ניתוח כלל-גנומי של הפצת שינויים בהיסטון באמצעות שיטת רצף האימונו-הוצאה כרומטין במגנפורטה אוריזה

שיטה זו יכולה לעזור להדגיש את המנגנונים המולקולריים שבבסיס הרגולציה של גנים ממוקדים מועמדים באמצעות שינויים אפיגנטיים במהלך פתוגנזה פטרייתית בפתולוגיה של הצמח. טכנולוגיית ריצוף אימונופרציפיטציה של כרומטין יכולה לזהות ביעילות מקטעי דנ"א המקיימים אינטראקציה עם היסטונים וגורמי שעתוק בכל הגנום. בהשוואה לשיטות אחרות, זה יכול לשפר את היעילות והרזולוציה.

התחל על ידי הוספת 100 microliters של נוזל שלם בינוני צלחות אגר עגבניות שיבולת שועל באמצעות 100 pipette microliter. באמצעות לולאת חיסון, לגרד את התמצית של זן סוג הבר ואת זן נוקאאוט. לאסוף את פסולת התריסן ולהעביר אותם ל 250 מיליליטר של נוזל שלם בינוני.

לשטוף את hyphae פטרייתי עם 500 מיליליטר של 0.7 תמיסת נתרן כלורי טוחנת. ואז לאסוף את התבליUM פטרייתי ולשקול אותו. הוסיפו כמיליליטר אחד של תמיסת חמיצות אנזימי ליזה לכל גרם אחד של תפטיר פטרייתי.

מניחים את ההייפה לlicing ב 28 מעלות צלזיוס במשך שלוש עד ארבע שעות עם רועד ב 150 סל"ד. לשטוף את hyphae liced עם 50 מיליליטר של 0.7 תמיסת נתרן כלורי טוחנת. צנטריפוגה הדגימה ולהשליך את supernatant בזהירות.

להשעות מחדש את הפרוטופלסט ב 20 מיליליטר של 0.7 תמיסת נתרן כלורי טוחנת. הוסף 55 מיקרוליטרים של 37%פורמלדהיד טיפה על ידי טיפה לשני מיליליטר של מאגר נתרן כלורי המכיל protoplasts עבור cross-linking עד הריכוז הסופי הוא 1%כדי להרוות פורמלדהיד לא נטען, להוסיף 20 microliters של 10 פעמים גליצין לכל צינור. השליכו את הסופר-טבעי בזהירות לאחר הצנטריפוגה.

להשעות מחדש את הכדור במיליליטר אחד של תמיסת נתרן כלורי 0.7 טוחנת. השלך את supernatant בזהירות לאחר centrifugation ולהשעות מחדש את הכדור ב 750 microliters של חוצץ RIPA. יש להוסיף 37.5 מיקרוליטרים של מעכב פרוטאז פי 20.

לגזור את הכרומטין על ידי sonication במשך שמונה דקות באמצעות homogenizer קולי. לאחר המדגם נשבר באולטרסאונד, להוציא חלק מהדגימה כמו קלט המכיל את כל DNA וחלבון שוחרר לאחר המדגם הוא sonicated. כדי לנתח את אורך שברי הדנ"א, הפעל אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז 1% לאחר sonication.

לאחר צנטריפוגה, להעביר את supernatant צנטריפוגות צנטריפוגות לצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר ולאחסן אותו ב מינוס 80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר. לפני ביצוע ניסוי ה- IP, לדלל כל דגימת כרומטין ליחס של אחד עד 10 עם מאגר RIPA כפול. פיפטה 50 מיקרוליטרים של חרוזי חלבון סופר-פרמגנטיים לתוך צינור צנטריפוגה של שני מיליליטר.

מניחים את הצינורות על עמדה מגנטית ומניחים את החרוזים המגנטיים לזרז. ואז להסיר את supernatant. הוסף מיליליטר אחד של חיץ RIPA מקורר מראש פעם אחת לצינור ולשטוף חרוזי חלבון סופר פרמגנטי שלוש פעמים.

מניחים את הצינורות על מעמד מגנטי ומסירים את סופר-נט. הוסף 100 מיקרוליטרים של מאגר RIPA פעם אחת לכל צינור. הוסיפו לצינור 30 מיקרוליטרים של דגימת הכרומטין, 100 מיקרוליטרים של חרוזי חלבון סופר-פרמגנטיים וארבעה מיקרוליטרים של נוגדן H3K4me3, וערבבו אותם היטב.

