היבטים מעשיים של הכנת מדגם והגדרת 1H R1ρ הרפיה ניסויים של RNA
9 ביולי 2021
אנו מציגים פרוטוקול למדידת דינמיקה מיקרו-אלפית השנייה על ספקטרוסקופיית RNA עם תווית N של 13C/15עם תווית N עם ספקטרוסקופיית פיזור הרפיה של 1H R1ρ. המוקד של פרוטוקול זה טמון הכנה מדגם טוהר גבוהה והגדרת ניסויי NMR.
פרוטוקול זה מתאר הכנת מדגם RNA והגדרת NMR למדידות פיזור הרפיה של פרוטון R1rho כדי לבחון חילופי אישור במולקולות RNA. מאז פרוטונים נחקרים, השיטה אינה זקוקה לתיוג איזוטופי ויכולה לגשת לתכונות מבניות כמו שיוך בסיס מוזז ישירות. הפיפטה היא מודולרית למדי במובן זה פיזור הרפיה R1rho ניתן למדוד גם אם המדגם מיוצר בשיטה אחרת.
התחל בהכנת דגימת הפלסמיד והקמת תגובת תמלול ויוחן ומחשוף כמתואר בכתב היד של הטקסט. לדגור על התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. ואז לדלל microliter אחד של המדגם פי עשרה בתמיסת טעינה.
ולהפעיל microliter אחד על ג'ל דף denaturing. אם תגובת המחשוף מוצלחת, שנה את קנה המידה של התגובה לנפח הרצוי והפעל אותו בן לילה. לאחר מכן הפעל ג'ל PAGE דנטורינג נוסף ולהעריך אם תגובת המחשוף הושלמה.
במקרה של מחשוף לא שלם, לחמם את פתרון התגובה במיקרוגל קונבנציונאלי ב 450 וואט במשך 15 שניות. ואז לקרר את הפתרון לאט ל 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות כדי לתזנות מחדש את הרנ"א ואת מדריך המחשוף. ושימו לב להיווצרות של משקעים חדשים.
הוסף עוד pyrophosphatase אנאורגני ו RNase H.Incubate התגובה במשך שעה עד שלוש שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן אשר את השלמת תגובת המחשוף עם דף denaturing. כאשר תגובת מחשוף RNase H הושלמה, להרוות את התגובה על ידי הוספת EDTA לריכוז סופי 50 מילימולר.
ומערבולת ביסודיות. סנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרון. ולרכז את הפתרון לאמצעי אחסון להזרקה למערכת HPLC לטיהור.
לפני הוספת המדגם המרוכז והמטוהר לצינור NMR, לנקות את הצינור על ידי שטיפה עם מים בשפע. ואז ריאגנט טיהור RNase, מים, ו 95%אתנול. לאחר השטיפה הסופית במים, להשאיר אותו לייבוש.
יש לשטוף את הבוכנה במים ולהשתמש במחיקה ללא מוך לניקוי עם טיהור RNase reagent ו-95%אתנול. לאחר ייבוש הצינור ואת הבוכנה, להוסיף 10% D2O לדגימת NMR. השתמש קצה פיפטה גדול כדי להעביר את דגימת ה- RNA לתוך צינור NMR, זורם אותו לאורך הצד של קיר הצינור.
הכנס את הבוכנה לתוך הצינור על ידי דחיפת אותו למטה עם תנועה פיתול מהירה כדי להסיר בועות אוויר, ולאחר מכן למשוך את הבוכנה למעלה לאט מבלי ליצור בועות אוויר חדשות. ולתקן את זה עם סרט שעווה פרפין. צור ערכת נתונים חדשה המבוססת על ערכת נתונים ארומטית של פחמן פרוטון HSQC המשמשת בדגימות RNA עם תוויות מלאות להקצאת RNA.
הגדר את הפרמטרים הכלליים ואת הפרמטרים הספציפיים RD. ואז להגדיר כוח נעילת ספין פרוטון ל 1.2 קילוהרץ לבדיקה. צור רשימת VD לבדיקה עם ערך אחד בלבד, אפס אלפיות שניה, הגדר את TDF1 לאחד ועדכן את D30 כדי להפעיל ספקטרום בדיקה.
לאחר הגדרת רשימת VD בדיקה, עדכן D30 ו- TDF1. ולתוות את עוצמת הפסגה לאורכים שונים של נעילת ספין. זהה את אורך נעילת הסיבוב שבו עוצמת השיא המקורי יורדת לשליש.
מהתוצאה של ריצות הבדיקה, צור את רשימת VD הסופית לשימוש בניסוי. בחר את מספר הסריקות כך שהשיא החלש ביותר ברשימה יהיה בעל יחס אות לרעש של 10 לפחות. התוצאות של מספר תגובות מחשוף של תמלילי טנדם מוצגים כאן.
RNA יעד נוקלאוטיד 20 נוצר בתגובה מוצלחת. תגובות לא מוצלחות גרמו למחשוף לא שלם ונכשל של המדגם. הזרקת HPLC של דגימת הרנ"א חשפה שיא עבור RNA מטרה טהורה ב 38 דקות.
בעוד מוצרים ארוכים וקצרים יותר הופרדו היטב משיא העניין. ניתוח סיכת הראש של הרנ"א הראה כי מספר הפרוטונים של האימינו שנצפו תאם את מספר הפרוטונים האימינו הצפויים מסימולציית מבנה משנית. ספקטרום הפחמן הפרוטוני HSQC של התהודה הארומטית של הרנ"א הראה ארבעה אותות לאחר הקיפול.
