Name: הקרנת פפטידים המפעילים MRGPRX2 באמצעות תאי HEK מהונדסים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: למד שיטה לסקר ספריות פפטידים המפעילים את קולטן MRGPRX2 בתאי HEK293 מהונדסים באמצעות מבחן סידן Fura-2. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי יעיל של ליגנדים ספציפיים לקולטן ומאיץ מחקר בתחום האימונולוגיה והתרופות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SR ו- LDU רוצים להכיר אלברטה Innovates פרויקט מחקר אסטרטגי, NRC, ו NSERC-דיסקברי מענק עבור פרויקט זה.

1. עיצוב ופיתוח של ספריית פפטיד
<ol><li>כדי לזהות את הליגנדים של קולטן MRGPRX2 של תא התורן בהתבסס על ליגנד ידוע כלומר, PAMP-1213, בצע את השלבים הבאים.<ol>
<li>צור ספריית פפטיד N-קטוע על ידי חיתוך שאריות חומצת האמינו N-terminal של ליגנד, ברצף, על ידי סינתזת פפטידים שלב מוצק (SPPS).</li>
		<li>צור ספריית פפטיד C-קיצר על ידי חיתוך שאריות חומצת אמינו C-מסוף של ליגנד ידוע, ברציפות, על ידי SPPS.</li>
		<li>בהתבסס על התוצאות של 1.1.1 ו- 1.1.2, צור ספריית פפטידים חתוכה N+C באמצעות SPPS על-ידי חיתוך השאריות הרצויות ממסוף N ו- C, בהתאמה.</li>
		<li>השתמש סינתזת פפטיד שלב מוצק לסנתז את הפפטידים13.</li>
		<li>שנה את N-terminal לקבוצה אצטיל (Ac) ו- C-terminal לקבוצה אמידים.</li>
		<li>לאפיין את הפפטיד על טוהרו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) ועל המסה באמצעות ספקטרופוטומטר מסה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כדי לחקור את המשמעות של חומצות אמינו ספציפיות בתוך מולקולת ה- PAMP-12 של האב, בצע את השלבים הבאים.<ol>
<li>צור ספריית פפטיד סריקת אלנין על ידי החלפת שאריות חומצת האמינו המתאימות במולקולת הפפטיד באלנין, אחת בכל פעם באמצעות SPPS. שנה את N-terminal לקבוצה אצטיל (Ac) ו- C-terminal לקבוצה אמידים.</li>
		<li>לאפיין את הפפטיד על טוהרו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה (HPLC) ועל המסה באמצעות ספקטרופוטומטר מסה. הערה: ודא כי פפטידים מסונתזים הם של טוהר גבוה. אפיינו את הפפטידים באמצעות ספקטרוסקופיית מסה ו-HPLC.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. בתרבית תאי במבחנה
<ol><li>תאי HEK-X2 ו- HEK-WT של תרבות על-ידי ביצוע השלבים שלהלן.<ol>
<li>הכן את המדיום של תרבות על ידי שכשהם DMEM גלוקוז גבוה עם סרום בקר עוברי 10%(FBS), 2 מ"מ L-גלוטמין, 100 U/mL של פניצילין ו 100 מיקרוגרם /mL של סטרפטומיצין.</li>
		<li>מעבר התאים בתרבית הרקמות (TC) טיפל T-75 תרבית בקבוקונים ולגדול באינקובטור ב 37 °C המכיל 5% CO2, עד שהם 75-80% confluent.</li>
		<li>פעם 75% confluent, לשטוף את התאים ולהוסיף 2-3 מ"ל של טריפסין במשך 2 - 3 דקות. דגירה באינקובטור 37 °C (5%), 5% CO2 כדי לנתק את התאים.</li>
		<li>לאחר שהתאים מנותקים, לאסוף את התאים טריפסין. מוסיפים 6-9 מ"ל של מדיום טרי.</li>
		<li>צנטריפוגות התאים ב 1620 x גרם במשך 3-5 דקות.</li>
		<li>לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant כדי לאסוף את הכדור. resuspend התאים במדיום תרבית טרי. לדלל את התאים לפי הריכוז הרצוי. הערה: תאי HEK הם תאים הגדלים במהירות ולכן למטב את תוספי התא בינוני. תאי HEK הם תאים חסידים; להעביר אותם בבקבוקי תרבות שטופלו TC כדי לתמוך בהידבקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכינו צלחת 96 באר לניסוי.<ol>
<li>הוסף 200 μL של השעיית התא בכל באר, עם ריכוז של 200,000 תאים / מ"ל, לזרוע 40,000 תאים / טוב.</li>
		<li>לגדל את התאים עבור 24 שעות ב 37 °C (5°F), 5% CO2 אינקובטור. הערה: מטב את צפיפות התא לבאר בהתבסס על גודל הצלחת וסוג המתח של התא. ערוך את הניסוי במשולשים בצלחת 96 שחורה שטופלו ב- TC עם תחתית שקופה שטוחה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. פיה-2 AM סידן
<ol><li>הכן צבע על-ידי ביצוע השלבים שלהלן.<ol>
<li>השתמש בצבע Fura-2 AM לניסוי.</li>
		<li>הכן את מאגר החיץ (HTB) של HEPES-Tyrode המכיל 25 מ"מ חיץ HEPES, 120 מ"מ NaCl, 5 mM KCl, 1 מ"ג / מ"ל גלוקוז, אלבומין סרום בקר מ"ג / מ"ל (BSA) ו- 1.8 מ"מ CaCl2 במים מעוקרים אוטומטיים.</li>