מניחים את הדגימות על שייקר סיבובי כדי לדגור עליהם למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס ב 30 פעמים G.Wash נוגדן חרוז חלבון סופר פרמגנטי קומפלקס כרומטין על ידי שימוש חוזר החרוזים במיליליטר אחד של חיץ RIPA פעם אחת. לשטוף את המדגם עם מיליליטר אחד של מלח נמוך מלח מורכב לשטוף חוצץ, ולאחר מכן עם מיליליטר אחד של מלח גבוה קומפלקס לשטוף חוצץ. לשטוף את החרוזים עם מיליליטר אחד של חיץ ליתיום כלוריד ולהסיר את supernatant.

לאחר מכן הוסף מיליליטר אחד של מאגר TE לצינור. מניחים את הצינור שוב עם מיליליטר אחד של מאגר TE ולהסיר את supernatant עם pipette. הוסף 100 מיקרוליטרים של חוצץ אלוטיון לכל צינור צנטריפוגה.

בצע אלוטציה ב 65 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. צנטריפוגה לדקה אחת ב 10, 000 פעמים G בארבע מעלות צלזיוס ולאסוף את supernatant לתוך צינורות צנטריפוגות חדשים. הוסף שמונה מיקרוליטרים של חמישה נתרן כלורי טוחן לכל הצינורות ודגר ב 65 מעלות צלזיוס במשך ארבע עד חמש שעות או לילה כדי להפוך את חלבון ה- DNA cross-links.

מוסיפים מיקרוליטר אחד של Rnase A ודגרה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. מוסיפים ארבעה מיקרוליטרים של פרוטאינאז K לכל צינור ודגר ב 45 מעלות צלזיוס במשך שעה עד שעתיים. מוסיפים 550 מיקרוליטרים של תערובת כלורופורם כלורופורם פנאל ואיזואמיל לצינור הצנטריפוגה.

צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 10, 000 פעמים G ולשאת את supernatant. הוסף 1/10 נפח של פתרון אצטט נתרן טוחן שלוש, 2.5 כרכים של אתנול מוחלט ושלושה microliters של גליקוגן לצינור. מניחים את הדגימה במקרר ב-20 מעלות צלזיוס שליליות למשך הלילה למשפך.

למחרת, צנטריפוגות הצינורות ולהשליך את supernatant. לשטוף את הכדור שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של 75% אתנול מוכן טרי ב 10, 000 פעמים G.Add 50 microliters של מים deionized סטרילי כדי להמיס מספיק את המשקעים. תקן את קצות הדנ"א כדי ליצור דנ"א קהה באמצעות ערכת תיקון קצה DNA, והוראות המוזכרות בכתב היד של הטקסט.

כדי להוסיף בסיס אדנין לשלושת הקצוות העיקריים, הוסף 30 מיקרוליטרים של DNA, שני מיקרוליטרים של מים, חמישה מיקרוליטרים של חיץ טאק פי 10, 10 מיקרוליטרים של dATP מילימטרי אחד ושלושה מיקרוליטרים של פולימראז DNA טאק לצינור צנטריפוגה PCR מיקרוליטר 0.2. מערבבים אותם ומגיבים במכונת PCR ב 72 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. בצע קשירת קישור על ידי ערבוב 10 מיקרוליטרים של DNA, 9.9 מיקרוליטרים של מים, 2.5 מיקרוליטרים של חיץ ligase DNA T4, 0.1 מיקרוליטר של תערובת אוליגו מתאם, ו 2.5 מיקרוליטרים של ligase DNA T4 בצינור צנטריפוגה PCR מיקרוליטר 0.2.

לדגור על הצינור ב 16 מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות. כדי להגביר את הדנ"א באמצעות פריימרים PCR, להוסיף 10.5 microliters של DNA, 12.5 microliters של פעמיים גבוה נאמנות מאסטר תערובת. מיקרוליטר אחד של PCR פריימר PE 1.0 ומיקרוליטר אחד של פריימר PCR PE 2.0 לצינור צנטריפוגה PCR מיקרוליטר 0.2 ומערבבים היטב.

האותות H3K4me3 של מוברי2, mospp1 ו moswd2 מוטציות מחיקה ירדו באופן משמעותי באזורי היעד הפונקציונליים שלה. בהשוואה לזן מסוג הפרא P131, האותות של מועשר H3K4me3 chromatin immunoprecipitation קריאות רצף ב mobre2, mospp1 ו moswd2 מוטציות מחיקה ירדו במידה רבה. בעקבות הליך זה, ניתן לבצע שבב על שבב ושבב qPCR.

הם משמשים בדרך כלל כדי לסנן את הגן היעד במורד הזרם של חלבון וללמוד אינטראקציות DNA חלבון באתרי כריכת הגנום ידועים.