי מים אופטימלי.</li>
	<li>הגדר את השהיית הרפיה (d30) שווה 0.7 T2, שבו T2 הוא צפוי 15N זמן הרפיה רוחבי של החלבון שלך. הערה: ניתן למטב את הערך של d30 באופן אמפירי כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר.</li>
	<li>השתמש ברשימת vclist של הפקודות כדי ליצור רשימה של מספרים שלמים התואמים לפרמטר n באיור 1A ובאיור 1B. ודא שכל ערך ברשימה מתאים לשדה CPMG אחר (νcpmg)בהתאם ל- νcpmg = 4 x n / d30. ודא שהמספר הראשון ברשימה הוא 0 (פעולה זו תואמת לניסוי ההפניה שעבורו מדלגים על בלוק CPMG ו- d30 = 0 s) ולא להשתמש במספרים הגדולים מ- 1,000 x d30 / 4. מספרים הגדולים מסף זה גורמים ל- νcpmg &gt; 1 kHz ועלולים לגרום נזק לבדיקה.</li>
	<li>הגדר את l8 למספר הערכים ברשימת ה- vclist, l3 למספר הנקודות הממשיות עבור הממד העקיף (בדרך כלל טווח של 64-200 מוגדר עבור l3) ו- 1 td שווה ל- l8 x l3 x 2. הערה: בצע את השלבים 3.7-3.11 כדי למטב את דיכוי המים.</li>
	<li>הגדר את רווח המקלט (rg) ל- 1; פתח את קובץ תוכנית הדופק (edcpul), עבור לקו 91, הסר את הנקודה-פסיק שלפני goto 999ושמור את הקובץ.</li>
	<li>באמצעות הפקודה gs להתאים את הפרמטרים spdb0 (או spdw0) על מנת למזער את עוצמת אות FID.</li>
	<li>הצג מחדש את הנקודה-פסיק בשורה 91 של קובץ תוכנית הדופק ושמור את הקובץ.</li>
	<li>חזור על השלבים 3.7-3.9 כדי לייעל spdb11 (שורה 168 של קובץ תוכנית הדופק), spdb2 (שורה 179 של קובץ תוכנית הדופק), ו pldb2 (שורה 184 של קובץ תוכנית הדופק).</li>
	<li>הפעל את הפקודה rga כדי למטב את רווח המקלט.</li>
	<li>הגדר את מספר הסריקות (ns)לכפולה של 8.</li>
	<li>הפעל את הפקודה zg כדי להתחיל בניסוי.</li>
</ol>4. עיבוד וניתוח של נתוני NMR
<ol><li>העתק את התיקיה בשם Process (קבצים משלימים) לספריה המכילה את קובץ ser.</li>
	<li>השתמש בקבצים sep_fid.com ft2D.com כדי לעבד את נתוני NMR. הערה: הוראה כיצד לערוך את קבצי ה- Script לעיבוד מסופקת בתוך קבצי sep_fid.com והקבצים ft2D.com.</li>
	<li>פתח את קבצי ucsf הכלולים בספריה CPMG_Sparky_files בספרקי. הערה: קבצי ucsf נוצרים על-ידי קבצי ה- Script של העיבוד. יש קובץ ucsf אחד עבור כל ערך ברשימת ה- vclist. קובץ ה- ucsf הראשון (test_1.ucsf) מכיל את ניסוי הייחוס. קבצי ucsf הבאים (test_2.ucsf, test_3.ucsf,... test_n.ucsf) מסודרים מהנמוך ביותר לערך הגדול ביותר של νcpmg.</li>
	<li>בחר את הפסגות הצולבות של NMR בספקטרום NMR הייחוס (test_1.ucsf).</li>
	<li>בחר את כל הפסגות הצולבות שנבחרו באמצעות הרשותלפקודה Sparky .</li>
	<li>הפעל את הפקודהספרקי rh . פקודה זו פותחת חלון דו-שיח. בחר את גובה האפשרויות באותו מיקום בכל ספקטרום. לחץ על ההתקנה ובדוק את כל ספקטרום NMR. לחץ על עדכן ושמור את קובץ הפלט בספריית העבודה. קובץ הפלט מכיל את המטריצה של עוצמות האות מעל כל ספקטרום NMR שנפתח. הערה: פרוטוקולים מדויקים יותר המשתמשים התאמת lineshape לשחזור עוצמות מניסויים פסאודו-3D שזורים תוארו בספרות14. תוכנה זמינה בחופשיות להתאמת lineshape זמינה https://pint-nmr.github.io/PINT/ (PINT), https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/fuda/ (FUDA), ובתוך NMRPipe (מודול nLinLS) ו SPARKY (מודול זה).</li>
