השגת סינון מקטעים יעיל במתקן XChem ב-Diamond Light Source
29 במאי 2021
מאמר זה מתאר את תהליך XChem המלא לסינון מקטעים מבוסס גביש, החל מהגשת בקשה לגישה וכל השלבים הבאים להפצת נתונים.
מתקן XChem ב-Diamond Light Source מספק סינון שגרתי בקנה מידה גדול של פרגמנטים גרפיים גבישיים, התומך בתהליך השיקוע של הגביש כולו. קריסטלוגרפיה בקרני רנטגן היא חלק חיוני מארגז הכלים של FBDD. הוא רגיש מספיק כדי לזהות קלסרים חלשים ומניב ישירות מידע מבני על האינטראקציות ברמה המולקולרית.
גילוי תרופות מבוססות פרגמנטים הוא אסטרטגיה נפוצה לגילוי עופרת. היא סיפקה שש תרופות לשימוש קליני ויותר מ-50 מולקולות קודמו לניסויים קליניים. ההשפעה של ההתקדמות והיעילות שמספקת פלטפורמת XChem על שיטות השריה מסורתיות, איסוף נתונים ושיטות ניתוח מודגמת בצורה הטובה ביותר מבחינה חזותית.
התחילו בבחירת הגבישים ומיקום התרכובת. פתח את TextRank ממחשב ובחר את מגש הקריסטל, מהרשימה בפינה השמאלית התחתונה או על-ידי הקלדת הברקוד בתיבה בפינה השמאלית העליונה. בחר את תבנית התמונה הנכונה ואת תצוגת הבאר היחידה.
כדי להוסיף ממס או תרכובות לטיפה מבלי לפגוע בגביש, לחץ לחיצה ימנית בתוך הטיפה, אך הרחק מהגביש כאשר נמצא גביש מתאים לניסוי תוך כדי תנועה בין תמונות הטיפה. פתח את תוכנת Echo ובחר חדש כדי לחלק פתרונות באמצעות המתקן האקוסטי. בחר את צלחת המקור הנכון ואת המחלקה נוזלי.
ודא שסוג הלוח הנכון נבחר כלוחית היעד. לאחר מכן סמן את התיבה המותאמת אישית והמשך. בחרו ייבוא ובחרו את קובץ האצווה הרלוונטי.
לאחר מכן השלם את שלבי הייבוא כפי שתתבקש על-ידי התוכנה. השתמש במפות הלוחות כדי לבדוק את הפתרון שיש לחלק ואת מיקומי היעד. לאחר מכן הפעל את הפרוטוקול בהתאם להנחיות כפי שהן עולות.
התמיסות מלוח המקור יוותרו לטיפות הקריסטל שנבחרו. אחסנו את הצלחת באינקובטור למשך הזמן הנדרש. כדי לקצור את הגבישים באמצעות התקן קצירת הגבישים החצי-אוטומטי, לחץ על לחצן התחל זרימת עבודה כדי לעבור למיקום הבאר הראשון שנבחר.
אם הגביש שרד, הרכיבו אותו בלולאה והכניסו אותו לחנקן הנוזלי, והציבו אותו במקום הראשון בזין הראשון ברשימה. בחר את התיאור המתאים עבור הגביש מהממשק. אם הטיפה היא השריה מורכבת, רשום את תיאור המצב המורכב.
אם הגביש הותקן בהצלחה, בחר מותקן, אחרת, בחר נכשל. לאחר קצירת הגבישים, קחו את הגבישים לסורק הברקוד והניחו אותם במחזיק אחד בכל פעם כדי לסרוק את הברקודים ולהצמיד אותם. לאחר השלמת הסריקה, הניחו את המכסים על הדסקיות ואחסנו אותם במחסן אחסון חנקן נוזלי.
כדי לאסוף מחדש את הדגימות שאינן ממורכזות, התבונן בתצוגת מחליף הדגימות ב- ISPyB ובחר דרג לפי רזולוציית AP כדי לדרג את הדגימות לפי רזולוציית עיבוד אוטומטי בהדרגתיות צבע מירוק לאדום. לחץ על הדגימות כדי לבדוק אם יש דגימות אדומות או צהובות. לאחר מכן בדקו את תצלומי הגביש כדי לראות אם הגביש היה ממורכז.
