מיקרו-הזרקה של תירס פלנטהופר, Peregrinus maidis, עוברים לעריכת גנום CRISPR/Cas9

עד כה, נעשה שימוש בקריספר רק בקומץ המיפטרנים. הפרוטוקול המתואר כאן יכול לסייע לחוקרים ליישם טרנספורמציה של קריספר ותאי נבט במינים אחרים של המיפטרן. פרוטוקול זה פותח במיוחד עבור עוברי חרקים הרגישים להתייבשות.

צעדים רבים בפרוטוקול עשויים לשפר את התוצאות במינים אחרים של חרקים. היכולת לייצר צמחים טרנסגניים פותחת את הדלת לשיטות בקרה חדשניות, כגון יצירת חרקים שאינם יכולים עוד להעביר וירוסים. טכניקה זו תהיה מהפכנית לחקר תפקוד גנים במזיקים אחרים, כגון תריפס הפרח המערבי.

התאמנו טכניקת CRISPR זו לעוברי תריפס עם תוצאות מבטיחות. אנו מוצאים כי תרגול במערכת זו חיוני להצלחה. השיטות המוצגות כאן, כאשר הן מבוצעות באופן שגרתי, אמורות לאפשר שימוש גמיש במגוון הגדרות.

כדי ליצור תא שיחזיק את החרקים הבוגרים Peregrinus maidis, חתכו חור בתחתית של אונקיה אחת והדביקו מסך מעל החור לצורך החלפת אוויר. לבחירת נקבות חרקים בוגרות בנות שבוע, שאפו את המושבה לתוך צינור חרוטי של 15 מיליליטר למשך שעה, לפני שתצננו לרגע את החרקים על קרח. זהה את הנקבות על ידי נוכחות של ovipositor, שהוא בדרך כלל כהה יותר משאר הבטן, בצד הגחוני של הבטן.

מעבירים את הנקבות לכוס בזמן שהן נאספות. לאחר שנבחרו 15 נקבות, אטמו את הכוס בחתיכה בגודל חמישה על חמישה סנטימטרים של סרט שעוות פרפין. מרחו 400 מיקרוליטר של תמיסת 10% סוכרוז על החלק העליון של היריעה, והניחו פיסת פילם שנייה בגודל חמישה על חמישה סנטימטרים מעל התמיסה.

מניחים את התא הבוגר על צלחת איסוף ביצים עם צד סרט שעוות פרפין מפלסטיק במגע ישיר עם מדיום האוביפוזיציה, ועוטפים את כל תא הטלת הביצים בניילון נצמד מבלי לכסות את חורי האוויר. לאחר מכן, הניחו את התא על 25 מעלות צלזיוס עם 70% לחות ומחזור אור של 14 שעות, 10 שעות חושך. לאיסוף עוברים, לאחר תקופת הטלת הביצים הרצויה, יש למרוח רצועה אחת על 15 מילימטר של סרט דו-צדדי על מכסה בגודל 22 על 30 מ"מ ולהניח את החלקת הכיסוי על תווך האוביפוזיציה של תא הטלת הביצים.

בעזרת מברשת עדינה ומיקרוסקופ מנתח, העבירו עוברים בודדים שקופים למחצה משטח האגר אל הסרט הדו-צדדי. לאחר שנבחרו כ-25 עוברים, סדרו את העוברים בצורת בננה בצידם כשהקצוות הגדולים יותר תקועים על סרט הדבק. למיקרו-הזרקה של העוברים, ראשית, הניחו את הכיסוי על צלחת פטרי בגודל 100 על 15 מיליליטר עם 1% אגר תחת מיקרוסקופ מנתח בתוך מכסה מנוע לח.

כדי לבדוק את לחץ ההזרקה, הניחו את קצה מחט הזרקת הקוורץ בטיפת מים והתחילו את מחזור ההזרקה. לאחר אישור הגדרת הלחץ, מתקרב מצד שמאל של תלוש הכיסוי, הכנס את המחט לקצה הגדול יותר של עובר אחד. העבירו את תמיסת ההזרקה לתוך הביצית ושלפו במהירות את המחט.