	<li>עבור כל שדה CPMG, המר את עוצמת האותות לקצבי R2 באמצעות הנוסחה <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq03.jpg"> , כאשר I0 ו- Id30 הם עוצמת ההפניה (vc = 0) וספקטרום NMR רגוע (vc &gt; 0), בהתאמה. הערה: בקבצים המשלימים, מסופקת תבנית של קובץ הגיליון האלקטרוני (R2_calc.xls) המשמש להמרת עוצמת האותות לתעריפי R2 ולהמחיש את פרופילי המו"פ.</li>
	<li>קרא את רמת הרעש בספקטרום ההפניות באמצעות הפקודה Sparky st והפץ את השגיאה בשיעורי R2. הערה: בקבצים המשלימים, מסופקת תבנית של קובץ הגיליון האלקטרוני (R2_calc.xls) המשמש להפצת השגיאה בשיעורי R2 הנמדדים.</li>
</ol>5. התאמת עקומות RD
<ol><li>העתק את התיקיה בשם RD_fitting (קבצים משלימים) לספריית העבודה.</li>
	<li>עבור כל שיא NMR שהוקצה, להעריך Rex על ידי חישוב <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq04.jpg"> . <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq05.jpg"> <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq06.jpg"> 
</li>
	<li>בדוק באופן חזותי את עקומות המו"פ עם Rex גדול מפי שניים מהשגיאה המשוערת והשליך את כל עקומות המו"פ הרועשים מכדי שניתן יהיה לדגמן במדויק. הערה: רעש על Rex ניתן להפיץ מן השגיאות על <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq05.jpg"> ו <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq06.jpg"> .</li>
	<li>הכן קובץ קלט עבור קובץ ה- Script המתאים באמצעות כל עקומות המו"פ עם Rex הגדול מפי שניים מהשגיאה המשוערת. הערה: הוראה מפורטת על הכנת קבצי הקלט מסופקים בתוך הסקריפטים המתאימים. קבצי קלט לדוגמה מסופקים כקבצים משלימים. בדרך כלל, נתוני המו"פ נמדדים בשני שדות סטטיים שונים ומותאמים בו-זמנית. בפרוטוקול זה נדרשים שני קבצי קלט שונים (קבצים משלימים).</li>
	<li>התאם את נתוני ה- RD באמצעות קבצי ה- Script הכלולים בקבצים משלימים. הערה: שני סקריפטים שונים מסופקים לביצוע התאמה מבוססת שאריות או התאמה גלובלית של עקומות המו"פ, בהתאמה. שני התסריטים מתאימים לעקומות ה-RD באמצעות מודל חילופי שני אתרים ומשוואת קארבר-ריצ'רדס. הוראות מפורטות יותר ניתנות בתוך הסקריפטים המתאימים. חבילות תוכנה נוספות כגון Chemex (https://github.com/gbouvignies/ChemEx) ו- CATIA (https://www.ucl.ac.uk/hansen-lab/catia/) זמינות לביצוע התאמת נתונים באמצעות משוואות בלוק-מקונל.</li>
	<li>בדוק את המהימנות של הפרמטרים המותאמים להערכת χהמופחת 2 כפונקציה של pb ו- kex. הערה: χהמופחת 2 מסופק בקובץ הפלט. pb ו- kex ניתן לרסן לערכים ספציפיים באמצעות הגבולות התחתונים והעליון בהליכי ההתאמה. בתסריטים שלנו, הגבולות התחתונים והעליון עבור pb הם lb(2) ו- ub(2), בהתאמה. הגבולות התחתונים והעליון עבור kex הם lb(3) ו- ub(3), בהתאמה.</li>
	<li>הערכת השגיאה בפרמטרים המותאמים. ניתן לעשות זאת על ידי הגדרת הערך של MC_fac בקובץ ה- Script ל- 1 וחזרה על ההתאמה מספר פעמים (בדרך כלל &gt;20 חוזר). השגיאה בכל פרמטר מוערכת כסטיית התקן של ההתפלגות. הערה: הגדרת MC_fac ל- 1 יוצרת ערכת נתונים סינתטית שבה שגיאה מבוזרת של גאוסיאני (המחושבת בהתבסס על השגיאה הניסיונית) מתווספת לנתונים הניסיוניים.</li>
</ol>