כדי לאחזר ולנתח את תוצאות העיבוד האוטומטי של Diamond באמצעות XChem Explorer או XCE, במסוף, עבור אל עיבוד תיקיית המשנה והשתמש בכינוי XCE כדי לפתוח את XChem Explorer. בחר בלחצן עדכן טבלאות ממקור נתונים בכרטיסיה סקירה כללית כדי לרענן את סיכום הנתונים הניסיוניים. תחת הכרטיסיה הגדרות, בחר את ספריית איסוף הנתונים, פתח את הכרטיסיה ערכות נתונים.
בחר את היעד מהתפריט הנפתח בחר יעד, בחר קבל תוצאות חדשות מעיבוד אוטומטי מהתפריט הנפתח ערכות נתונים ולחץ על הפעל. כדי לחשב מפות ראשוניות באמצעות Dimple, פתח את הכרטיסייה מפות, בחר את מודל ההפניה מהתפריט הנפתח ובחר את ערכות הנתונים הרצויות ולאחר מכן הפעל Dimple על קבצי MTZ נבחרים. ליצירת ריסון ליגנד, בחר בערכות הנתונים הרצויות ולאחר מכן צור קובץ SCF או PDB או PNG של תרכובות נבחרות מהתפריט הנפתח מפות ומעצורים.
כדי לזהות להיטים באמצעות Panda, בחר בכרטיסייה Pandas, ודא שספריית הפלט מוגדרת כראוי והפעל את Panda. נתח מהתפריט הנפתח זיהוי להיטים. כדי לנתח פגיעות שזוהו על ידי Panda, הפעל את Panda.
בדוק מהתפריט הנפתח זיהוי להיט. כדי לפתוח את Coot עם לוח הבקרה של Panda. טען ממוצע ומפות 2mFo-DFc מ- Dimple להשוואה עם מפת האירועים והדגם.
לאחר התאמת ליגנד, לחץ על מזג ליגנד עם מודל ושמור מודל לפני ניווט לאירוע אחר כדי להימנע מאובדן שינויים במודל המצב המאוגד. הוסף ביאורים לאירוע האיגוד באמצעות שדה הערת האירוע וביאור אתרי האיגוד באמצעות מידע אודות אתר הרשומות. לאחר שכל הליגנדות בנות קיימא מודלו, מוזגו ונשמרו בהתבסס על מפת האירועים, סגור את panda.inspect.
יצא את דגמי הבדיקה של Panda בחזרה לספריית הפרויקט והפעל סבב ראשוני של ליטוש עבור ערכות הנתונים שנבחרו, והמיקוד יהיה גלוי כעת בכרטיסיה עידון. צינור XChem להקרנת מקטעים על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן התייעל באופן נרחב, ואפשר את קליטתו על ידי הקהילה המדעית. תרשים זה מדגים את הקליטה והאיחוד של תוכנית המשתמשים משנת 2015 עד 2019 עם יצירת קבוצות הקצאת בלוקים בשנת 2019 ועמידות הפלטפורמה במהלך מגיפת COVID-19 בשנת 2020.
קמפיינים מוצלחים מניבים מפה תלת ממדית של אתרי אינטראקציה פוטנציאליים על חלבון היעד. תוצאה טיפוסית היא מסך XChem של הפרוטאז הראשי של SARS-CoV-2. האתרים הידועים המעניינים כגון אתרים פעילים אנזימים ותת-כיסים מוצגים בצהוב.
האתרים האלוסטטריים המשוערים, כגון אלה המעורבים באינטראקציות חלבון-חלבון, מוצגים בממשקי אריזת מגנטה וגביש הנחשבים בדרך כלל לחיוביים כוזבים מוצגים בירוק. מבחינה היסטורית, השימוש בקריסטלוגרפיה כמסך פרגמנט ראשוני היה קשה. מחקר זה תיעד את פרוטוקולי צינור XChem מהכנת הדגימה ועד למבנים הסופיים.
