גישת אובדן תפקוד ברשתית הגוזל העוברי באמצעות ביטוי טרנסגני בתיווך Tol2 של מיקרו-רנ"א מלאכותי
18 במאי 2022
פיתחנו גישה חדשנית של אובדן תפקוד הכוללת החדרה ואינטגרציה גנומית של רצפי מיקרו-רנ"א מלאכותיים לעוברי אפרוחים באמצעות אלקטרופורציה ומערכת טרנספוזון Tol2. טכניקה זו מספקת מתודולוגיית פירוק גנים חזקה ויציבה לחקר תפקוד גנים במהלך ההתפתחות.
מתודולוגיה זו מספקת גישה של אובדן תפקוד למחקרים על התפתחות הרשתית בגוזל. טכניקה זו תומכת בדיכוי מהיר ומתמשך של גני מטרות באזור מסוים ברשתית. גישה זו יכולה להיות מיושמת גם על חלקים אחרים של עובר האפרוח, כולל הן את הרקמות העצביות והן את הרקמות הלא עצביות.
עבור אלקטרופורציה של אובו, הכינו תמיסה ירוקה מהירה של 0.25% על ידי המסת 25 מיליגרם של FCF ירוק מהיר ב-10 מיליליטר של PBS, ולאחר מכן סננו את התמיסה באמצעות מסנן מזרקים של 0.2 מיקרון. לאחר מכן, הכינו את תמיסת הזרקת קוקטייל ה- DNA על ידי ערבוב פלסמיד ה- microRNA emerald GFP עם פלסמיד ביטוי טרנספוזאז Tol2 ביחס של שניים לאחד. לאחר מכן הוסף את התמיסה המוכנה של Fast Green לקוקטייל ה- DNA ביחס של אחד עד 10 להדמיה של האזור המוזרק.
לאחר מכן, להגדיר את מנגנון microinjection. המכשיר מורכב מזרק המילטון, מחט 18 מד שני אינץ ', צינור פוליוויניל כלוריד באורך שני סנטימטרים, ומחט מיקרופיפטה. ממלאים את מזרק המילטון בשמן מינרלי כבד, ואז מחברים את מחט 18 המד למזרק, וממלאים את החלל הפנימי של המחט בשמן על ידי לחיצה על בוכנת המזרק.
לאחר מכן, חבר את צינור פוליוויניל כלוריד לקצה המחט, ומלא את הצינור עם השמן. חבר את מחט המיקרופיפטה המשוכה לצינור. לאחר מכן תחת המיקרוסקופ המנתח באמצעות מלקחיים עדינים, לנתק את קצה המחט לקוטר של 10 עד 20 מיקרומטר כדי ליצור פתח קטן.
ממלאים את המחט כולה בשמן. לאחר מכן, הניחו חמישה מיקרוליטרים של קוקטייל הדנ"א הצבעוני על צלחת פטרי. מתחת למיקרוסקופ המנתח, הניחו את קצה מחט המיקרופיפטה בתמיסת הדנ"א על צלחת הפטרי, ומשכו לאט את התמיסה לתוך המחט.
לאחר שהלחץ התאזן בתוך המחט ומחוצה לה, הוציאו את קצה המחט מתמיסת הדנ"א, והשאירו אותה שקועה ב-PBS סטרילי בכד קטן עד להזרקה. לאחר מכן כדי להגדיר את מנגנון האלקטרופורציה, הגדר זוג אלקטרודות פלטינה בחוזקה עם מחזיק אלקטרודות על מיקרומניפולטור. כוונן את המרווח בין קצה האלקטרודות לשני מילימטרים, וחבר את האלקטרודות למחולל פולס גל מרובע עם כבלים.
