קונפוקלית לייזר סריקה מיקרוסקופיה מבוסס ניתוח כמותי של אספרגילוס פומיגטוס קונידיה ריאות עכבר נקי לחלוטין

הגישה שלנו מאפשרת לנו לבצע את הניתוח הכמותי של התפלגות אספרגילוס פומיגטוס קונידיה בריאת עכבר מנוקה אופטית בהר שלם. אספרגילוס פומיגאטוס קונידיה יכול לחדור למערכת הנשימה ולגרום למחלות מסכנות חיים בחולים אימונו-קום. דרכי הנשימה של היונקים היא מערכת של דרכי הנשימה של דורות שונים.

כל דור מאופיין במבנים שונים של קירות דרכי הנשימה ואוכלוסיות תאי החיסון. בענפי הסימפונות, אספרגילוס פומיגאטוס קונידיה יסולקו על ידי אישור רירית. עם זאת, בשטח הפנוי, הסיווג הרירי לא עובד וקונידיה חייבת להיות מנוקה על ידי תאי החיסון, כגון מקרופאגים מכתשיים ונויטרופילים.

כמו גם ההיבטים הזמניים המרחביים של התפלגות Conidia בנתיבי הנשימה חשובים. עם זאת, לא נחקר כראוי שאלה בהבנת מנגנוני המחלה. כאן אנו מציגים מערך ניסיוני לניתוח כמותי של הפצת אספרגילוס פומיגטוס קונידיה בנתיבי הנשימה של עכברים נגועים.

אני מורח 50 מיקרוליטרים של אספרגילוס פומיגטוס קונידיה על עכבר. שש שעות לאחר מכן, לקצור את הריאה. תקן לילה ב-2% פורמלדהיד וכתם עם תווית של סטרפטאבידין מצומדת.

ואז לחשוף את הדגימה לסליקה האופטית. מניחים את הדגימה בבקבוק הזכוכית המלא בתמיסת מי מתנול 50% ומניחים אותה על מערבל הדגימה בטמפרטורת החדר למשך שעה. החלף 50%מתנול עם 100%מתנול ולשים אותו מתחת למיקסר מדגם במשך שעתיים.

הכן תערובת המורכבת מאלכוהול בנזיל חלק אחד, ושני חלקים של בנזיל-בנזואט. מעבירים את הדגימה אליו 24 צלחת היטב ומכסים אותה בתערובת בנזיל-בנזואט במשך 30 דקות לפחות. הדגימה מוכנה להדמיה.

הנח את הדגימה על מחזיק הדגימה. ומניחים את המחזיק במיקרוסקופ. לאחר הפעלת מערכת המיקרוסקופ ופתיחת התוכנה, הפעל את נורית השידור ובחר מטרת X.

אתר באופן חזותי את הדגימה שלך ברמזור השידור והמשיך לכרטיסיה רכישה. בחר מצב מיקרוסקופיה לייזר קונפוקלית למבדה. תדליק את הלייזרים המתאימים.

הגדר את הטווח הספקטרלי של הגלאי ובחר את המראה הדיכרואית. התאם את רווח הגלאי וצמצם את חור הסיכה ליחידת אזור אחת. הגדר את רזולוציית הפיקסלים ל- 512 על 512.

הפעל את מצב מחסנית zed והתחל הדמיה חיה. מצא את מישור המוקד שבו שתי הקוביות גלויות. הרחיבו את החלונית zed-stack.

באמצעות גלגל המיקוד, מצא ובחר את המישורים הנמוכים והגבוהים ביותר של המדגם. מקם את מישור המוקד ליד תחתית המדגם. כבה את מצב מחסנית zed והגן את מצב הסריקה בחיוג.

במידת הצורך, התאם את מיקום X, Y ואת מספר האריחים. הפעל מצבי סריקת zed-stack וחיוג. הגדר את שלב חתך הזיד לחמישה מיקרונים.

הגדר את מהירות הסריקה. תתחילו בניסוי. ההדמיה אורכת בדרך כלל מספר שעות בהתאם לגודל הקרקע ומהירות הסריקה.

התמונה המתקבלת אינה מעורבת באופן ספקטרקטיבי. עבור ביטול ספקטרלי, השתמש באפשרות אי-חצייה ליניארית. בחר את האזורים המתאימים לשטחי הקרקע המסומנים בסטרפטבידין וקונידיה.

תתחיל להתיר את ההפחדה. לאחר ביטול ההמהה שמור את הקובץ הלא מעורב. כדי לתוחם אריחים מהתמונה המתקבלת, פתחו את התמונה.

בחר שיטות, תפירה גיאומטרית. בחר את התמונה בחלון הקלט. באפשרויות תפירה, בחרו באפשרות 'אריחי פלט ונתיך' חדשים.