		<li>הוסף 50 μL של DMSO ב 50 מיקרוגרם פורה-2 בבוקר בון כדי להכין פתרון מלאי 1 mM של צבע Fura-2 AM. הוסף 1 μL של 1 mM Fura-2 AM צבע לכל mL של מדיום טרי כדי להכין את מדיום טעינת צבע בעל ריכוז צבע 1μM.</li>
		<li>מוציאים את צלחת 96 היטב מן האינקובטור להשליך את המדיום. החליפו את המדיום במדיום טעינת צבע טרי. הוסף 200 μL של צבע טעינה בינוני בכל באר. לדגור על התאים במשך 30-40 דקות ב 37 °C (5 °F), 5% CO2 אינקובטור.
</li>
		<li>לאחר 40 דקות של דגירה, להסיר את המדיום. לשטוף את התאים עם מאגר HTB. הוסף 100 μL של מאגר HTB לקריאת פלואורסצנטיות. קח את הצלחת לקריאת פלואורסצנטיות. הערה: מטב את ריכוז הצבע במדיום הטעינה של הצבע. דליפת צבע והלבנת תמונות הם חששות אפשריים הקשורים לצבע. הוסף CaCl2 טרי למאגר HTB כדי למנוע משקעים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הפעלת תאים וקריאה פלואורסצנטית
הערה: קורא לוחות פלואורסצנטיות עם מערכת צנרת אוטומטית מאפשר העברה אוטומטית של תרכובות ממקור מורכב לצלחת הבדיקה מבלי להוציא את הצלחת מקורא הלוחות.
<ol><li>בזמן שהתאים דוגרים, הגדר את קורא הלוחות.<ol>
<li>הגדר את הטמפרטורה ל 37 °C (7 °F).</li>
		<li>בהגדרות , בחר Flex.</li>
		<li>הגדר את מצב הקריאה לפלורסצנטיות ולקראה התחתונה.</li>
		<li>באורכי גל, הגדר את מספר אורכי הגל ל-2. הגדר את העירור ל- 340 ננומטר ו- 380 ננומטר. הגדר את הפליטה ל 510 ננומטר.</li>
		<li>השאר את הרגישות לברירת המחדל.</li>
		<li>בתזמון, הגדר את מרווח הזמן ל- 3.9 שניות. הגדר זמן ריצה ל- 94 s כדי לקבל 25 קריאות.</li>
		<li>לאחר מכן, בחר את סוג לוחית ה- Assay.</li>
		<li>לאחר מכן, בחר את הבאות לקריאה.</li>
		<li>בהעברה מורכבת, הגדר העברות ל- 1 ונפח התחלתי ל- 100 μL. הגדר את גובה הפיפטה ל- 100 μL, אמצעי אחסון ל- 50 μL ונקודת זמן ל- 36 s, כדי להוסיף את המתחם בקריאה העשירית.</li>
		<li>לאחר מכן, בחר את סוג לוחית המקור המורכב. </li>
		<li>השאר את Triturate ללא שימוש.</li>
		<li>בחר את העצות בפריסת עצות Pipette.</li>
		<li>עבור עמודות מורכבות ועמודות קצה, ודא שהתרכובות שיש להעביר נמצאות בעמודה 1 של הלוח המורכב. הגדר את עמודת העצות לעמודה 1 ולעמודה מורכבת ל- 1.</li>
		<li>השאר את הכיול האוטומטי כ- ON.</li>
		<li>לחץ על אישור.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כאשר הטמפרטורה הגיעה ל 37 °C (50 °F), לטעון את הצלחות לתוך קורא הלוחות.<ol>
<li>לחץ על תא הקריאה כדי להכניס את צלחת ה- Assay לקורא לוחותהפלואורסצנטיות .</li>
		<li>לחץ על המקור כדי לשים את הלוח המורכב. הכן את הלוח המורכב על ידי הוספת 200 μL של פפטידים בהתאמה, היונומיצין ואתילן גליקול-ביס (β-אמינואתיל אתר)-N,N,N′,N′-חומצה טטראצטית (EGTA)-טריטון X-100 פתרונות.</li>
		<li>לחץ על ארון התקשורת כדי למקם את תיבת העצים. השתמש בקצה שחור כדי למנוע פלואורסצנטיות טיפ.</li>
		<li>לאחר טעינת הלוחות, סקור את הגדרות התוכנה והקש קרא.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ניתוח נתונים
<ol><li>לקבוע את ריכוז הסידן מיחס הפלואורסצנטיות על ידי משוואת גרינקיביץ ' - <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62448/62448eq01.jpg"> כאשר, Kd הוא קבוע הניתוק של Fura-2 AM, R הוא יחס הפליטה לאחר עירור ב 340 ננומטר ו 380 ננומטר (F340 /F380) עבור פפטידים בהתאמה, Rmax הוא יחס פלואורסצנטיות מקסימלי שנצפו על ידי תוספת של 50 μL של 30 μM ionomycin, Rmin הוא פלואורסצנטיות מינימלית שנצפו על ידי תוספת של 50 μL של 100 mM EGTA / 2.5% טריטון X-100, ו- F380דקות ו- F380מקסימום הם עוצמת הפלואורסצנטיות המוחלטת של Fura-2 AM במצב ללא סידן וכבול, בהתאמה. הערה: המכונה מחלקת את הנוזל בכוח מסוים. אין להגדיר את גובה חלוקת הפפטיד קרוב מדי לתחתית הצלחת; זה עלול לנתק את התאים. השתמש בטיפים פיפטה שחורים כדי למנוע פלואורסצנטיות אוטומטית. קרא את הפלואורסצנטיות המרבית ואת הפלואורסצנטיות המינימלית לכל צלחת עבור כל ניסוי.</li>
</ol>