<ol><li>Anthis, N. J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+transient+dark+states+by+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Visualizing transient dark states by NMR spectroscopy.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (1), 35-116 (2015).</li>
<li>Lisi, G. P., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solution+NMR+spectroscopy+for+the+study+of+enzyme+allostery%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Solution NMR spectroscopy for the study of enzyme allostery.</a> Chemical Reviews. 116 (11), 6323-6369 (2016).</li>
<li>Mittermaier, A., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+provide+new+insights+in+NMR+studies+of+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">New tools provide new insights in NMR studies of protein dynamics.</a> Science. 312 (5771), 224-228 (2006).</li>
<li>Venditti, V., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+selection+and+substrate+binding+regulate+the+monomer%2Fdimer+equilibrium+of+the+C-terminal+domain+of+Escherichia+coli+enzyme+I%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Conformational selection and substrate binding regulate the monomer/dimer equilibrium of the C-terminal domain of Escherichia coli enzyme I.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26989-26998 (2012).</li>
<li>Venditti, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+interdomain+rearrangement+triggered+by+suppression+of+micro-+to+millisecond+dynamics+in+bacterial+Enzyme+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Large interdomain rearrangement triggered by suppression of micro- to millisecond dynamics in bacterial Enzyme I.</a> Nature Communications. 6, 5960(2015).</li>
<li>Yip, G. N., Zuiderweg, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phase+cycle+scheme+that+significantly+suppresses+offset-dependent+artifacts+in+the+R2-CPMG+15N+relaxation+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">A phase cycle scheme that significantly suppresses offset-dependent artifacts in the R2-CPMG 15N relaxation experiment.</a> Journal of Magnetic Resonance. 171 (1), 25-36 (2004).</li>
<li>Mulder, F. A., Skrynnikov, N. R., Hon, B., Dahlquist, F. W., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+slow+%28micros-ms%29+time+scale+dynamics+in+protein+side+chains+by+%2815%29N+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy%3A+application+to+Asn+and+Gln+residues+in+a+cavity+mutant+of+T4+lysozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Measurement of slow (micros-ms) time scale dynamics in protein side chains by (15)N relaxation dispersion NMR spectroscopy: application to Asn and Gln residues in a cavity mutant of T4 lysozyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (5), 967-975 (2001).</li>
<li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+TROSY+CPMG+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+in+large+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">A TROSY CPMG sequence for characterizing chemical exchange in large proteins.</a> Journal of Biomolecular NMR. 15 (2), 151-155 (1999).</li>
<li>Dotas, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+thermophilic%2Fmesophilic+enzymes+reveal+a+role+for+conformational+disorder+in+regulation+of+bacterial+Enzyme+I%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hybrid thermophilic/mesophilic enzymes reveal a role for conformational disorder in regulation of bacterial Enzyme I.</a> Journal of Molecular Biology. 432 (16), 4481-4498 (2020).</li>
<li>Purslow, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+site+breathing+of+human+Alkbh5+revealed+by+solution+NMR+and+accelerated+molecular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Active site breathing of human Alkbh5 revealed by solution NMR and accelerated molecular dynamics.</a> Biophysical Journal. 115, 1895-1905 (2018).</li>
<li>Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. 3rd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+relaxation-compensated+Carr%E2%88%92Purcell%E2%88%92Meiboom%E2%88%92Gill+sequence+for+characterizing+chemical+exchange+by+NMR+Spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR Spectroscopy.</a> Journal of the American Chemical Society. 121 (10), 2331-2332 (1999).</li>
<li>Hansen, D. F., Vallurupalli, P., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+15N+relaxation+dispersion+experiment+for+the+measurement+of+millisecond+time-scale+dynamics+in+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physical+Chemistry+B%22%5BJournal%5D)">An improved 15N relaxation dispersion experiment for the measurement of millisecond time-scale dynamics in proteins.</a> Journal of Physical Chemistry B. 112 (19), 5898-5904 (2008).</li>
