ניתוח של מיקרו-סביבה של הכבד במהלך התקדמות מוקדמת של קרצינומה הפטוצלולרית שאינה אלכוהולית הקשורה למחלת הכבד השומני בדגי זברה

במאמר זה אנו מציגים כיצד ליצור מודל של דגי זברה הקשורים למחלת כבד שומני שאינו אלכוהולי (NAFLD) כדי לחקור את ההשפעה של עודף כולסטרול על המיקרו-סביבה של הכבד ועל הנוף של תאי מערכת החיסון.

המודלים והפרוטוקולים של סרטן כבד דגי הזברה שלנו מספקים הזדמנות ייחודית לדמיין in vivo, באופן לא פולשני, את המיקרו-סביבה של הכבד ואת הנוף החיסוני באמצעות מיקרוסקופיה תוך-חיונית. השקיפות של זחלי דגי הזברה היא ללא ספק היתרון העיקרי של מערכת זו, המאפשרת לנו לבצע מיקרוסקופיה תוך-חיונית לא פולשנית ולקבל תובנה לגבי המיקרו-סביבה וחדירת תאי מערכת החיסון של רקמה ואיבר עמוקים, כגון כבד. המודל הנפרוטי שלנו הנגרם על ידי תזונה וטכניקות ההדמיה המתוארות בפרוטוקול זה יכולים בקלות להיות מיושמים על אינטראקציות תא מפותלות במחלות כבד אחרות או בתחומי מחקר, כולל תסמונת מטבולית ומחלות לב וכלי דם.

מי שידגימו את ההליך יהיו קאסיה מייקל, טכנאית המעבדה שלנו, וד"ר פרנסיסקו חואן מרטינז-נבארו, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלי. כדי להתחיל, שקלו ארבעה גרמים של דיאטת מזון יבש מסחרי עבור זחלי דגי זברה לשתי כוסות זכוכית של 25 מיליליטר, אחת לתזונה רגילה והשנייה לדיאטה עם 10% כולסטרול גבוה, או HCD. שוקלים 0.4 גרם כולסטרול בכוס זכוכית של 10 מיליליטר ומכסים את הכוס בנייר כסף.

במכסה אדים, מדוד חמישה מיליליטר של אתר דיאתיל באמצעות מזרק של 10 מיליליטר עם מחט של 20 מדים. לאחר מכן, הוסיפו את אתר הדיאתיל לכוס הדיאטה הרגילה ומיד ערבבו אותו עם המזון היבש באמצעות מרית. מדוד עוד חמישה מיליליטר של אתר דיאתיל באמצעות אותו מזרק ומחט והוסף אותו לכוס המכילה HCD.

מערבבים מיד על ידי שאיפה למעלה ולמטה עם המזרק. מוסיפים במהירות את תמיסת הכולסטרול לכוס ה-HCD ומערבבים אותה מיד עם מרית עד שהתמיסה אחידה. השאירו את הכוסות במכסה המנוע למשך עד 24 שעות כדי לאדות לחלוטין את אתר הדיאתיל.

למחרת, טוחנים את הדיאטות לחלקיקים עדינים באמצעות הדברה וטיט. מעבירים כל דיאטה לשקית ניילון קטנה ומסומנת או לצינור צנטריפוגה בקוטר 50 מיליליטר ומאחסנים אותם בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס. הגדר קווי דגים מהונדסים ביום מינוס אחד.

ביום האפס, אספו ביצים במסננת רשת לאחר שהדגים הושרצו. באמצעות בקבוק שטיפה עם E3, שטפו את הביצים ביסודיות והעבירו אותן בזהירות לכלי פטרי בקוטר 10 ס"מ עם מדיום E3. נקו את הצלחות מכל הפסולת שאולי הצטברה בתיבות הרבייה, כולל ביצים מתות או לא מופרות, כדי למנוע צמיחה בלתי מבוקרת של מיקרואורגניזמים ופגמים בהתפתחות הזחלים כתוצאה מכך.

לאחר מכן מחלקים את הביצים בצפיפות של 70 או 80 ביצים למנה המכילה 25 מיליליטר של E3. ביום הראשון, בדקו ונקו עוברים מתים או עוברים מתים עם פגמים התפתחותיים תחת היקף דיסקציה המצויד בבסיס טרנס-תאורה. ביום החמישי, ערבבו זחלים מכל הכלים בצלחת פטרי באורך 15 ס"מ והוסיפו E3 ללא מתילן כחול. מחלקים את הזחלים בתיבות ההאכלה ומאכילים אותם כמתואר בכתב היד של הטקסט.

שמור את הזחלים בחדר דגי הזברה או באינקובטור ב 28 מעלות צלזיוס במחזור אור כהה והאכיל אותם פעמיים ביום מיום 5 עד יום 12. הסר פסולת מזון מדי יום, כמו גם 90% עד 95% מהמדיום באמצעות מערכת ואקום המחוברת לקצה פיפטה של מיליליטר אחד. לאחר מכן, שפכו בזהירות את ה-E3 החדש ללא מתילן כחול לפינה אחת של תיבת ההאכלה כדי למנוע פגיעה בזחלים.