ורק שלושה אותות לפני הקיפול. בנציג על עקומות תהודה המתקבלים עבור שני אטומי H8 שונים ושני סיכות שיער RNA סינתטי שונים, G6H8 חווה חילופי אישור. בעוד A4H8 לא.
עבור G6H8, נבחרו כוחות נעילת הסיבוב הצבעוניים ונרשמו נתוני תהודה כבויים. במבנה CG שבו ההחלפה איטית, ערכי השורה R1rho לעומת חלקת היסט כבר הציגו א-סימטריה קלה של העקומה, המציינת את הסימן של הפרש השינוי הכימי דלתא אומגה. זה הופך להיות אפילו יותר ברור בעלילת R2 פלוס REX שבו תרומת R1 מוסרת.
מצד שני, מבנה GC חווה החלפה מהירה יותר וערכי R1rho לעומת חלקת היסט הציגו עקומה רחבה יותר שבה החילוץ של אומגה דלתא הופך פחות ברור אפילו בחלקת R2 פלוס REX. לאחר שהדינמיקה של הרנ"א התבהרה, ניתן לאפיין וללכד את המדינות. מצבים לכודים אלה יכולים, למשל, להיבדק בבדיקות ביולוגיות.
שיטה זו מאפשרת לנו להתבונן בשינויי זיווג בסיס פונקציונליים ורלוונטיים בקומפלקס מיקרו-רנ"א פעיל, סידורים מחדש של לולאות ברנ"א ריבוזומלי ויציבות זוג בסיס של בליטות נוקלאוטיד בודדות.
סקירה
פרוטוקול זה מתאר את הכנת דגימות RNA ואת ההגדרה למדידות פיזור הרפיה של פרוטונים R1ρ באמצעות ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR). הוא מתמקד בהכנת דגימות בטוהר גבוה לחקר חילופי קונפורמציה במולקולות RNA.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביוכימיה
- ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR)
רקע
- דינמיקה של RNA חיונית להבנת פונקציות מולקולריות.
- הרפיה של פרוטונים R1ρ מספקת תובנות לגבי שינויים קונפורמטיביים.
- דגימות RNA בטוהר גבוה חיוניות למדידות NMR מדויקות.
- השיטה מאפשרת תצפית ישירה של מאפיינים מבניים ללא תיוג איזוטופי.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול אמין להכנת דגימות RNA.
- להשתמש בספקטרוסקופיית NMR לחקר דינמיקה קונפורמטיבית של RNA.
- לשפר את ההבנה של אינטראקציות והיציבות של RNA.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- הכנת דגימות פלסמיד ותמלול in vitro.
- ניתוח ג'ל PAGE מפורר כדי לאשר תגובות חיתוך.
- טיהור דגימות RNA באמצעות HPLC לפני ניתוח NMR.
- מדידת פיזור הרפיה של R1ρ כדי להעריך חילופי קונפורמציה.
תוצאות עיקריות
- ייצור מוצלח של RNA יעד עם חיתוך מאושר.
- זיהוי של חילופי קונפורמציה במבנים מסוימים של RNA.
- תצפית על אותות NMR שונים המתאימים למצבי קיפול של RNA.
- אפיון של דינמיקה של RNA והשלכות ביולוגיות פוטנציאליות.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר ניתוח מפורט של דינמיקה של RNA.
- הממצאים תורמים להבנת תפקידו של RNA בתהליכים ביולוגיים.
- יישומים עתידיים עשויים לכלול בדיקת אינטראקציות של RNA בתמרונים ביולוגיים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Direct measurement of RNA conformational dynamics using 1H R1ρ relaxation dispersion NMR enables atomic-resolution insight into transient structural states critical for RNA function. This capability addresses a key discovery-stage challenge by revealing dynamic states inaccessible to most structural methods, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. The protocol's modularity and compatibility with both labeled and unlabeled RNA samples enhance its portfolio relevance for early-stage biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of RNA conformational dynamics underlying functional mechanisms.
- Supports biological de-risking by directly observing base-pairing shifts and transient states.
- Facilitates predictive confidence in RNA-targeted therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Prepares high-purity RNA samples suitable for quantitative NMR-based assays.
- Standardizes sample preparation and NMR setup for reproducible, scalable workflows.
- Delivers quantitative readouts of exchange rates and population distributions for downstream screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns atomic-level RNA dynamics with disease-relevant structural transitions when applicable.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by characterizing functionally relevant RNA states.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on mechanistic insight into RNA behavior.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing to preclinical model development, providing a reusable platform for RNA structural analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by revealing hidden RNA conformational states.
- Screening: Ensures assay readiness and reproducibility through standardized sample and NMR preparation.
- Analytics: Provides quantitative measurements of exchange rates, populations, and secondary structure changes.
- Translational Research: Connects atomic-resolution RNA dynamics to functional and disease-relevant outcomes when supported by data.
- Enterprise Reuse: Offers a modular workflow adaptable to various RNA constructs and production methods.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in RNA-targeted programs.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable sample preparation and NMR workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early detection of functional RNA states.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of RNA-targeted assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA biochemistry and NMR spectroscopy for optimal execution.
- Needs access to high-field NMR instrumentation and analytical infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample handling and data analysis.
- Adaptable to both isotopically labeled and unlabeled RNA, increasing flexibility across model systems.
- Sample purity and concentration are critical for reliable quantitative outputs.