<li>Tugarinov, V., Kanelis, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotope+labeling+strategies+for+the+study+of+high-molecular-weight+proteins+by+solution+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isotope labeling strategies for the study of high-molecular-weight proteins by solution NMR spectroscopy.</a> Nature Protocols. 1 (2), 749-754 (2006).</li>
<li>Niklasson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+NMR+data+using+advanced+line+shape+fitting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of NMR data using advanced line shape fitting.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 93-99 (2017).</li>
<li>Palmer, A. G. 3rd, Kroenke, C. D., Loria, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+magnetic+resonance+methods+for+quantifying+microsecond-to-millisecond+motions+in+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Nuclear magnetic resonance methods for quantifying microsecond-to-millisecond motions in biological macromolecules.</a> Methods in Enzymology. 339, 204-238 (2001).</li>
<li>Tollinger, M., Skrynnikov, N. R., Mulder, F. A., Forman-Kay, J. D., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+dynamics+in+folded+and+unfolded+states+of+an+SH3+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Slow dynamics in folded and unfolded states of an SH3 domain.</a> Journal of the American Chemical Society. 123, 11341-11352 (2001).</li>
<li>Carver, J. P., Richards, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+two-site+solution+for+the+chemical+exchange+produced+dependence+of+T2+upon+the+Carr-Purcell+pulse+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">A general two-site solution for the chemical exchange produced dependence of T2 upon the Carr-Purcell pulse separation.</a> Journal of Magnetic Resonance. 6 (1), 89-105 (1972).</li>
<li>Egner, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+Contrast%27+NMR+Reveals+Non-innocent+Role+of+Support+in+Pd%2FCeO2+Catalyzed+Phenol+Hydrogenation%5BTitle%5D)+AND+%22ChemCatChem%22%5BJournal%5D)">Surface Contrast' NMR Reveals Non-innocent Role of Support in Pd/CeO2 Catalyzed Phenol Hydrogenation.</a> ChemCatChem. 12 (6), 4160-4166 (2020).</li>
<li>Egner, T. K., Naik, P., Nelson, N. C., Slowing, I. I., Venditti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+Insight+into+Nanoparticle+Surface+Adsorption+by+Solution+NMR+Spectroscopy+in+an+Aqueous+Gel%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Edition+in+English%29%22%5BJournal%5D)">Mechanistic Insight into Nanoparticle Surface Adsorption by Solution NMR Spectroscopy in an Aqueous Gel.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 56, 9802-9806 (2017).</li>
<li>Tugarinov, V., Libich, D. S., Meyer, V., Roche, J., Clore, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+energetics+of+a+three-state+protein+folding+system+probed+by+high-pressure+relaxation+dispersion+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+%28International+Edition+in+English%29%22%5BJournal%5D)">The energetics of a three-state protein folding system probed by high-pressure relaxation dispersion NMR spectroscopy.</a> Angewandte Chemie (International Edition in English). 54, 11157-11161 (2015).</li>
<li>Korzhnev, D. M., Kloiber, K., Kanelis, V., Tugarinov, V., Kay, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+slow+dynamics+in+high+molecular+weight+proteins+by+methyl-TROSY+NMR+spectroscopy%3A+application+to+a+723-residue+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Probing slow dynamics in high molecular weight proteins by methyl-TROSY NMR spectroscopy: application to a 723-residue enzyme.</a> Journal of the American Chemical Society. 126 (12), 3964-3973 (2004).</li>
<li>Mayzel, M., Ahlner, A., Lundstrom, P., Orekhov, V. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+backbone+%2813%29CO+and+%2815%29N+relaxation+dispersion+at+high+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein backbone (13)CO and (15)N relaxation dispersion at high resolution.</a> Journal of Biomolecular NMR. 69, 1-12 (2017).</li>
<li>Pritchard, R. B., Hansen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterising+side+chains+in+large+proteins+by+protonless+%2813%29C-detected+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterising side chains in large proteins by protonless (13)C-detected NMR spectroscopy.</a> Nature Communications. 10, 1747(2019).</li>
</ol>