השתמש במצב הפניה עם ערוץ נבחר המתאים לפלורסצנטיות דרכי הנשימה. פתחו את התמונה בתצוגת תלת-ממד עודפת. במידת הצורך, שנה צבעים המשמשים למצגת שלהם.

כאן אנו מציגים ערוץ דרכי הנשימה בגוונים אפורים ואת ערוץ Conidia בסגול. ליצירת מסיכת דרכי הנשימה, השתמשו בהוספת כלי משטח חדש. בחר ערוץ דרכי הנשימה ובחר את פרמטר ההחלקה של 10 מיקרון.

ניתן להשתמש במסננים שונים כדי לא לכלול אות דרכי הנשימה. ראשית, בדוק חזותית את פני השטח והגדר את סף העוצמה. מסננים נוספים, כמו שטח הפנים ניתן להחיל גם על דרכי הנשימה הנבחרות באופן בלעדי, אבל לא pleura או כלי דם.

לאחר מכן, מחק באופן ידני את שבר פני השטח שנבחר שאינו שייך לדיבי הנשימה. עכשיו אתה יכול להתבונן במשטח שנוצר ולחקור את החלקים החסרים כדי לתקן אותם מאוחר יותר. צרו מסיכה למשטח הנשימה באמצעות אפשרויות עריכה ומסווה של הכל.

בחר את ערוץ דרכי הנשימה והגדר תאי עבודה מחוץ לפני השטח ל- 0.001. כאן הראינו את המסכה המתקבלת בכתום. שמור ערוץ Conidia ומסכת דרכי הנשימה בשתי תיקיות נפרדות, כמו T של סדרת F.

פתח את הקובץ עם תמונת מסיכת דרכי הנשימה. הפוך את התמונה ל בינארית. בצע תהליך בינארי, הפוך בינארי.

כדי להידמות לעובי המסיכה, יש למרוח מספר פונקציות תלת-ממד מתרחבות. עקוב אחר תוספים, תהליך, להרחיב 3D. באפשרותך גם להשתמש בפונקציונליות פקודות מאקרו כדי לעשות זאת.

לאחר מספר מחזורים של תהליך התרחבות, השתמש בפונקציית חורי המילוי. בצע תהליך, בינארי, מילוי חורים. כדי למלא את שאריות החורים במסכה באופן ידני, פתח את אזור מנהל העניין.

עקוב אחר ניתוח, כלים, מנהל ROI. בעזרת הכלי בחירת מצולע בחר אזור שיש למלא בהקרנה מסוימת אחת. בצע זאת מספר פעמים עבור תחזיות מעטות בערימת zed, כך שתוכל לבצע אינטרפולציה של צורות של אזורי העניין.

כדי לבצע אינטרפולציה של הצורות הנבחרות, בחר את כולן ולחץ על עוד, אינטרפולציה של עלות עלה על 30. ואז למלא את כל ROIs עם לבן. השתמש בהליך חורי המילוי שוב.

כדי להרכיב מחדש את עובי המסיכה בחזרה לאחר מילוי החורים, יש למרוח את הפונקציה 3D השחוקה. עקוב אחר תוספים, תהליך, לשחוק 3D. אתה יכול גם להשתמש micros בשביל זה.

מספר האיטרציות ב- 3D ו- LA 3D צריך להיות שווה. הפעל את יישום ספירת קונידיה. לחץ על לחצן הוספת קבצים ובחר את התיקיות עם קבצי DIFF עם מסכת דרכי הנשימה המוכנות ותמונות פלואורסצנטיות Conidia.

הגדר סף מותאם אישית בין אפס לאחת. לחץ על אישור וראה את התוצאות. באמצעות גישה זו, אנו מבצעים את הניתוח הכמותי של הקונידיה בתוך ומחוץ לעץ הסימפונות של עכברים שש שעות לאחר יישום Conidia.

הנתונים מצביעים על כך שעל פי היישום המקורי שלנו, רוב Conidia לחדור את שטח alveola שהוקצה שם בתחילת התגובה החיסונית הדלקתית. הדמיה תלת מימדית של ריאות העכבר עם מיקרוסקופיה סריקת לייזר קונפוקל מאפשר זיהוי של אספרגילוס פומיגטוס קונידיה דרכי הנשימה. עיבוד של תמונות תלת מימדיות באמצעות פרוטוקול זה מאפשר לבצע ניתוח כמותי של התפלגות Conidia בתוך ומחוץ לענפי הסימפונות.

הגישה שלנו יכולה גם להיות מנוצלת כדי להעריך את הקינטיקה של חיסול Conidia מן הבריחים של עכברים ולהשוות התפלגות Conidia אנטומית בעכברים אימונונו-קומנטיים immunocompromised. בנוסף, באמצעות גישה זו, ניתן לנתח את ההתפלגות של חלקיקים או חלקיקי ננו agglomerates דרכי הנשימה.