גישת אובדן תפקוד ברשתית הגוזל העוברי באמצעות ביטוי טרנסגני בתיווך Tol2 של מיקרו-רנ"א מלאכותי

מתודולוגיה זו מספקת גישה של אובדן תפקוד למחקרים על התפתחות הרשתית בגוזל. טכניקה זו תומכת בדיכוי מהיר ומתמשך של גני מטרות באזור מסוים ברשתית. גישה זו יכולה להיות מיושמת גם על חלקים אחרים של עובר האפרוח, כולל הן את הרקמות העצביות והן את הרקמות הלא עצביות.

עבור אלקטרופורציה של אובו, הכינו תמיסה ירוקה מהירה של 0.25% על ידי המסת 25 מיליגרם של FCF ירוק מהיר ב-10 מיליליטר של PBS, ולאחר מכן סננו את התמיסה באמצעות מסנן מזרקים של 0.2 מיקרון. לאחר מכן, הכינו את תמיסת הזרקת קוקטייל ה- DNA על ידי ערבוב פלסמיד ה- microRNA emerald GFP עם פלסמיד ביטוי טרנספוזאז Tol2 ביחס של שניים לאחד. לאחר מכן הוסף את התמיסה המוכנה של Fast Green לקוקטייל ה- DNA ביחס של אחד עד 10 להדמיה של האזור המוזרק.

לאחר מכן, להגדיר את מנגנון microinjection. המכשיר מורכב מזרק המילטון, מחט 18 מד שני אינץ ', צינור פוליוויניל כלוריד באורך שני סנטימטרים, ומחט מיקרופיפטה. ממלאים את מזרק המילטון בשמן מינרלי כבד, ואז מחברים את מחט 18 המד למזרק, וממלאים את החלל הפנימי של המחט בשמן על ידי לחיצה על בוכנת המזרק.

לאחר מכן, חבר את צינור פוליוויניל כלוריד לקצה המחט, ומלא את הצינור עם השמן. חבר את מחט המיקרופיפטה המשוכה לצינור. לאחר מכן תחת המיקרוסקופ המנתח באמצעות מלקחיים עדינים, לנתק את קצה המחט לקוטר של 10 עד 20 מיקרומטר כדי ליצור פתח קטן.

ממלאים את המחט כולה בשמן. לאחר מכן, הניחו חמישה מיקרוליטרים של קוקטייל הדנ"א הצבעוני על צלחת פטרי. מתחת למיקרוסקופ המנתח, הניחו את קצה מחט המיקרופיפטה בתמיסת הדנ"א על צלחת הפטרי, ומשכו לאט את התמיסה לתוך המחט.

לאחר שהלחץ התאזן בתוך המחט ומחוצה לה, הוציאו את קצה המחט מתמיסת הדנ"א, והשאירו אותה שקועה ב-PBS סטרילי בכד קטן עד להזרקה. לאחר מכן כדי להגדיר את מנגנון האלקטרופורציה, הגדר זוג אלקטרודות פלטינה בחוזקה עם מחזיק אלקטרודות על מיקרומניפולטור. כוונן את המרווח בין קצה האלקטרודות לשני מילימטרים, וחבר את האלקטרודות למחולל פולס גל מרובע עם כבלים.

לאחר מכן, עבור מיקרו-הזרקת DNA, הסר ביצית לגהורן לבנה מופרית מהאינקובטור ונגב את פני השטח של הביצה עם נייר טישו ספוג באתנול 70%. לאחר מכן חברו מחט 18 מד למזרק 10 מיליליטר, והכניסו את המחט דרך הקצה הקהה של הביצה, בזווית כלפי מטה כדי למנוע פגיעה בחלמון. לאחר משיכת שניים עד שלושה מיליליטר אלבומין מהביצה, אטמו את החור עם חתיכת סרט סקוטש, והאירו את הביצה באור כדי להבטיח שהעובר וקרום ויטלין מנותקים מהקליפה.

לאחר מכן, באמצעות מלקחיים, להסיר חתיכת קליפת ביצה מראש הביצה, לחשוף את העובר. אין לשלוח יותר מחמש ביציות בכל זמן נתון כדי למנוע התייבשות של עוברים במהלך התחשמלות. הכנס את קצה המחט לתוך שלפוחית הראייה מצידה הפרוקסימלי בזווית של 45 מעלות, והזריק את קוקטייל ה- DNA על ידי לחיצה איטית על הבוכנה עד שתמיסה בצבע כחול ממלאת את הלומן.

משוך את המחט, והחזיר את קצהו ל- PBS. עבור אלקטרופורציה, הגדר את מתח הפולס ל- 15 וולט, את אורך הפולס ל- 15 אלפיות השנייה, את מרווח הפולס ל- 915 אלפיות השנייה ואת מספר הפולס לחמש. לאחר הוספת כמה טיפות של HBSS על קרום ויטלין מעל העובר, השתמש במיקרומניפולטור כדי להוריד את האלקטרודות לתוך HBSS בניצב לציר הקדמי-אחורי של העובר.

הניחו את האלקטרודות משני צדי שלפוחית הראייה, וודאו שהאלקטרודות אינן נוגעות בעובר או בכלי הדם, ולאחר מכן הפעילו שדות חשמליים פועמים. לאחר השלמת האלקטרופורציה, הסר את האלקטרודות, ונקה בעדינות את האלקטרודות עם צמר גפן סטרילי ספוג מים כדי למנוע הצטברות אלבומין. אוטמים את החלון בסקוטש טייפ, ודורים מחדש על העובר עד לשלב ההתפתחותי הרצוי.

טרנספקציה של רצפי קדם-מיקרו-רנ"א בודדים לתאי Nel AP המבטאים תאי HEK293T הביאה לדיכוי משמעותי של ביטוי Nel על ידי מבנים כנגד נוקלאוטידים 482 עד 502, 910 עד 930 ו-2461 עד 2481. שרשור שני רצפי מיקרו-רנ"א שיפר משמעותית את יעילות ההפלה. כל שלושת הצירופים הראו פעילויות דיכוי משופרות בהשוואה לרצפי קדם-מיקרו-רנ"א בודדים ללא מעצורים.

דיכוי חזק נצפה לפחות 13 ימים לאחר ההדבקה. כאשר מבנה קדם-מיקרו-רנ"א של Nel המכוון לנוקלאוטידים 482 עד 502 ו-2461 עד 2481 הודבק יחד עם וקטור ביטוי הטרנספוזאז לתוך רשתית האפרוח, ביטוי Nel באפיתל פיגמנט הרשתית הופחת משמעותית בתאי GFP אמרלד המבטאים תאים ביום העוברי 4.5. בעוברים בני שמונה ימים, ביטוי Nel ירד גם בתאי גנגליון ברשתית.

לעומת זאת, ביטוי Nel ברשתית לא הושפע מהכנסת מיקרו-רנ"א בקרה. לאחר הליך זה, ניתן לבחון את ההשפעות על דיכוי גני המטרה באמצעות שיטות שונות כגון בדיקות של התרבות תאים והתמיינותם, מוות תאי ומעקב אחר תאים ואקסונים.