כל הסופרים קראו ואישרו את כתב היד. אנחנו לא מצהירים על ניגודי אינטרסים.

כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול המיושם במעבדה לרכישה וניתוח של 15נתוני N RD על חלבונים. בפרט, השלבים הקריטיים להכנת מדגם NMR, מדידת נתוני NMR וניתוח פרופילי המו"פ מכוסים. להלן כמה היבטים חשובים לגבי רכישה וניתוח של ניסויי מו"פ נדונים. עם זאת, לתיאור מעמיק יותר של הניסוי וניתוח הנתונים, מומלץ מאוד ללמוד את הספרות המקורית3,8,11,15,16.
<p class="jove_c...

Carr-פרסל Meiboom-Gill (CPMG) הרפיה פיזור (RD) ניסויים משמשים על בסיס שגרתי לאפיון שיווי משקל קונפורמי המתרחשים על ציר הזמן μs-ms על ידי פתרון ספקטרוסקופיה NMR1,2,3,4,5. בהשוואה לשיטות אחרות לחקירת דינמיקה קונפורמטיבית, טכניקות CPMG קלות יחסית ליישום בספקטרומטרים מודרניים של NMR, אינן דורשות שלבי הכנה מיוחדים לדוגמה (כלומר, התגבשות, הקפאה או יישור מדגם, ו/או הטיה קוולנטית עם תג פלואורסצנטי או פרמגנטי), ומספקות אפיון מקיף של שיווי משקל קונפורמי המחזיר מידע מבני, קינטי ותרמודינמי על תהליכי החלפה. על מנת שניסוי CPMG ידווח על שיווי משקל קונפורמי, יש להחיל שני תנאים: (i) ספינים NMR שנצפו חייבים להחזיק משמרות כימיות שונות במדינות העוברות חילופי קונפורמציה (microstates) ו- (ii) ההחלפה צריכה להתרחש בסולם זמן הנע בין ~ 50 מיקרוס ל ~ 10 אלפיות השנייה. בתנאים אלה, שיעור ההרפיה הרוחבי שנצפה ( <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq01v2.jpg"> ) הוא סכום R2 המהותי (R2 נמדד בהעדר דינמיקה μs-ms), <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62395/62395eq02v3.jpg"> ואת תרומת ההחלפה הרפיה רוחבית (Rex). ניתן להרוותבהדרגה את תרומת Rex לאובס R2על-ידי הפחתת הריווח בין פולסים של 180° המהווים את בלוק ה- CPMG של רצף הדופק, ואת עקומות המו"פ הנובעות מכך ניתן לעצב באמצעות תיאוריית בלוך-מקונל כדי להשיג את ההבדל הכימי בין מיקרוסטאטים, את אוכלוסיית השברים של כל מיקרוסטאט ואת שיעורי ההחלפה בין מיקרוסטטים (איור1).
מספר רצפי דופק שונים ופרוטוקולי ניתוח דווחו בספרות עבור 15ניסויי N CPMG. להלן מתואר הפרוטוקול המיושם במעבדה. בפרט, יוכנסו השלבים המכריעים להכנת מדגם NMR, הקמה ורכישה של ניסויי NMR, ועיבוד וניתוח של נתוני NMR (איור 2). כדי להקל על העברת הפרוטוקול למעבדות אחרות, תוכנית הדופק, סקריפטים עיבוד וניתוח, ו ערכת נתונים אחת לדוגמה מסופקים כקבצים משלימים זמינים להורדה ב (https://group.chem.iastate.edu/Venditti/downloads.html). רצף הדופק שסופק משלב מחזור פאזה בן ארבעה שלבים בבלוק CPMG לדיכוי חפצים תלויי אופסט6 והוא מקודד לרכישת מספר ניסויים שזורים. ניסויים אלה interleaved יש תקופת הרפיה זהה אבל מספר שונה של פולסים מיקוד מחדש על מנת להשיג שדות CPMG שונים7. חשוב גם לשים לב כי תוכנית הדופק המתוארת מודדת את 15N R2 של רכיב TROSY של אות NMR8. בסך הכל, הפרוטוקול הוחל בהצלחה על אפיון חילופי קונפורמציה בחלבונים בינוניים וגדולים4,5,9,10. עבור מערכות קטנות יותר (&lt;20 kDa), מומלץ להשתמש בקוהרנטיות קוונטית אחת הטרונוקלארית (HSQC) המבוססת עלפולסים 11,12.

<table><tbody><tr><td>Cryoprobe</td><td>Bruker</td><td>5 מ"מ TCI 800 H-C/N-D cryoprobe</td><td>שפר את הרגישות</td></tr><tr><td>Deuterium Oxide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>756822-1</td><td>>99.8% טהור, משמש להכנת דגימות NMR ותרביות deuterated</td></tr><tr><td>צנטריפוגה מונעת ביד</td> United <td>Scientific</td><td>אספקה CENTFG1</td><td>משמש להסרת בועות אוויר או נוזל שיורי שנתקעו על דפנות צינור ה-NMR.</td></tr><tr><td>ספקטרומטר NMR בשדה גבוה</td><td>Bruker Bruker</td><td>Avance II 600, Bruker Avance 800</td><td>רכישת נתוני NMR</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>https://www.mathworks.com/products/get-matlab.html</td><td>מידול נתוני</td></tr><tr><td>NMR פסטור פיפטה</td><td>קורנינג תאגיד</td><td>7095D-NMR</td><td>פיפטה פסטור זכוכית פיירקס להעברת דגימת נוזל בצינור NMR</td></tr><tr>צינור<td>NMR</td><td>Willmad Precision</td><td>535-PP-7</td><td>5 מ"מ דופן דקה 7 אינץ' צינור זכוכית צילינדרי</td></tr><tr><td>NMRPipe</td><td>המכון למחקר ביו-מדעי וביוטכנולוגיה</td><td>https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/install.html</td><td>עיבוד נתוני NMR</td></tr><tr><td>SPARKY</td><td>אוניברסיטת קליפורניה, סן פרנסיסקו</td><td>https://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky/</td> <td>ניתוח נתוני NMR</td></tr><tr><td>Tospin 3.2 (או חדש יותר)</td><td>Bruker</td><td></td><td>תוכנת רכישת</td> https://www.bruker.com/protected/en/services/software-downloads/nmr/pc/pc-topspin.html</tr></tbody></table>

15 (15) n פיזור הרפיה cpmg לחקירת דינמיקה קונפורמטיבית חלבון על ציר הזמן μs-ms

15N CPMG Relaxation Dispersion for the Investigation of Protein Conformational Dynamics on the &#181;s-ms Timescale