<ol><li>McNeil, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+mast-cell-specific+receptor+crucial+for+pseudo-allergic+drug+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions.</a> Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).</li>
<li>Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+Mas-related+G+protein-coupled+receptor+X2+on+mast+cell-mediated+host+defense%2C+pseudoallergic+drug+reactions%2C+and+chronic+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases.</a> Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).</li>
<li>Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation%2C+isolation%2C+and+maintenance+of+human+mast+cells+and+mast+cell+lines+derived+from+peripheral+blood+or+cord+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood.</a> Current protocols in immunology. , Chapter 7, Unit-7.37 (2010).</li>
<li>Thomas, P., Smart, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HEK293+cell+line%3A+A+vehicle+for+the+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacological+and+Toxicological+Methods%22%5BJournal%5D)">HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).</li>
<li>Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+yield+expression+of+recombinant+human+proteins+with+the+transient+transfection+of+HEK293+cells+in+suspension%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53568(2015).</li>
<li>Occhiuto, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+calcium+entry+via+STIM1+contributes+to+MRGPRX2+induced+mast+cell+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions.</a> Frontiers in Immunology. 10, 3143(2020).</li>
<li>Baba, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+function+for+the+calcium+sensor+STIM1+in+mast+cell+activation+and+anaphylactic+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses.</a> Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).</li>
<li>Hoth, M., Penner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+intracellular+calcium+stores+activates+a+calcium+current+in+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells.</a> Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).</li>
<li>Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+rapid+method+to+quantify+intraplatelet+calcium+dynamics+by+ratiometric+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry.</a> PLoS One. 10 (4), 0122527(2015).</li>
<li>Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Fura-2+for+measurements+of+cytosolic+free+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium.</a> Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).</li>
<li>Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fura-2+measurement+of+cytosolic+free+Ca2%2B+in+monolayers+and+suspensions+of+various+types+of+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells.</a> The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Generation+of+Ca2+%2B+Indicators+with+Greatly+Improved+Fluorescence+Properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembling+peptide+nanoscaffold+that+activates+human+mast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+and+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells.</a> ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).</li>
<li>Lansu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+silico+design+of+novel+probes+for+the+atypical+opioid+receptor+MRGPRX2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2.</a> Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).</li>
<li>Navinés-Ferrer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRGPRX2-mediated+mast+cell+response+to+drugs+used+in+perioperative+procedures+and+anaesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia.</a> Scientific Reports. 8 (1), 11628(2018).</li>
<li>Johnson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+of+store-operated+calcium+%28Ca+2%2B%29+entry+%28SOCE%29+in+HEK293+cells+using+Fura-2%5BTitle%5D)+AND+%22Calcium+Signalling%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2.</a> Calcium Signalling. , 163-172 (2019).</li>
<li>Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+340%2F380+nm+light-emitting+diode+illuminator+for+Fura-2+AM+ratiometric+Ca2%2B+imaging+of+live+cells+with+better+than+5+nM+precision%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision.</a> Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).</li>
</ol>

מחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

איתות סידן הוא מרכזי לפירוק תאי התורן והיה בשימוש נרחב במחקר של אינטראקציות קולטן-ליגנד, זיהוי ליגנד, וגילוי סמים14. MRGPRX2 הוא קולטן תא תורן שהתגלה לאחרונה ונמצא ממלא תפקיד מפתח במחלות דלקתיות רבות כמו גירוד, אסטמה, אטופיק דרמטיטיס, בין היתר2. יתר על כן, מספר תרופות שאושרו הוכחו לעורר תגובה דלקתית באמצעות קולטן MRGPRX215. לכן, חובה ללמוד את האינטראקציה עם קולטן ליגנד, לזהות ליגנדים חדשים ולהבין את מנגנון ההפעלה. מחקר זה מראה את השימוש בטכניקות פפטי...