הקרנת מקטעים קריסטלוגרפיים משלימה טכניקות ביופיזיקליות אחרות והיא בדרך כלל חיונית לקידום פגיעות פרגמנטים לתרכובות עופרת. זה יכול להיות מיושם על כל סוג יעד גילוי סמים.
סקירה כללית
מאמר זה מתאר את תהליך ה-XChem המלא לסריקת פרגמנטים מבוססת קריסטלים, ומפרט את השלבים החל מבקשת הגישה ועד להפצת הנתונים. מתקן ה-XChem ב-Diamond Light Source משפר את גילוי התרופות המבוסס על פרגמנטים באמצעות קריסטלוגרפיית קרני X יעילה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- גילוי תרופות מבוסס פרגמנטים (FBDD)
- קריסטלוגרפיית קרני X
- ביולוגיה מבנית
רקע
- גילוי תרופות מבוסס פרגמנטים הוא אסטרטגיה לגילוי תרכובות מובילות (lead discovery).
- קריסטלוגרפיית קרני X מספקת תובנות מבניות לגבי אינטראקציות מולקולריות.
- לשיטות השריה מסורתיות יש מגבלות ש-XChem נותן להן מענה.
- פלטפורמת XChem הפגינה עמידות במהלך מגפת ה-COVID-19.
מטרת המחקר
- לתעד את פרוטוקולי צנרת העבודה של XChem, מהכנת הדגימה ועד למבנים הסופיים.
- להדגים את היעילות של פלטפורמת XChem לסריקת פרגמנטים.
- להדגיש את השפעתה של סריקת פרגמנטים קריסטלוגרפית על גילוי תרופות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בחירה של גבישים ותרכובות לסריקה.
- שימוש במנפיקים אקוסטיים (acoustic dispensers) להנפת תמיסות.
- איסוף גבישים באמצעות מכשירים חצי-אוטומטיים.
- ניתוח נתונים באמצעות תוכנות XChem Explorer ו-Panda.
תוצאות עיקריות
- מסעות מוצלחים מניבים מפות תלת-ממדיות של אתרי אינטראקציה.
- תיעוד של אימוץ תוכנית המשתמש בין השנים 2015 ל-2019.
- זיהוי של אתרים אלוסטריים פוטנציאליים ואתרים פעילים בחלבונים.
- פרוטוקולים יעילים מאפשרים גישה רחבה יותר לקהילה המדעית.
מסקנות
- מסלול העבודה של XChem משפר משמעותית את יעילות הסריקה של פרגמנטים.
- סריקת פרגמנטים קריסטלוגרפית משלימה טכניקות ביופיזיות אחרות.
- ההתקדמויות בפלטפורמת XChem תומכות במאמצים מתמשכים לגילוי תרופות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
גילוי תרופות מבוסס פרגמנטים (Fragment-based drug discovery) נסמך על זיהוי רגיש של אינטראקציות מולקולריות חלשות, כאשר קריסטלוגרפיה של קרני X מספקת הן את זיקת הקשירה והן את הפירוט המבני החיוני לאופטימיזציה של תרכובות מובילה (lead optimization). מתקן ה-XChem ב-Diamond Light Source מייעל את סינוי הפרגמנטים הקריסטלוגרפי, מהכנת הדגימה ועד להפקדת הנתונים, ומאפשר זיהוי שגרתי של קושרים חלשים בדיוק מבני גבוה. יכולת זו תומכת בתיקוף מוקדם של מטרות ובמעבר משלב ה-hit לשלב ה-lead בתחומי טיפול מגוונים, ובכך מפחיתה את אי-הוודאות המכניסטית בתהליכי הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- ערך מדעי: מאפשר בחינה של היפותזות טיפוליות באמצעות תצפית ישירה על מצבי קישור של ליגנדים ברזולוציה אטומית.
- ערך תפעולי: תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אישור מעורבות המטרה ונגישות אתר הקישור לפני השקעה במסע הפיתוח.
- ערך חיזוי: מייצר נקודות מוצא בעלות רמת ביטחון גבוהה עבור כימיה רפואית על ידי זיהוי פרגמנטים בעלי גיאומטריות אינטראקציה מוגדרות.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מוכנות הבדיקה: מספקת תוצרי מבנה סטנדרטיים וניתנים לשחזור המאפשרים הערכה מהימנה של תרכובות לאורך מספר מסעות סריקה.