לחלופין, ניתן לחלק את הזחלים למכלים של שלושה ליטר עם מי מערכת ולהציב אותם כיחידת מערכת עצמאית עם זרימת מים נמוכה. חלופה זו חוסכת את הזמן הדרוש לתהליך הניקוי היומיומי, ומערכת הסינון מסייעת לשמור על בריאות הזחלים עד לנקודת הקצה. ביום ה-13 מכינים את מנות האיסוף בהתאם למספר תנאי הניסוי שהוצבו.

יוצקים מספיק E3 ללא מתילן כחול כדי לכסות את החלק התחתון של כל מנה. לאחר מכן, בזהירות, באמצעות מערכת ואקום, לשאוף את המים מן תיבות האכלה. כאשר מפלס המים מתחיל לרדת, הרימו באיטיות את תיבת ההזנה כדי לגרום לזחלים לשחות לאחת הפינות, ואז שאפו בכיוון ההפוך.

פעם נותרו רק כ -20 עד 30 מיליליטר של הנוזל, הכריזו בזהירות על הזחלים לתוך צלחת פטרי המוכנה לאוסף מוכן והניחו את הסרט המסומן מקופסת ההאכלה על מכסה המנה. בסטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי, מסננים את הזחלים המורדמים בחיפוש אחר סמנים פלואורסצנטיים רצויים. לאחר מכן הוסף tricaine E3 לתוך החדרים של מכשיר הפציעה והמלכודת.

הסר בועות אוויר מהתאים ומערוץ הריסון באמצעות מיקרופיפט P-200. הסר את כל הטריקיין E3 העודף, והשאיר רק נפח מספיק כדי למלא את התאים. לאחר מכן, להעביר זחלים מורדמים לתוך תא ההעמסה של מכשיר הפציעה והמלכודת ולמקם אותו להדמיה של האונה השמאלית באמצעות כלי ריסים.

דמיינו את המורפולוגיה של כל התאים הנדרשים בכבד תחת מיקרוסקופ קונפוקלי כמתואר בכתב היד של הטקסט. פתח את תוכנת פיג'י. לאחר מכן פתח את קובץ התמונה וסמן את פיצול ערוצים אפשרות מתוך אפשרויות ייבוא בפורמט ביו הכרטיסייה.

לאחר יצירת תחזיות בעוצמה מקסימלית לכל ערוץ, צרו ROI סביב כבד הזחל ומדדו את אזור הכבד. לאחר מכן, הוסף סרגל קנה מידה כהפניה וצור ROI שני הכולל את אזור הכבד ו-75 מיקרומטר של הסביבה. בתפריט תוספים, בחר באפשרות נתח ואחריה מונה תאים וספור את תאי החיסון בתוך אזור הגיוס.

תעד את מספר תאי מערכת החיסון שגויסו בגיליון אלקטרוני. חשב את צפיפות הנויטרופילים, המקרופאגים ותאי ה-T על-ידי נרמול מספר תאי מערכת החיסון לכל אזור בכבד. זחלי דגי זברה HCC הניזונים מתזונה רגילה אינם מראים סטאטוזיס בכבד, כפי שנמדד על ידי כתמי O אדומים בשמן.

עם זאת, זחלי HCC הניזונים מ-HCD מראים עלייה משמעותית בסטאטוזיס בכבד. לאחר שמונה ימים של חשיפה לעודף כולסטרול, נצפתה הגדלת הכבד בזחלי HCC. כדי להעריך hepatomegaly, אזור הכבד, שטח הכבד, ואת נפח הכבד העריכו.

ב- HCC שאינו קשור לסטאטוהפטיטיס, אזור ההפטוציטים, יחד עם האזור הגרעיני, והיחס הגרעיני-ציטופלסמי הוגדלו. ירידה משמעותית במעגליות הגרעינית נצפתה גם בקבוצת HCC הניזונה מתזונה עתירת שומן. באמצעות הסמן H2B-mCherry, זוהתה שכיחות גבוהה יותר של מיקרו-גרעינים בזחלי HCC הניזונים מ-HCD.

הערכת כלי הדם בכבד הראתה עלייה משמעותית בצפיפות כלי הדם בזחלי HCC הניזונים מ-HCD. חדירה של מקרופאגים ונויטרופילים התרחשה הן ב-HCC והן ב-HCC שניזונו מזחלי HCD. כימות הנויטרופילים במקרופאגים בכבד ובסביבתו הראה עלייה משמעותית במספר ובצפיפות התאים בזחלי HCC הניזונים מ-HCD.

לעומת זאת, נצפתה ירידה משמעותית בצפיפות תאי ה-T במספר הכולל בזחלי HCC שניזונו מ-HCD. ניקוי המיכלים וההזנה הם הצעדים החשובים ביותר כדי להבטיח את הכדאיות של הזחלים והימנעות מהתפתחות של סטאטוזיס או כבד ודלקת כרונית מערכתית בבקרות עקב איכות ירודה של המים או האכלה לא נכונה. ניתן לבצע שיטות אחרות כגון מיקרוסקופיה בהילוך מהיר וניתוח האינטראקציה בין התאים השונים המאכלסים את הכבד.

בנוסף, ניתן לבצע חיפוש RNA חד-תאי של כבדים מנותחים בשלבים שונים של סרטן הכבד כדי להבין באופן מלא כיצד הנוף החיסוני של הכבד מתפתח עם התקדמות המחלה.