תאי פיסט הם חלק בלתי נפרד ממערכת החיסון וממלאים תפקיד מכריע הן בתגובות חיסוניות מולדות והן בתגובות חיסוניות אדפטיביות. תאי פיסט מופעלים בעיקר על ידי כריכת אנטיגן לאימונוגלובולין E (IgE) - קומפלקס קולטני FcεRI, או על ידי קולטן G-חלבון הקשור ל- G-X2 (MRGPRX2)שהתגלהלאחרונה . הפעלת MRGPRX2 נקשרה למספר מחלות חיסוניות ודלקתיות, ולכן חשוב להבין את מנגנון המחייב של הקולטן לליגנדים2שלו . כדי לעשות זאת, ספרייה של מולקולות פפטיד קטנות פותחה והוקרנה נגד קולטני MRGPRX2 שהתבטאו יתר על המידה בתאי HEK. במחקר, ספריית הפפטיד נבנתה בטכניקות פשוטות ורב-תכליתיות של סריקת אלנין וגזמת חומצות אמינו. סריקת אלנין כרוכה בהחלפת חומצות אמינו ספציפיות בשאריות אלנין. אלנין להיות קטן ונייטרלי, מפשיט את הפפטיד של המאפיינים הספציפיים שהוענקו על ידי שאריות מוחלף ברצף מדגיש את המשמעות של המאפיינים הפיזיוכימיים בהתאמה של חומצת האמינו באינטראקציות קולטן. להיפך, ב truncation חומצת אמינו, רצפי פפטיד מתוכננים כך שהוא חסר אחד או יותר שאריות חומצת אמינו מן מסוף N-terminal, C, או שניהם. קבוצה זו של פפטידים שימשה לזיהוי רצפי חומצות האמינו החיוניים לכריכת MRGPRX2.
ניסיון עם קווי תאי פיסט אנושיים (LAD-2) הראה כי תאים אלה קשים לתרבות ולשמור במבחנה: זמן הכפלה של שבועיים, תוספי מזון בינוניים יקרים, ותשומת לב ישירה הנדרשת במהלך passaging3. תכונות אלה הופכות את התאים ללא מתאימים להקרנה בקנה מידה גדול של ליגנדים פוטנציאליים. בזאת, תאי HEK מהודבקים בייצוב המבטאים קולטן MRGPRX2 (HEK-X2) שימשו להקרנת ספריית הפפטיד1. תאי HEK-293 נמצאים בשימוש נרחב ונחקרים עבור הביטוי ההטרולוגי של קולטני פני השטח בשל יעילות ההדבקה הגבוהה שלהם, קצב הכפלה מהיר יותר, והצורך בתוספי מזון בינוניים לא יקרים להיות מתורבתים במעבדה4. הפרוטוקול כדי להעביר את קו התא HEK-293 הוכח והוא מבוסס היטב5. תאי HEK-293 המביעים ביציבות קולטן MRGPRX2 (מעבר 13-19) הופעלו עם הפפטידים שנוצרו באמצעות N-truncation, C-truncation, N + C-truncation, וסריקת אלנין1. תאי HEK מסוג פראי (HEK-WT) (מעבר 16-21) שימשו כפקד. שחרור סידן תאי בעת ההפעלה היה במעקב כדי ללמוד את ההפעלה מבוססת MRGPRX2.
הפעלת תאים על ידי MRGPRX2 מלווה בגיוס סידן ציטוטוסולי. שחרור סידן תאי מוסדר זה בתאי פיסט מוסדר על ידי הזנת סידן המופעלת על ידי החנות (SOCE), מתואם על ידי מולקולת אינטראקציה סטרומה 1 (STIM1); והוא מרכזי מפל התגובה החיסונית6,7. שיטות שונות שימשו כדי לזהות ריכוז סידן תאי, כולל מהדקי תיקון וצבעים פלואורסצנטיים8. מכל הטכניקות הזמינות, צבעי סידן פלואורומטריים בהטיה עם טכניקות זיהוי שונות נמצאים בשימוש נרחב9. שני סוגים של צבעים פלואורומטריים שצברו תחומי עניין הם כלומר, צבעי אורך גל יחידים כמו Fluo-4, וצבעים רציאליים באורך גל כפול כמו Indo -1 ו Fura-2. היתרון שצבעים רציוניים אורך גל כפולים מביאים על צבעי אורך גל יחיד הוא שהצבעים היחסיים נכונים לטעויות ניסיוניות כמו טעינת צבע, הלבנת תמונות ומיקוד10,11.
אצטטוקסימתיל אסתר (Fura-2 AM) הוא צבע מחלחל לירוק-פלואורסצנטי, אשר עירורו עובר לאורך גל נמוך יותר עם כריכת סידן. באופן ניסיוני, Fura-2 מתרגש ב 340 ו 380 ננומטר, בעוד הפליטה נרשמת ב 510 ננומטר. לאחר כריכת הסידן, עוצמת הפלואורסצנט ב-340 ננומטר עולה בעוד זו של 380 ננומטר פוחתת, כפי שמוצג באיור 1. הנתונים מיוצגים כיחס של עוצמת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב- 340 ננומטר (F340) לזה של עוצמה לאחר עירור ב- 380 ננומטר (F380) כלומר, F340/F380. יחס F340/F380 הוא פרופורציונלי לסידן תאי, אשר הערך של אשר ניתן לחשב על ידי משוואת Grynkiewicz12. מכיוון שאות הפלואורסצנטיות מתקבל מערעור הצבע בשני אורכי גל (340 ננומטר ו-380 ננומטר), היחס בין אותות הפלואורסצנטיות מתקן גורמים ניסיוניים כמו טעינת צבע, דליפת צבע, ליחתום תמונות וצפיפות תאים.