דינמיקה קונפורמציה של חלבונים ממלאת תפקידי יסוד בוויסות קטליזה אנזימטית, כריכת ליגנד, אלוסטריה ואיתות, שהם תהליכים ביולוגיים חשובים. הבנת האופן שבו האיזון בין מבנה לדינמיקה שולט בתפקוד הביולוגי היא גבול חדש בביולוגיה המבנית המודרנית והציתה מספר התפתחויות טכניות ומתודולוגיות. בין אלה, פתרון פיזור הרפיה CPMG שיטות NMR לספק ייחודי, מידע ברזולוציה אטומית על המבנה, קינטיקה, תרמודינמיקה של שיווי משקל קונפורמי חלבון המתרחשים על ציר הזמן μs-ms. כאן, המחקר מציג פרוטוקולים מפורטים לרכישה וניתוח של ניסוי פיזור הרפיה 15N. כדוגמה, הצינור לניתוח הדינמיקה μs-ms בתחום C-מסוף של אנזים חיידקים אני מוצג.

הפרוטוקול המתואר כאן מביא לרכישת פרופילי RD עבור כל שיא בספקטרום 1H-15N TROSY (איור 3A). מפרופילי המו"פ הנרכשים ניתן להעריך את תרומת ההחלפה לרגיעה רוחבית של 15N של כל קבוצת אמידה(איור 3A, 3B). על ידי התוויית Rex על המבנה 3D של החלבון תחת חקירה, ניתן לזהות את האזורים המבניים שעברו חילופי קונפורמציה בסולם הזמן μs-ms (איור 3C). מידול עקומות המו"פ באמצעות משוואת קארבר-ריצ'רדס ...

כאן, תיאור מפורט של הפרוטוקול מיושם במעבדה לרכישה וניתוח של 15N פרופילי פיזור הרפיה על ידי פתרון ספקטרוסקופיה NMR מסופק.

15 (15) N פיזור הרפיה CPMG לחקירת דינמיקה קונפורמטיבית חלבון על ציר הזמן μs-ms

Protein conformational dynamics play fundamental roles in regulation of enzymatic catalysis, ligand binding, allostery, and signaling, which are important ...

