מודל דגי זברה של גרורות נוירובלסטומה

שיטות אלה שימשו לפיתוח מודל דג הזברה הראשון של גרורות נוירובלסטומה. וכדי להוכיח כי מודל זה יכול לשחזר בנאמנות תכונות רבות של גרורות לראות בחולים עם סיכון גבוה של נוירובלסטומה. היתרון העיקרי של מודל דגי זברה גרורתי זה הוא הדמיית vivo בזמן אמת של הפצת הגידול כדי להבין טוב יותר מתי, ואולי איך גרורות מתרחשות.

טכניקה זו אינה ספציפית לנוירובלסטומה. זה יכול להיות מיושם על מודלים של דגי זברה של סוגים שונים של סרטן כל עוד התאים הגידוליים ניתן לזהות ולעקוב אחר המוביל למגוון של אפשרויות. בתור התחלה, לפתח קו דגים מהונדס הטרוזיגוסי שמבטא יתר על המידה הן את MYCN והן את LMO1 על ידי הכלאת קווים מהונדסים MYCN ו- LMO1.

ביום אחד לאחר ההפריה, השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופי כדי למיין את הצאצא של outcross עבור ביטוי EGFP, אשר מציג כנקודות חיוביות EGFP. לאחר המיון, בודדו עוברים מוקרנים לתוך מנות פטרי נפרדות ותייגו מנות כחיוביות MYCN או MYCN שליליות. דמיין ומיין עוברים של שתי הקבוצות עבור ביטוי LMO1 שלושה עד ארבעה ימים לאחר ההפריה.

חפש כתמי פלואורסצנטיות אדומים הן בגנגליון צוואר הרחם העליון והן בתאים העצביים הדופאמין שאינם PSNS במיוחד במדולה אובלונגטה של המוח האחורי. בצע את ההקרנה לפני העוברים להגיע חמישה ימים לאחר ההפריה. לאחר מכן בודדו דגים ממוינים לארבע קבוצות של גנוטיפים שונים ותייגו כ-MYCN בלבד, LMO1 בלבד, MYCN ו-LMO1 הן וסוג הבר.

לגדל אותם בתנאים זהים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. דמיינו גידולים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי סטריאוסקופי על ידי היפוך עדין של דגים עם מרית מתכת משני הצדדים לרוחב כדי להציג את הגידול. לאחר זיהוי הדגים הנושאים גידול אפשרי, בודדו אותם למיכל נפרד עם תוויות מתאימות הכוללות את תאריך הלידה, תאריך הקרנת הגידול וגנוטיפ.

שישה שבועות לאחר ההפריה, חזור על שלבים קודמים כדי לסנן דגים נושאי גידולים ודגים שאינם נושאי גידולים כדי לאשר את נוכחותם של גידולים עבור דגים שעברו סינון בעבר או לזהות דגים חדשים הנושאים גידולים אפשריים. חפשו את הגודל המתמשך או המוגדל של המסה החיובית הפלואורסצנטית והדגים הנושאים גידולים מאושרים. לאחר זיהוי דגים נושאי גידול, לעקוב אחריהם דו-שבועי לראיות של נדידת תאים סרטניים, אשר מציג כמו EGFP זעיר או mCherry גושי גידול חיוביים רחוק מהאתר העיקרי של תחילת הגידול.

לבודד את הדגים האלה לתוך טנקים נפרדים לפי הצורך ולתייג כראוי כדי להצביע על גרורות אפשריות. לאחר פרשנות MYCN ההטרוזיגוס בדגי LMO1, ותוך כדי מיון הצאצאים שלהם, ביטוי MYCN EGFP היה בולט בתאים העצביים הדופאמין שאינם PSNS ביום אחד לאחר ההפריה. לעומת זאת, הביטוי LMO1 היה בולט הן בתאי PSNS והן בתאים עצביים דופאמין שאינם PSNS.

גושי גידול חיוביים פלואורסצנטיים התגלו ברקמות באיברים, הרחק מאתר הגידול העיקרי בדגים מהונדסים מורכבים עם ביטוי יתר של MYCN ו- LMO1, אך לא בדגים מהונדסים עם הביטוי של MYCN בלבד. כתמי H&E של החלקים הכירורגיים מראים כי הגידול העיקרי נבע מאזור בלוטת יותרת הכליה הבין-יותרת הכליה, המקבילה של דגי הזברה של בלוטת יותרת הכליה האנושית שהיא האתר הנפוץ ביותר של המחלה העיקרית בחולה נוירובלסטומה. גושי גידולים רחוקים מבלוטת יותרת הכליה התגלו באזורים רבים, כולל החלק הדיסטלי של הכליה, המסלול, הזימים, הטחול והקיר הפנימי של תא הפרוזדורים של הלב.

שושלת נוירובלסט PSNS של תאים סרטניים בגידול העיקרי וכל האתרים גרורתיים אושרה. כמויות מוגברות באופן משמעותי ועובי מוגבר של סיבי קולגן מוכתמים PSR נמצאו גידולים MYCN LMO1 בהשוואה לגידולים המבטאים MYCN לבד. לאחר שימוש בהליך זה, ניתן ליישם סינון תרופות ובדיקת טיפולים חדשניים בסרטן, אשר עלול להוביל להתפתחות של סוכנים חלופיים כדי למנוע ולטפל בסרטן גרורתי.