<table><tbody><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>793939</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג 96 באר</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>CLS3603</td><td></td></tr><tr><td>פוליסטירן שחור מיקרופלייט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>CLS3603</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>תרמו פישר</td><td>11995065</td><td>גלוקוז גבוה</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>תרמו Fischer</td><td>D12345</td><td>סטרילי, בדרגה ביולוגית</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Thermo Fischer</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>Flexstation 3</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td>FV06060</td><td></td></tr><tr><td>Fura-2 AM</td><td>Thermo Fischer</td><td>F1221</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>D8270</td><td></td></tr><tr><td>HEPES מאגר</td><td>תרמו פישר</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>יונומיצין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>I9657</td><td></td></tr><tr><td>L גלוטמין</td><td>תרמו פישר</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>עט סטרפטוקוקוס</td><td>תרמו פישר</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>פפטידים</td><td>RS Syntehsis</td><td>Custom</td><td>&ge; 95% טהור; מסוף N - קבוצת אצטיל מסוף C - קבוצת אמיד</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>12636</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>DOW</td><td>166704</td><td></td> כימי</tr></tbody></table>

הקרנת פפטידים המפעילים mrgprx2 באמצעות תאי hek מהונדסים

Screening Peptides that Activate MRGPRX2 using Engineered HEK Cells

זיהוי ליגנדים ספציפיים קולטני תאים משמעותיים מבחינה טיפולית הוא חיוני עבור יישומים רבים, כולל עיצוב ופיתוח של טיפולים חדשים. קולטן G-חלבון-X2 (MRGPRX2) הקשור ל-Mas הוא קולטן חשוב המווסת את הפעלת תאי התורן, ולכן מכוון את התגובה החיסונית הכללית. ליגנדים רבים עבור MRGPRX2 זוהו וכוללים פפטידים אנדוגניים כמו PAMPs, defensins, LL-37 ורסיסי חלבון אחרים (כלומר, אלבומין מושפל). זיהוי נוסף של ליגנדים ספציפיים MRGPRX2 דורש הקרנה של מספר רב של פפטידים (כלומר, ספריית פפטיד); עם זאת, תאי פיסט קשה ויקרים לתחזוקה במבחנה, ולכן, לא חסכוני להשתמש עבור הקרנת מספר גדול של מולקולות. המאמר הנוכחי מדגים שיטה לעיצוב, פיתוח ומסך של ספריה של מולקולות פפטיד קטנות באמצעות MRGPRX2 המבטאות תאי HEK. קו תא זה הוא קל יחסית וזול לתחזוקה וניתן להשתמש בו לניתוח תפוקה גבוהה במבחנה. צבע פלואורסצנטי רגיש לסידן Fura-2 לסימון שטף סידן תאי בעת ההפעלה שימש לניטור ההפעלה. היחס בין עוצמת הפלואורסצנטיות של Fura-2 ב 510 ננומטר נגד אורכי גל עירור של 340 ו 380 ננומטר שימש לחישוב ריכוז סידן. ספריית הפפטיד המשמשת לאימות מערכת זו התבססה על סוד ה- N-terminal 12 (PAMP-12) האנדוגני, הידוע כאגוגה של MRGPRX2 עם ספציפיות גבוהה וזיקה. פפטידים הבאים נוצרו באמצעות truncation חומצת אמינו וטכניקות סריקת אלנין להחיל PAMP-12. השיטה המתוארת כאן היא פשוטה וזולה אך חסון להקרנת ספרייה גדולה של תרכובות לזיהוי תחומים מחייבים ופרמטרים חשובים אחרים הממלאים תפקיד חשוב בהפעלת קולטן.

טבלה 1 מכילה את רצפי הפפטיד הנוצרים באמצעות טריון חומצות אמינו סופניות וסריקה אלנין. כפי שמוצג בטבלה 1, רצף פפטיד RKKWNKWALSR חסר פנילאלנין N-מסוף (F) ביחס להורה שלה PAMP-12 ולכן הוא פפטיד מייצג בספרייה N-קאט. באופן דומה, ב- FRKKWNKWALS, סרין מסוף C PAMP-12 הוסר, המייצג ספריית פפטיד חתוכה C המופקת מ- PAMP-12. בספריית הפפטידים N+C-חתוכה, חומצת אמינו הן ממסוף N והן ממסוף C מוסרות. השזגה של 4 חומצות אמינו ממסוף N ושאריות אחד ממסוף C של PAMP-12 גורמת ל-WNKWALS. ספריית פפטיד המופקת מסריקת אלנ...

טכניקות ליצירת ספרייה של פפטידים קצרים שיכולים להפעיל תאי פיסט באמצעות קולטן MRGPRX2 מתוארים. טכניקות הקשורות הן קלות, זולות, וניתן להרחיבן לקולטני תאים אחרים.

הקרנת פפטידים המפעילים MRGPRX2 באמצעות תאי HEK מהונדסים

Identifying ligands specific to therapeutically significant cell receptors is crucial for many applications, including the design and development of new ...