לאחר מכן, עבור מיקרו-הזרקת DNA, הסר ביצית לגהורן לבנה מופרית מהאינקובטור ונגב את פני השטח של הביצה עם נייר טישו ספוג באתנול 70%. לאחר מכן חברו מחט 18 מד למזרק 10 מיליליטר, והכניסו את המחט דרך הקצה הקהה של הביצה, בזווית כלפי מטה כדי למנוע פגיעה בחלמון. לאחר משיכת שניים עד שלושה מיליליטר אלבומין מהביצה, אטמו את החור עם חתיכת סרט סקוטש, והאירו את הביצה באור כדי להבטיח שהעובר וקרום ויטלין מנותקים מהקליפה.
לאחר מכן, באמצעות מלקחיים, להסיר חתיכת קליפת ביצה מראש הביצה, לחשוף את העובר. אין לשלוח יותר מחמש ביציות בכל זמן נתון כדי למנוע התייבשות של עוברים במהלך התחשמלות. הכנס את קצה המחט לתוך שלפוחית הראייה מצידה הפרוקסימלי בזווית של 45 מעלות, והזריק את קוקטייל ה- DNA על ידי לחיצה איטית על הבוכנה עד שתמיסה בצבע כחול ממלאת את הלומן.
משוך את המחט, והחזיר את קצהו ל- PBS. עבור אלקטרופורציה, הגדר את מתח הפולס ל- 15 וולט, את אורך הפולס ל- 15 אלפיות השנייה, את מרווח הפולס ל- 915 אלפיות השנייה ואת מספר הפולס לחמש. לאחר הוספת כמה טיפות של HBSS על קרום ויטלין מעל העובר, השתמש במיקרומניפולטור כדי להוריד את האלקטרודות לתוך HBSS בניצב לציר הקדמי-אחורי של העובר.
הניחו את האלקטרודות משני צדי שלפוחית הראייה, וודאו שהאלקטרודות אינן נוגעות בעובר או בכלי הדם, ולאחר מכן הפעילו שדות חשמליים פועמים. לאחר השלמת האלקטרופורציה, הסר את האלקטרודות, ונקה בעדינות את האלקטרודות עם צמר גפן סטרילי ספוג מים כדי למנוע הצטברות אלבומין. אוטמים את החלון בסקוטש טייפ, ודורים מחדש על העובר עד לשלב ההתפתחותי הרצוי.
טרנספקציה של רצפי קדם-מיקרו-רנ"א בודדים לתאי Nel AP המבטאים תאי HEK293T הביאה לדיכוי משמעותי של ביטוי Nel על ידי מבנים כנגד נוקלאוטידים 482 עד 502, 910 עד 930 ו-2461 עד 2481. שרשור שני רצפי מיקרו-רנ"א שיפר משמעותית את יעילות ההפלה. כל שלושת הצירופים הראו פעילויות דיכוי משופרות בהשוואה לרצפי קדם-מיקרו-רנ"א בודדים ללא מעצורים.
דיכוי חזק נצפה לפחות 13 ימים לאחר ההדבקה. כאשר מבנה קדם-מיקרו-רנ"א של Nel המכוון לנוקלאוטידים 482 עד 502 ו-2461 עד 2481 הודבק יחד עם וקטור ביטוי הטרנספוזאז לתוך רשתית האפרוח, ביטוי Nel באפיתל פיגמנט הרשתית הופחת משמעותית בתאי GFP אמרלד המבטאים תאים ביום העוברי 4.5. בעוברים בני שמונה ימים, ביטוי Nel ירד גם בתאי גנגליון ברשתית.
לעומת זאת, ביטוי Nel ברשתית לא הושפע מהכנסת מיקרו-רנ"א בקרה. לאחר הליך זה, ניתן לבחון את ההשפעות על דיכוי גני המטרה באמצעות שיטות שונות כגון בדיקות של התרבות תאים והתמיינותם, מוות תאי ומעקב אחר תאים ואקסונים.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג גישה חדשנית של אובדן תפקוד באמצעות שילוב של רצפי מיקרו-RNA מלאכותיים לתוך עוברי תרנגולת. באמצעות אלקטרופורציה in ovo ומערכת הטרנספוזון Tol2, זה מאפשר השתקה גנטית יציבה לחקירת תפקוד הגן במהלך התפתחות הרשתית ורקמות עובריות אחרות.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- התפתחות עצבית
- הנדסה גנטית
- ביולוגיה עוברית
רקע
- המחקר מתמקד בתפקוד הגן במהלך התפתחות העובר של התרנגולת.