פרוטוקול זה יכול לשמש לגילוי ואפיון של דינמיקה קונפורמית של חלבונים, החיוניים להבנת מגוון רחב של תהליכים תאיים. בהשוואה לשיטות אחרות, שיטה זו אינה דורשת שלבי הכנה מדגם מיוחדים ומספקת אפיון מקיף של הקינטיקה, התרמודינמיקה וההיבטים המבניים של שיווי המשקל האישורי. פיזור הרפיה CPMG יכול להיות מיושם באופן נרחב יותר עבור אפיון של דינמיקה אישור חומצות גרעין וביומולקולות אחרות, כמו גם עבור אפיון של אינטראקציות חלקיקי ligand.הפרוטוקול שלנו מיועד למשתמשי CPMG בפעם הראשונה. אז זו נקודת התחלה טובה. עם זאת, אנו מצפים מהמשתמשים לדעת את השלבים הבסיסיים להפעלת ניסויי NMR קונבנציונליים.כדי להגדיר ניסוי NMR בפעם הראשונה, הורד תחילה ובטל את ההסתעפות של קבצים משלימים אלה. העתק את הסיביות. vv trosy_15N_CPMG.vv קבצים בתיקיית תוכנית הדופק לספריית תוכנית הדופק. פתח את תוכנת הרכישה והשתמש בפקודה EDC כדי להעתיק ניסוי חנקן מימן 15 HSQC שנערך בעבר לניסוי חדש. השתמש בפקודה pulse program כדי לטעון את trosy_15N_CPMG.vv pulse קובץ תוכנית לתוך הניסוי החדש שנוצר. לאחר מכן השתמש בהוראות מסוף קובץ תוכנית הדופק כדי להגדיר את ניסוי CPMG. כדי להגדיר ניסוי NMR שגרתי, הצג את הדגימה למגנט ובצע את כל שלבי הרכישה הבסיסיים של NMR.הגדר P1 למשך של מימן קשה 90 מעלות פולסים P7 למשך חנקן 15 קשה 90 מעלות פולסים. בחלון הרכישה, להגדיר את המרכז ואת רוחב ספקטרלי עבור מימן וחנקן 15 ממדים. הגדר את השהיית ההרפיה ל- 0.7 T2 והשתמש בפקודה רשימת VC כדי ליצור רשימה של מספרים שלמים התואמים ל- N.After המאשרים כי כל ערך ברשימה תואם לשדה CPMG שונה בהתאם ל- CPMG שהוגש שווה לפי 4N חלקי D30, ודא שהמספר הראשון ברשימה הוא אפס.הגדר את L8 למספר הערכים ברשימת ה- VC, L3 למספר הנקודות הממשיות עבור הממד העקיף ו- 1TD ל- L8 פעמים L3 כפול שתיים. כדי למטב את דיכוי המים, הגדר את הרווח מקלט אחד וסוג EDC למשוך כדי לפתוח את קובץ תוכנית הדופק. בשורה 91, הסר את הנקודה-פסיק שלפני goto 999 ושמור את הקובץ.באמצעות הפקודה GS, התאם את הפרמטרים SPDB0 כדי למזער את עוצמת אות ה- FID. כאשר עוצמת האות שונתה, הצג מחדש נקודה-פסיק בשורה 91 של קובץ תוכנית הדופק ושמור את הקובץ. כדי למטב את SPDB11, הגדר את הרווח של המקלט לאחד ואת סוג המשיכה של EDC כדי לפתוח את קובץ תוכנית הדופק.בשורה 168, הסר את נקודתיים הנקודה-פסיק שלפני goto 999 ושמור את הקובץ. באמצעות הפקודה GS, התאם את הפרמטרים SPDB11 כדי למזער את עוצמת אות ה- FID. לאחר שינוי עוצמת האות, הצג מחדש את נקודתיים-פסיק בקו 168 ושמור את הקובץ.כדי למטב את SPDB2, הגדר את רווח המקלט לאחד והזן משיכה EDC כדי לפתוח את קובץ תוכנית הדופק. בשורה 179, הסר את נקודתיים הנקודה-פסיק שלפני goto 999 ושמור את הקובץ. באמצעות הפקודה GS, התאם את הפרמטרים SPDB2 כדי למזער את עוצמת אות ה- FID.לאחר שינוי עוצמת האות, הצג מחדש את נקודתיים הנקודה-פסיק בשורה 179 של קובץ תוכנית הדופק ושמור את הקובץ. כדי למטב את PLDB2, הגדר את רווח המקלט לאחד והזן משיכה EDC כדי לפתוח את קובץ תוכנית הדופק. בשורה 184, הסר את נקודתיים הנקודה-פסיק שלפני goto 999 ושמור את הקובץ.באמצעות הפקודה GS, התאם את הפרמטרים PLDB2 כדי למזער את עוצמת אות ה- FID. כאשר עוצמת האות שונתה, הצג מחדש את נקודתיים הנקודה-פסיק בשורה 184 של קובץ תוכנית הדופק ושמור את הקובץ. הפעל את הפקודה RGA כדי למטב את רווח המקלט.לאחר מכן הפעל את הפקודה ZG כדי להתחיל את הניסוי. באיור זה, ניתן לראות את התוצאות של פרופילי פיזור הרפיה שנרכשו עבור כל שיא בספקטרום מימן חנקן 15 טרוסי. מפרופילי פיזור הרגיעה הנרכשים, ניתן להעריך את תרומת ההחלפה לחנקן 15 הרפיה רוחבית של כל קבוצת AMI עמוד שדרה.על ידי התוויית הרפיה רוחבית על המבנה 3D של החלבון תחת חקירה אפשר לזהות את האזורים המבניים שעברו חילופי אישור על ציר הזמן אלפית השנייה מיקרו שניות. מידול עקומות פיזור ההרפיה באמצעות משוואות קארבר-ריצ'רדס מחזיר את הפרמטרים התרמודינמיים והקינטיים בתהליך ההחלפה, כגון אוכלוסיות השבר של המדינות בשיווי משקל ושער החליפין בין מדינות אלה. התלות בטמפרטורה של פרמטרים תרמודינמיים וקינטיים אלה יכולה להיות מעוצבת באמצעות משוואות van't Hoff ו- I-ring, בהתאמה, כדי לקבל מידע מפורט על האנרגיות של חילופי האישור.זה חיוני כדי לייעל בזהירות את כל הפרמטרים הרכישה, במיוחד P7. חשוב גם לייצר דגימות טהורות והומוגניות מאוד, כדי למנוע פיזור מזויף. הפרמטרים הקינטיים, התרמודינמיים והכימיים שהושגו באמצעות פרוטוקול זה יכולים לשמש להפקת מידע אנרגטי ומבניות על המינים העוברים את חילופי האישורים. אפיון הדינמיקה אישור החלבון המתקבל על ידי שיטות CPMG מספק מידע חיוני להבנת איתות ופעילות אנזימטית, כמו גם פרספקטיבות חדשות לעיצוב תרופות.

15n-cpmg-relaxation-dispersion-for-investigation-protein

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מבנים של חלבון סופרא מולקולרית הרכבות ברזולוציה אטומית הם רלוונטיות גבוהה בשל התפקידים מכריע שלהם במגוון רחב של תופעות ביולוגיות. במסמך זה, אנו מציגים פרוטוקול לבצע מחקרים מבניים ברזולוציה גבוהה על הרכבות לא מסיסים, הבלתי גבישי החלבון macromolecular על-ידי קסם-זווית ספינינג ספקטרוסקופיה של מצב מוצק תהודה מגנטית גרעינית (MAS SSNMR).