לאחר הזרקת כל הביצים, מניחים את הכיסוי על פני צלחת חדשה של 1% אגר ומניחים את התבשיל בתוך תא לחות. לאחר שישה ימים, השתמשו במים נקיים ובמברשת עדינה כדי להעביר את כל העוברים ששרדו לצלחת פטרי בגודל 35 על 10 מ"מ המכילה נייר פילטר לח במים. אוטמים את צלחת הפטרי בסרט שעוות פרפין מפלסטיק ומניחים את תא הבקיעה באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס.

לאחר שישה עד שמונה ימים, השתמשו במברשת עדינה כדי להעביר את כל הנימפות הראשונות לצלחת פטרי של גזירי עלים ואטמו את הצלחת בסרט שעוות פרפין מפלסטיק. לאחר 48 שעות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, השתמשו במברשת עדינה כדי להעביר את כל הנימפות בנות היומיים לכלוב גידול עם צמחי תירס. אם מזריקים עם פנוטיפ נראה לעין מתאוששים במספרים מספיקים, כלאו חרקים אלה בנפרד כדי למקסם את ההתאוששות של תכונת המטרה בדור הבא.

לגדל את החרקים בתנאי טמפרטורה ולחות מתאימים עם העברות קבועות לצמחי תירס טריים לפי הצורך, ולסנן את הצאצאים באופן קבוע עבור פנוטיפים צפויים, תוך הצבת פרטים המציגים את הפנוטיפ הרצוי בכלובים שלהם כדי ליצור קווים הומוזיגוטיים. בניתוח מייצג זה, נאספו בסך הכל 6, 483 ביצים מכלל 645 נקבות בארבעה שבועות. הנקבות בדרך כלל מתחילות להטיל ביצים לאחר יומיים ומספקות את רוב הביצים מהימים הרביעי עד השישי, כאשר פעילות הביציות מואטת עד היום התשיעי.

Cas9 תשע זריקות אינן משפיעות על התפתחות P.maidis, שכן שיעורי ההתפתחות של עוברים שטופלו בחיץ הזרקה, חיץ הזרקה בתוספת Cas9, וחיץ הזרקה בתוספת Cas9 ושלושה RNA מנחים, דומים. גם שיעורי הצוהר של פקדי החיץ וה-Cas9 דומים. עם זאת, שיעורי הבקיעה של פרטים המקבלים את תערובת שלושת המדריכים הם בדרך כלל נמוכים יחסית.

בניסוי מייצג זה, מתוך 71 פרטים שהתפתחו בהזרקת הנחיה, 23 הראו מידה מסוימת של אובדן פיגמנט ותשעה בקעו, מה שהביא לשיעור נוקאאוט של כ-30%. תמהיל שלושת המנחים צפוי להסיר כ-180 זוגות בסיסים מהלוקוס הלבן, כפי שנצפה בתוצרי ה-PCR המוגברים מ-DNA גנומי שבודד מפרטים מוזרקים, וכן בנתוני הרצף המשויכים המופקים ממוצרים אלה. אנו ממליצים על שימוש במחטים משופעות כדי למזער את טראומת ההזרקה. אם נראה שהעוברים דולפים לאחר ההזרקה, בדקו את קצות המחטים שלכם לקבלת תוצאות טובות יותר.

תרגול מתמשך יגדיל את הישרדות העובר. נכון להיום, אין פרסומים המתארים טרנספורמציה של קו הנבט בהמיפטרנים. עם זאת, השתמשנו בפרוטוקול זה כדי לייצר פלנטהופרים המבטאים Cas9.

בסך הכל, היכולת לבצע טרנספורמציה של קו הנבט בהמיפטרנים פותחת את הדלת למגוון רחב של אסטרטגיות הדברה גנטיות, ובכך מפחיתה את השימוש בקוטלי חרקים.