- סקילביליות (יכולת הרחבה): מקלה על סריקה בספיקת עבודה גבוהה באמצעות טיפול אוטומטי בדגימות ואיסוף נתונים ללא השגחה בקו הקרן I04-1.
- איכות הנתונים: מייצרת מפות צפיפות אלקטרונים כמותיות ואילוצים של ליגנדים התומכים בתיקוף פגיעות (hit validation) ובזינוק (refinement) של השלבים הבאים.
מחקר תרגומי וקדם-קליני
- המשכיות תרגומית: מספק תובנות מבניות התואמות לפיתוח ביו-מרקרים באמצעות מיפוי אתרי אינטראקציה הרלוונטיים לתפקוד.
- הפחתת סיכונים פרה-קלינית: מאפשר מעקב מהיר אחר פגיעות (hits) ממטרות מתהוות, כפי שהודגם במהלך סריקת הפרוטאז הראשי של SARS-CoV-2 עם זמן סבב של 3 שבועות.
- רלוונטיות לפורטפוליו: תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון על ידי אספקת ראיות מבניות לקשירה במגוון מחלקות של מטרות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
פלטפורמת XChem משתלבת ברצף הגילוי, החל מתיקוף מטרות מוקדם ועד לזיהוי מובילים (leads), ומספקת נתונים מבניים המכוונים את אסטרטגיות בחירת הפגיעות (hits) והאופטימיזציה שלהן.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על ידי אספקת ראיות מבניות ישירות לאינטראקציות בין תרכובת למטרה, ובכך מבהירה מנגנוני קישור.
- סינון (Screening): מאפשרת מוכנות לבדיקה באמצעות טיפול אוטומטי בגבישים, חלוקת ממס ותהליכי עיבוד נתונים המבטיחים הדירות (reproducibility).
- אנליטיקה: מייצרת פלטים מדידים, כולל מפות של אירועי קישור ליגנד, מודלים המוכנים לאופטימיזציה (refinement) והערות לאתרים המאפשרות ניתוח השוואתי בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מקשרת בין פגיעות פרגמנטים (fragment hits) לרציפות פרה-קלינית על ידי אספקת הקשר מבני למעורבות המטרה (target engagement) ולמודולציה אלוסטרית.
- שימוש חוזר ארגוני: משמשת כיכולת סינון מבנית הניתנת לשימוש חוזר, הנגישה דרך נתיבים אקדמיים שעברו ביקורת עמיתים ונתיבים תעשייתיים קנייניים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: ביטחון חיזוי באמצעות ויזואליזציה מבנית ישירה של אינטראקציות של קושרים חלשים, המפחיתה עמימות בתיקוף המטרה.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה ויכולת שחזור באמצעות פרוטוקולים יעילים, חלוקה אוטומטית וניהול נתונים מרכזי באמצעות XChem Explorer.
- ערך אסטרטגי: שיפור בקבלת החלטות go/no-go באמצעות אספקת אישור מבני ללידים (hits), המשלים את מיון הסריקה הביופיזיקלית.
- השפעה על הפורטפוליו: תיעדוף מותאם סיכונים המאפשר נתונים מבניים על פלסטיות אתר הקשירה ונקודות חמות (hotspots) של אינטראקציה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בקריסטלוגרפיה, טיפול בספריות פרגמנטים ופירוש נתונים מבניים.
- תלוי בגישה לקווי קרן של סינכטרון, מערכות דיספנסינג אקוסטיות וכלים אוטומטיים לאיסוף גבישים.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית במעקב אחר דגימות, שמיכה של נתונים ופרוטוקולי הפקדה באמצעות ISPyB ו-XChem Explorer.
- כולל שיקולי התאמה עבור איכות הגבישים, תאימות ממסים ותנאי השריה ספציפיים למטרה.
- מגבלות מעשיות כוללות תלות ביכולת השגת גבישים וברגישות לקרינת X של מטרות מסוימות, כפי שצוין במחקר.
