הקרנת פפטידים המפעילים MRGPRX2 באמצעות תאי HEK מהונדסים

היום, אנו להדגים שיטה כדי לסנן ספריית פפטיד, נגד קולטן מאסטר שהתגלה לאחרונה, שהוא קולטן חלבון G הקשורים Mas X2, הידוע גם בשם קולטן MRGPRX2. תאי התורן הם חלק בלתי נפרד ממערכת החיסון, והם ממלאים תפקיד מכריע הן בתגובות חיסוניות מולדות והן בתגובות חיסוניות אדפטיביות. תאי פיסט מופעלים על ידי קולטן Fc אפסילון R1 הקשור לאנטיגן, או על ידי קולטן X2 שהתגלה לאחרונה.

הפעלה של קולטן X2 כבול פני השטח, נקשרה למספר מחלות אימונולוגיות ודלקתיות ולכן חשוב להבין את המנגנון המחייב של קולטן זה לליגנדים שלו. כדי לעשות זאת, פיתחנו ספרייה של מולקולות פפטיד קטנות, והקרננו אותן כנגד קולטני X2 המובעים יתר על המידה על hexis. במחקר, ספריית פפטיד נבנתה בטכניקות פשוטות ורב-תכליתיות של סריקת אלנין, וחתכים בחומצות אמינו.

Heck293 אומר, ביטוי קולטני X2 כאשר מופעל עם פפטידים ו hexis רחב סוג שימשו שליטה. בשחרור truncation בעת ההפעלה היה מנוטר כדי ללמוד את ההפעלה מבוססת X2. באופן ניסיוני, צבע רגיש לסידן Fura-2 AM מתרגש ב-340 ו-380 ננומטר, בעוד הפליטה נרשמת ב-510 ננומטר.

לאחר כריכת סידן, עוצמת הפלואורסצנטיות ב 340 עולה, בעוד זה של 380 ננומטר, פוחתת. הצבע מופקד לאחר מכן ביחס של עוצמת הפלואורסצנטיות ב 340, לזה של 380 ננומטר. 340 של יחס 380, הוא פרופורציונלי לסידן תאי, הערך של זה, ניתן לחשב, על ידי משוואת Grynkiewicz.

יחס הטאבינג של שתי עוצמות פלואורסצנטיות, השפעה של גורמים ניסיוניים כמו דילול, ליבון תמונות, דליפת צבע וצפיפות ריח מזוהים. אז, ללא דיחוי נוסף, בואו נתחיל את הניסוי. כדי לזהות את הליבנדות של קולטן MRGPR X2 של תא התורן, גנרטור N-קטוע, C-חתוך, וספריית הפפטידים N+C-קטוע, על-ידי חיתוך N-terminal, C-terminal וחומצות האמינו N+C-terminal של חוסר פרודוקטיביות של pam-12.

השתמש סינתזת פפטיד שלב מוצק לסנתז את הפפטידים. שנה את מסוף הסיום לקבוצת גאות ושפל מוגדרת, ואת C-terminal כדי לעמוד בפני קבוצה. ליצור ואלנינים יכול ספריית פפטיד, על ידי החלפת חומצות האמינו בהתאמה של pam-12 על ידי אלנין, אחד בכל פעם.

שנה את מסוף הסיום לקבוצת setide ואת C-terminal לקבוצה אמידים. הכן את המדיום של תרבית על ידי שכשהם DMEM גלוקוז גבוה, עם סרום בקר עוברי 10%, שני מילימולר L-גלוטמין, מאה יחידות לליטר של פניצילין, ומאה מיקרוגרם, לכל מ"ל של סטרפטומיצין. מלבד התאים בתרבית tee sue, 375 בקבוקון תרבות ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2, עד שהם 75 עד 80% במפגש.

פעם 75%confluent, לשטוף את התאים ולהוסיף שניים עד שלושה מ"ל של Proof-C, כדי לנתק את התאים. לאחר שהתאים נותקו, אספו את התאים ב-Proof-C. מוסיפים בין 6 ל-9 מ"ל בינוני טרי.

צנטריפוגות התאים ב 1620 גרם במשך שלוש עד חמש דקות. לאחר צנטריפוגה, להשליך את supernatant כדי לאסוף את הכדור. resuspend התאים במדיום תרבית טרי.

לדלל את התאים, לפי הריכוז הרצוי. ב 200 microliters של השעיית התא עם ריכוז של 200, 000 תאים, לשפוך את האמבון בכל באר לחפש 40, 000 תאים לבאר. שמור על התאים במשך 24 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 אינקובטור.

השתמש בצבע Fura-2 AM לניסוי. הוסף 50 מיקרוליטר DMSO ב 50 מיקרוגרם Fura-2 AM, כדי להכין פתרון סטארק מילימולרי אחד של צבע Fura-2 AM. הוסף מיקרוליטר אחד של צבע Fura-2 AM מילימולרי אחד לכל מ"ל של מדיום טרי כדי להכין את המדיום המדולל של ריכוז צבע מיקרומולרי אחד.

מוציאים את הצלחת 96-well מן האינקובטור להשליך את המדיום. החליפו את המדיום במדיום דילול טרי. מוסיפים 200 מיקרוליטרים של מדיום דילול בכל באר.

לדגור על התאים במשך 30-40 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, 5%CO2 אינקובטור. בזמן שהתאים דוגרים, קבעו את קורא הלוחות. הגדר את הטמפרטורה ל 37 מעלות צלזיוס.