- אלקטרופורציה in ovo מאפשרת מיקוד מדויק של רקמות ספציפיות.
- הגישה יכולה ליושם על רקמות עצביות ושאינן עצביות.
מטרת המחקר
- לפתח מתודולוגיה יציבה להשתקה לחקר התפתחות הרשתית.
- להעריך את ההשפעה של מיקרו-RNA על ביטוי הגן.
- לשפר את היישומיות של השתקה גנטית בתחומי עובריים שונים.
שיטות ששימשו
- הפלטפורמה המשמשת היא אלקטרופורציה in ovo להתממשקות ישירה של העובר.
- המודל הביולוגי כולל עוברי תרנגולת, במיוחד אינטראקציות בתוך הרשתית.
- הצעדים העיקריים כוללים הכנת קוקטיילים של DNA והגדרות אלקטרופורציה.
- תהליכי ההזרקה והאלקטרופורציה תוארו בפירוט.
תוצאות עיקריות
- הגישה מאפשרת השתקה יעילה של גנים ממוקדים ברשתית התרנגולת.
- דכא בר קיימא של ביטוי הגן נצפה לאורך פרקי זמן ממושכים.
- הופחתו משמעותית ברמת ביטוי Nel נרשמו בסוגי תאים ספציפיים ברשתית לאחר אלקטרופורציה.
מסקנות
- מתודולוגיה זו מספקת כלי חשוב לחקר תפקוד הגן בהתפתחות עוברית.
- היא משפרת את ההבנה של המנגנונים העומדים בבסיס התפתחות הרשתית ויישום פוטנציאלי בגנטיקה.
- התוצאות מצביעות על יישומיות רחבה להתערבויות גנטיות ברקמות עובריות שונות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Robust loss-of-function strategies are essential for target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The Tol2 transposon-mediated artificial microRNA system enables persistent, region-specific gene silencing in the chick retina, addressing a longstanding gap in functional genomics for developmental neurobiology. This capability supports predictive confidence and risk-adjusted decision-making across discovery and preclinical pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in a disease-relevant developmental system.
- Supports mechanistic de-risking by allowing stable suppression of candidate targets.
- Facilitates functional target validation through persistent gene knockdown in vivo.
- Improves predictive confidence for downstream portfolio triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological systems for quantitative phenotypic screening.
- Enables reproducible and standardized gene silencing for assay development.
- Supports scalable workflows for evaluating compound effects in genetically defined contexts.
- Provides robust readouts via fluorescent markers for screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene function studies with disease-relevant developmental stages.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation in neural tissues.
- Supports risk-adjusted advancement by clarifying gene roles in tissue development.
- Facilitates biomarker alignment through persistent and specific gene suppression.
Pipeline & Workflow Integration
This gene silencing method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to preclinical model validation, particularly in developmental and neurobiological research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven loss-of-function studies and pathway clarification in vivo.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of gene suppression and phenotypic outcomes using fluorescence and molecular assays.
- Translational Research: Maintains continuity across developmental stages and tissue types for preclinical relevance.
- Enterprise Reuse: Adaptable for gene function studies in both neural and non-neural tissues, supporting broad R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable gene silencing workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in in ovo electroporation and microinjection techniques.
- Needs access to molecular cloning, fluorescence imaging, and electroporation instrumentation.
- Demands cross-team standardization for reproducibility and data comparability.
- Adaptable across developmental stages and tissue types within the chick embryo.
- Practical limitations include technical skill requirements and tissue accessibility.