מחקרים מבניים אטומי בקנה מידה של הרכבות Macromolecular על ידי תהודה מגנטית גרעינית solid-state ספקטרוסקופיה

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) יכולה לאפיין דינמיקה מבנית של חלבונים באופן ספציפי לשאריות. אנו מספקים פרוטוקול מעשי להקלטת NMR 15N R1 ו- R2 הרפיה ו {1H}-15N אפקט Overhauser הטרוגרעיני (hetNOE), רגיש לפיקושניות לציר הזמן של ננו-שניות.

NMR 15N ניסויי הרפיה לחקר דינמיקה מבנית של פיקו-שנייה עד ננו-שניות של חלבונים

פרוטוקול מבוסס NMR זה חוקר אינטראקציות חלבון-גליקן חלשות באמצעות ציאנובירין-N ו-D-מאנוז. בשילוב שיטות זיהוי ליגנד וחלבון, הוא ממפה אתרי קשירה, מזהה השפעות אלוסטריות ומזהה קומפלקסים של מפגשים. הגישה מתארת הכנת דגימה וניתוח נתונים, ומציעה תובנות מבניות ודינמיות בעלות ערך עבור מנגנוני אבחון וזיהוי ספציפיים לגליקן.

חקר אינטראקציות חלבון-גליקן: התקדמות בתהודה מגנטית גרעינית

מאמר זה מתאר שיטה להערכת האינטראקציות וההרכבות של חלבוני ממברנה אינטגרליים במבחנה עם גורמים שותפים שונים בסביבה שומנית-פרוקסימלית.

באמצעות הפיגום ליפוזומים כדי לשקם אינטראקציות ליפידים-הפרוקסימלי חלבונים במבחנה

גמישות קונפורמציה משחקת תפקיד קריטי בתפקוד חלבון. בזאת, אנו מתארים את השימוש של ספקטרומטריית מסת electrospray יינון הזמן לפתור מצמידה את חילופי המימן-דאוטריום חיטוט השינויים המבניים המהירים שמניעים פונקצית חלבוני הורה אי סדר.

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

כאן נתאר פרוטוקול פשוט להפקת במהירות מאות צמיחה נמטודות מדיה אגר, 96-ובכן תרבות צלחות עם מספרים עקביים של Caenorhhabditis elegans לכל טוב. תרבויות אלה שימושיים להקרנה פנוטיפי של אורגניזם שלם. אנו מתמקדים כאן באמצעות תרבויות אלה לכימיקלים מסך עבור אפקטים פרו-אריכות ימים.

שיטה פשוטה להקרנה כימי תפוקה גבוהה ב Caenorhabditis Elegans

אחד התנאים המאתגרים ביותר מתח כי אורגניזמים נתקלים במהלך חייהם כרוכה ההצטברות של חמצון. במהלך סטרס חמצוני, תאים בכבדות להסתמך על מלווים מולקולרית. כאן, אנו מציגים שיטות השתמשו כדי לחקור את מוסדר חמצון-חיזור צבירת נגד הפעילות, כמו גם כדי לעקוב אחר שינויים מבניים המסדירים את הפונקציה המלווה באמצעות HDX-MS.

הגדרת פעילות מוסדר חמצון-חיזור המלווה של Hsp33 ומיפוי השינויים הסתגלותי על Hsp33 באמצעות ספקטרומטר מסה של המרת מימן-דאוטריום

אינטראקציות חלבון-חלבון קריטי עבור מערכות ביולוגיות, מחקרים של קינטיקה איגוד לספק תובנות הדינמיקה והתפקוד של מתחמי חלבון. אנו מתארים שיטה מכמת את הפרמטרים קינטי של חלבון מורכב באמצעות קרינה פלואורסצנטית והעברת אנרגיה תהודה הטכניקה זרימה עצר.

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את ההומוגניות תיוג עבור כל המינים חלבון במדגם חלבונים מורכבים ברמת מולקולה בודדת.

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

המטרה של פרוטוקול זה היא להראות כיצד להשתמש במיקרוסקופיה של יריעות האור כדי להמחיש באופן זמני את הדינמיקה של קולטן פני השטח בתאים חיים. כאן קולטני תא T על CD4+ תאי t הראשי מוצגים.

דמיין את הדינמיקה של משטח הפני-תא באמצעות מיקרוסקופ גיליון אור של סריג

חקור דינמיקה קונפורמטיבית של חלבונים באמצעות NMR פיזור הרפיה CPMG. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח קינטי ותרמודינמי מקיף של שיווי משקל קונפורמציונלי ברזולוציה אטומית ללא הכנת דגימה מיוחדת.

^{15 (15)} N פיזור הרפיה CPMG לחקירת דינמיקה קונפורמטיבית חלבון על ציר הזמן μs-ms

גלה סרטונים נוספים