בהגדרות, בחר Flex. הגדר את מצב הקריאה לפלורסצנטיות ולקרואה תחתונה. באורכי גל, הגדר את מספר אורכי הגל לשניים.

הגדר את העירור ל 340 ננומטר ו 380 ננומטר. הגדר את הפליטה ל 510 ננומטר. השאר את הרגישות לברירת מחדל.

בתזמון, הגדר את מרווח הזמן ל- 3.9 שניות. הגדר את זמן הריצה ל- 94 שניות כדי לקבל 25 מספרי קריאות. לאחר מכן, בחר את סוג לוחית ה- Assay.

לאחר מכן, בחר את הבאות לקריאה. ב-Compound Transfer, הגדר העברות לאחת, ואת נפח התחלתי למאה מיקרוליטרים. הגדר גובה פיפטה למאה מיקרוליטרים, נפח ל-50 מיקרוליטרים, ואת Time Point ל-36 שניות כדי להוסיף את התרכובת, ולטפל בקריאה.

לאחר מכן, בחר את סוג לוחית המקור המורכב. השאר Triturate לא בשימוש. בחר את הפריסה עצות ועצות Pipette.

עבור עמודות מורכבות ותן טיפים, המתחם יועבר בעמודה אחת מהצלחת המורכבת. הגדר את עמודת העצות לעמודה אחת ואת העמודה המורכבת לעמודה אחת. השאר את כיול אוטומטי ב- On.לחץ על אישור. לאחר 40 דקות של דגירה, להסיר את המדיום.

לשטוף את התאים עם מאגר XDB. הוסף מאה מיקרוליטרים של מאגר XDB לקריאת פלואורסצנטיות. קח את הצלחת לקריאת פלואורסצנטיות.

כאשר פריצ'ט הגיע ל-37 מעלות צלזיוס, לחץ על תא הקריאה, כדי להכניס את צלחת ההסתה לקורא לוחות הפלואורסצנטיות. לחץ על המקור כדי לשים את הצלחת המורכבת. הכן את הצלחת המורכבת על ידי הוספת 200 מיקרוליטרים של יונומיסין פפטידים מכובדים ו- EGTA כדי להפוך פתרונות X.

לחץ על הקצה פראט כדי לשים את תיבת הקצה. השתמש בקצה שחור כדי למנוע פלואורסצנטיות טיפ. לאחר שהלוחות נשמרו, ואם אתה משתמש בהגדרות התוכנה ולחץ על קרא.

קבע את ריכוז הסידן מיחס הפלואורסצנטיות על ידי משוואת גרינקיביץ'. מוצג נתוני הפלואורסצנטיות של פפטיד טוב פאם. כפי שניתן לראות, לאחר תוספת פפטיד ב 36 שניות, פלואורסצנטיות ב 340 ננומטר כי הוא פושר עולה על ידי זה של 380 ננומטר שיא פוחתת.

הנתונים מיוצגים כיחס של 340, לזה של 380 אות. הם מראים את האותות עולה לאחר תוספת פפטיד. נתון זה הוא הנתונים הייצוגי להפעלת פפטיד.

איור A מראה את אותות הפלואורסצנטיות להפעלה של פפטיד. נתונים מייצגים תואמים cram12 פפטיד נוספה לאחר יצירת בסיס עבור מחזורי אמצעי תשלום, כפי שמוצג על ידי ado. איור B מראה את היחס בין פליטת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב-340 ננומטר, לזה של פליטת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב-380 ננומטר.

איור זה הוא הנתונים הייצוגי עבור הריק. איור א' מציג את אותות הפלואורסצנטיות עבור הריק. HTB נוספה לאחר דילול קו בסיס עבור 10 מחזורי הזנה כפי שמוצג על ידי ado.

איור B מראה את הקצבה של פליטת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב 340 ננומטר לזה של פליטת פלורסנס לאחר עירור ב 380 ננומטר. נתון זה הוא הנתונים הייצוגיים עבור הסטנדרטים לכיול צבע. איור A מראה כי היונומיצין נוספה בקריאה העשירית, כפי שניתן לראות על ידי המהומה כדי לקבל פלואורסצנטיות מקסימלית במצב כבול במזומן.

EGPA Triton X מאה נוספה לאחר 20 קריאות כפי שמוצג על ידי ado שמקבלים אות מינימום. איור B מראה את היחס בין פליטת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב-340 ננומטר לזה של פליטת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב-380 ננומטר. ערכים אלה נמצאים עוד יותר במשוואת Grynkiewicz כדי לקבל את המטמון התאי של ריכוז.

איור זה מציג את האפיון של פפטיד נציג כדי לאשר את הרצף והטוהר. איור A מראה שהמסה האנכית של רצף הפפטיד הייצוגי WNK WAL הייתה 857.90 דילול צבע. אשר מוצג על ידי יחס N על Zed בספקטרוסקופיית מסה.

איור B מראה טוהר פפטיד של 99%, כפי שאושר על-ידי HPLC. פפטיד זה שייך לספריית הפפטידים של N+C. לסיכום, השיטה המתוארת כאן היא קלה ורב-תכליתית אשר יכולה להיות יעילה ובהירה להקרנה מבוססת סידן בקנה מידה אחרון.

עם זאת, ישנם מספר גורמים הקובעים את איכות הנתונים, ולכן, האיפור צריך להיות מותאם למערכת מכשירים סלולריים נתון. תודה.