היום, אנו להדגים שיטה כדי לסנן ספריית פפטיד, נגד קולטן מאסטר שהתגלה לאחרונה, שהוא קולטן חלבון G הקשורים Mas X2, הידוע גם בשם קולטן MRGPRX2. תאי התורן הם חלק בלתי נפרד ממערכת החיסון, והם ממלאים תפקיד מכריע הן בתגובות חיסוניות מולדות והן בתגובות חיסוניות אדפטיביות. תאי פיסט מופעלים על ידי קולטן Fc אפסילון R1 הקשור לאנטיגן, או על ידי קולטן X2 שהתגלה לאחרונה.הפעלה של קולטן X2 כבול פני השטח, נקשרה למספר מחלות אימונולוגיות ודלקתיות ולכן חשוב להבין את המנגנון המחייב של קולטן זה לליגנדים שלו. כדי לעשות זאת, פיתחנו ספרייה של מולקולות פפטיד קטנות, והקרננו אותן כנגד קולטני X2 המובעים יתר על המידה על hexis. במחקר, ספריית פפטיד נבנתה בטכניקות פשוטות ורב-תכליתיות של סריקת אלנין, וחתכים בחומצות אמינו.Heck293 אומר, ביטוי קולטני X2 כאשר מופעל עם פפטידים ו hexis רחב סוג שימשו שליטה. בשחרור truncation בעת ההפעלה היה מנוטר כדי ללמוד את ההפעלה מבוססת X2. באופן ניסיוני, צבע רגיש לסידן Fura-2 AM מתרגש ב-340 ו-380 ננומטר, בעוד הפליטה נרשמת ב-510 ננומטר.לאחר כריכת סידן, עוצמת הפלואורסצנטיות ב 340 עולה, בעוד זה של 380 ננומטר, פוחתת. הצבע מופקד לאחר מכן ביחס של עוצמת הפלואורסצנטיות ב 340, לזה של 380 ננומטר. 340 של יחס 380, הוא פרופורציונלי לסידן תאי, הערך של זה, ניתן לחשב, על ידי משוואת Grynkiewicz.יחס הטאבינג של שתי עוצמות פלואורסצנטיות, השפעה של גורמים ניסיוניים כמו דילול, ליבון תמונות, דליפת צבע וצפיפות ריח מזוהים. אז, ללא דיחוי נוסף, בואו נתחיל את הניסוי. כדי לזהות את הליבנדות של קולטן MRGPR X2 של תא התורן, גנרטור N-קטוע, C-חתוך, וספריית הפפטידים N+C-קטוע, על-ידי חיתוך N-terminal, C-terminal וחומצות האמינו N+C-terminal של חוסר פרודוקטיביות של pam-12.השתמש סינתזת פפטיד שלב מוצק לסנתז את הפפטידים. שנה את מסוף הסיום לקבוצת גאות ושפל מוגדרת, ואת C-terminal כדי לעמוד בפני קבוצה. ליצור ואלנינים יכול ספריית פפטיד, על ידי החלפת חומצות האמינו בהתאמה של pam-12 על ידי אלנין, אחד בכל פעם.שנה את מסוף הסיום לקבוצת setide ואת C-terminal לקבוצה אמידים. הכן את המדיום של תרבית על ידי שכשהם DMEM גלוקוז גבוה, עם סרום בקר עוברי 10%, שני מילימולר L-גלוטמין, מאה יחידות לליטר של פניצילין, ומאה מיקרוגרם, לכל מ"ל של סטרפטומיצין. מלבד התאים בתרבית tee sue, 375 בקבוקון תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2, עד שהם 75 עד 80% במפגש.פעם 75%confluent, לשטוף את התאים ולהוסיף שניים עד שלושה מ"ל של Proof-C, כדי לנתק את התאים. לאחר שהתאים נותקו, אספו את התאים ב-Proof-C. מוסיפים בין 6 ל-9 מ"ל בינוני טרי.צנטריפוגות התאים ב 1620 גרם במשך שלוש עד חמש דקות. לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant כדי לאסוף את הכדור. resuspend התאים במדיום תרבית טרי.לדלל את התאים, לפי הריכוז הרצוי. ב 200 microliters של השעיית התא עם ריכוז של 200, 000 תאים, לשפוך את האמבון בכל באר לחפש 40, 000 תאים לבאר. שמור על התאים במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 אינקובטור.השתמש בצבע Fura-2 AM לניסוי. הוסף 50 מיקרוליטר DMSO ב 50 מיקרוגרם Fura-2 AM, כדי להכין פתרון סטארק מילימולרי אחד של צבע Fura-2 AM. הוסף מיקרוליטר אחד של צבע Fura-2 AM מילימולרי אחד לכל מ"ל של מדיום טרי כדי להכין את המדיום המדולל של ריכוז צבע מיקרומולרי אחד.מוציאים את הצלחת 96-well מן האינקובטור להשליך את המדיום. החליפו את המדיום במדיום דילול טרי. מוסיפים 200 מיקרוליטרים של מדיום דילול בכל באר.לדגור על התאים במשך 30-40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 אינקובטור. בזמן שהתאים דוגרים, קבעו את קורא הלוחות. הגדר את הטמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס.בהגדרות, בחר Flex. הגדר את מצב הקריאה לפלורסצנטיות ולקרואה תחתונה. באורכי גל, הגדר את מספר אורכי הגל לשניים.הגדר את העירור ל 340 ננומטר ו 380 ננומטר. הגדר את הפליטה ל 510 ננומטר. השאר את הרגישות לברירת מחדל.בתזמון, הגדר את מרווח הזמן ל- 3.9 שניות. הגדר את זמן הריצה ל- 94 שניות כדי לקבל 25 מספרי קריאות. לאחר מכן, בחר את סוג לוחית ה- Assay.לאחר מכן, בחר את הבאות לקריאה. ב-Compound Transfer, הגדר העברות לאחת, ואת נפח התחלתי למאה מיקרוליטרים. הגדר גובה פיפטה למאה מיקרוליטרים, נפח ל-50 מיקרוליטרים, ואת Time Point ל-36 שניות כדי להוסיף את התרכובת, ולטפל בקריאה.לאחר מכן, בחר את סוג לוחית המקור המורכב. השאר Triturate לא בשימוש. בחר את הפריסה עצות ועצות Pipette.עבור עמודות מורכבות ותן טיפים, המתחם יועבר בעמודה אחת מהצלחת המורכבת. הגדר את עמודת העצות לעמודה אחת ואת העמודה המורכבת לעמודה אחת. השאר את כיול אוטומטי ב- On.לחץ על אישור. לאחר 40 דקות של דגירה, להסיר את המדיום.לשטוף את התאים עם מאגר XDB. הוסף מאה מיקרוליטרים של מאגר XDB לקריאת פלואורסצנטיות. קח את הצלחת לקריאת פלואורסצנטיות.כאשר פריצ'ט הגיע ל-37 מעלות צלזיוס, לחץ על תא הקריאה, כדי להכניס את צלחת ההסתה לקורא לוחות הפלואורסצנטיות. לחץ על המקור כדי לשים את הצלחת המורכבת. הכן את הצלחת המורכבת על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של יונומיסין פפטידים מכובדים ו- EGTA כדי להפוך פתרונות X.לחץ על הקצה פראט כדי לשים את תיבת הקצה. השתמש בקצה שחור כדי למנוע פלואורסצנטיות טיפ. לאחר שהלוחות נשמרו, ואם אתה משתמש בהגדרות התוכנה ולחץ על קרא.קבע את ריכוז הסידן מיחס הפלואורסצנטיות על ידי משוואת גרינקיביץ'. מוצג נתוני הפלואורסצנטיות של פפטיד טוב פאם. כפי שניתן לראות, לאחר תוספת פפטיד ב 36 שניות, פלואורסצנטיות ב 340 ננומטר כי הוא פושר עולה על ידי זה של 380 ננומטר שיא פוחתת.הנתונים מיוצגים כיחס של 340, לזה של 380 אות. הם מראים את האותות עולה לאחר תוספת פפטיד. נתון זה הוא הנתונים הייצוגי להפעלת פפטיד.איור A מראה את אותות הפלואורסצנטיות להפעלה של פפטיד. נתונים מייצגים תואמים cram12 פפטיד נוספה לאחר יצירת בסיס עבור מחזורי אמצעי תשלום, כפי שמוצג על ידי ado. איור B מראה את היחס בין פליטת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב-340 ננומטר, לזה של פליטת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב-380 ננומטר.איור זה הוא הנתונים הייצוגי עבור הריק. איור א' מציג את אותות הפלואורסצנטיות עבור הריק. HTB נוספה לאחר דילול קו בסיס עבור 10 מחזורי הזנה כפי שמוצג על ידי ado.איור B מראה את הקצבה של פליטת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב 340 ננומטר לזה של פליטת פלורסנס לאחר עירור ב 380 ננומטר. נתון זה הוא הנתונים הייצוגיים עבור הסטנדרטים לכיול צבע. איור A מראה כי היונומיצין נוספה בקריאה העשירית, כפי שניתן לראות על ידי המהומה כדי לקבל פלואורסצנטיות מקסימלית במצב כבול במזומן.EGPA Triton X מאה נוספה לאחר 20 קריאות כפי שמוצג על ידי ado שמקבלים אות מינימום. איור B מראה את היחס בין פליטת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב-340 ננומטר לזה של פליטת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב-380 ננומטר. ערכים אלה נמצאים עוד יותר במשוואת Grynkiewicz כדי לקבל את המטמון התאי של ריכוז.איור זה מציג את האפיון של פפטיד נציג כדי לאשר את הרצף והטוהר. איור A מראה שהמסה האנכית של רצף הפפטיד הייצוגי WNK WAL הייתה 857.90 דילול צבע. אשר מוצג על ידי יחס N על Zed בספקטרוסקופיית מסה.איור B מראה טוהר פפטיד של 99%, כפי שאושר על-ידי HPLC. פפטיד זה שייך לספריית הפפטידים של N+C. לסיכום, השיטה המתוארת כאן היא קלה ורב-תכליתית אשר יכולה להיות יעילה ובהירה להקרנה מבוססת סידן בקנה מידה אחרון.עם זאת, ישנם מספר גורמים הקובעים את איכות הנתונים, ולכן, האיפור צריך להיות מותאם למערכת מכשירים סלולריים נתון. תודה.

screening-peptides-that-activate-mrgprx2-using-engineered-hek-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

כאן אנו להשתמש בספריית LentiPlex האנושי ונקווה המסורתית רצף שיטות לזיהוי מטרות הגן לקידום הישרדות התא. אנו מדגימים כיצד להגדיר deconvolute מסך LentiPlex ולאמת את התוצאות.

LentiPlex המשימה משולב הקרנת shRNA ספריית בתאי יונקים

אנחנו צריכים לשנות את השמרים קונבנציונאלי שני היברידית ההקרנה, כלי גנטי יעיל בזיהוי אינטראקציה חלבון. שינוי זה ניכר מקצרת את התהליך, מפחית את עומס העבודה, והכי חשוב, מפחיתה את מספר תוצאות חיוביות שגויות. בנוסף, גישה זו היא לשחזור ואמין.

השתנה שמרים-Two-Hybrid System כדי לזהות חלבונים אינטראקציה עם גורם הגדילה Progranulin

טכניקות כדי לנתח את המנגנונים בבסיס הפרשת הנף HIV-1 בexosomes מתוארות. פפטידים קצרים ספציפיים הנגזרים מהנף וtransfection החלבון נוצלו על מנת לקבוע את המבנה, תפקוד, ושותפים מחייבים של אזור שינוי ההפרשה של NEF. יש נהלים אלה רלוונטיות בכלל במחקרים מכניסטית רבים.

זיהוי של מוטיבים פונקציונליים והשותפים המחייבים מבוסס פפטיד

אנחנו גנטיים מקודדים את חומצת אמינו לא טבעית, p-azido-L-פנילאלנין בעמדות ממוקדות שונות בGPCRs ולהראות את הרבגוניות של קבוצת azido ביישומים שונים. אלה כוללים טכנולוגיה ממוקדת photocrosslinking לזהות שאריות בכיס מחייב ליגנד של GPCR, ושינוי bioorthogonal אתר ספציפי של GPCRs עם תג פפטיד epitope או בדיקה ניאון.

בדיקות מולקולריות גנטי מקודדות לחקר רצפטורים מצמידים חלבון G

אנו מתארים כאן מערכת ביטוי גרנזים חסכונית המשתמשת בתאי HEK293T המייצרת תפוקות גבוהות של פרוטאז טהור, מסוכרר לחלוטין ופעיל אנזימטית.

תשואה גבוהה ומערכת ביטוי עלות-יעילה של Granzymes האדם בתאי יונקים

אנחנו ניצור קשר עם סיכת ראש קטנה RNA (shRNA) ופרוטוקול הבא הדור המבוססת על רצף לזיהוי הרגולטורים האינקטיבציה שמושרש בקו תא מאתר עם גחלילית לוציפראז ומאוחדים. גנים עמידות hygromycin עם איזה CpG מחייב חלבון 2 ( MeCP2) גנים על כרומוזום ה-X לא פעיל.

במאגר shRNA מסך עבור הפעלה מחדש של MeCP2 על כרומוזום X לא פעיל

וזמינותו זריחה נתיישב מוצג כדי להעריך את היעילות של זוגות אמינו-acyl השומן-tRNA-המעביר/tRNA שילוב קאנונית-חומצות אמינו (ncAAs) לחלבונים מבוטא בתאי יונקים. היישום של ncAAs ללמוד G-חלבון בשילוב קולטנים (GPCRs) מתואר, כולל צילום-crosslinking מיפוי של איגוד אתרים ו bioorthogonal GPCR תיוג על תאים חיים.

אופטימיזציה של שיתוף גנטי של חומר כימי רגשים לתוך GPCRs עבור צילום-crosslinking מיפוי וכימיה Bioorthogonal בתאים בתרבית של חיה

בזאת, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לסינון פפטידים קטנים התאגד ל-FGFR2 באמצעות ספריית התצוגה הקטנה של phage. אנו לנתח עוד יותר את האהדה של הפפטידים שנבחרו כלפי FGFR2 בתוך מבחנה ויכולתה לדכא את תפוצת התאים.

הקרנה וזיהוי של פפטידים קטנים פילוח הצמיחה פיברוהפיצוץ מקדם Receptor2 באמצעות ספריית Phage התצוגה פפטיד

דו ח זה מתאר הקרנה של דטרגנטים שונים להכנת GPCR החזותית, הרודופסין ומתחם המורכב שלו עם mini-Go. השיטות הביוכימי המאפיינים את איכות הקומפלקס בשלבים שונים במהלך הטיהור מומחש. פרוטוקול זה ניתן להכליל למערכות חלבון ממברנה אחרים עבור המחקרים העתידיים שלהם במבנה.

הקרנה אסטרטגית ואפיון של הקומפלקס החזותי של החלבון GPCR-mini-G של התגבשות מוצלחת

כתב יד זה מתאר גישה מבוססת הגנום בקנה מידה מבוססי לזהות קולטן מסחטות-ליגניות ואינטראקציות.

זיהוי של פני שטח התא באמצעות הגנום בקנה מידה CRISPR/Cas9 מסכים גנטיים

בעבודה זו מתוארת בדיקה פלואורסצנטית של סידן תוך-תאי בעל תפוקה גבוהה עבור צלחות של 384 בארות לסינון ספריות מולקולות קטנות על קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי (GPCRs). המטרה, קולטן קינין מקרציית קדחת הבקר, Rhipicephalus microplus, מתבטאת בתאי CHO-K1. בדיקה זו מזהה אגוניסטים ואנטגוניסטים המשתמשים באותם תאים במבחן "תוספת כפולה" אחת.

בדיקת סידן פלואורסצנטית "דו-תוספת" לבדיקת תפוקה גבוהה של קולטנים מצומדים לחלבון G רקומביננטי

למד שיטה לסקר ספריות פפטידים המפעילים את קולטן MRGPRX2 בתאי HEK293 מהונדסים באמצעות מבחן סידן Fura-2. פרוטוקול זה מאפשר זיהוי יעיל של ליגנדים ספציפיים לקולטן ומאיץ מחקר בתחום האימונולוגיה והתרופות.

הקרנת פפטידים המפעילים MRGPRX2 באמצעות תאי HEK מהונדסים

גלה סרטונים נוספים