Name: היבטים מעשיים של הכנת מדגם והגדרת 1H R1ρ הרפיה ניסויים של RNA (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: למד הכנת מדגמי RNA וניסויי NMR מסוג R1rho להפצת הרפיה בפרוטונים לחקירת דינמיקה מבנית במולקולות RNA. השיטה מאפשרת תצפית ישירה בשינויים בזיווג בסיסים ברזולוציה אטומית ללא צורך בסימון איזוטופי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים למתקן למדע החלבון (PSF) במכון קרולינסקה על ביטוי וטיהור של T7 RNA פולימראז ו- E. coli RNase H, מרטין האלברג על המתנה הנדיבה של הפוספטאז האנאורגני, ועל פטזולאב כולו לדיונים חשובים. אנו מודים ללוקה רטינו על הכנת מבני U-בליטה ואמילי שטיינר וקרוליינה פונטנה על תרומתם לפקודות מאקרו ותסריטים מתאימים. אנו מכירים במכון קרולינסקה ובחטיבה לביוכימיה רפואית וביופיזיקה לתמיכה ברכישת ספקטרומטר 600 מגה-הרץ ומימון פוזיציות (KI FoAss ו-KID 2-3707/2013). אנו אסירי תודה על התרומה הכספית של Vetenskapsrådet (#2014-4303), Stiftelsen för strategisk Forskning (ICA14-0023 ו- FFL15-0178) ורגנאר סודרברג סטיפלסה (M91-14), הארלד אוק גרטה ג'ינסון סטיפלסה ((באנגלית: Ragnar Söderberg Stiftelse) JS20140009), קרל טריגרס סטיפלסה (CTS14-383 ו-15-383), אווה אוק אוסקר ארנס סטיפלסה, אקה ויברג סטיפלסה (467080968 ו-M14-0109), Cancerfonden (CAN 2015/388), J.S. מכיר במימון באמצעות מארי Skłodowska-Curie אם (האיחוד האירופי H2020, פרויקט מס' 747446 של MSCA-IF).

K.P. הוא יועץ Arrakis Therapeutics, חברה המגלה מולקולות קטנות מיקוד RNA.

הפרוטוקול המוצג כאן הוא סינתזה של מספר פרוטוקולים שפורסמו בעבר בצורה של מאמרי מחקר10,20,21,31. לפיכך, ניתן להחיל מקטעים של הפרוטוקול, בעוד שאחרים יכולים להיות מוחלפים להעדפת הקורא. לדוגמה, ניתן לבצע את מדידות R1ρ על דגימת RNA המיוצרת בכל שיטה, בהתחשב בכך שקיפול והומוגניות של אורך מניחים. יתר על כן, הפרוטוקול אינו מכיל מידע על הקצאת תהודה של רצף RNA - צעד הנדרש לניסויי RD - שכן זה כוסה בהרחבה בספרותהקודמת 19,37,38. תוכניות תיוג חלקיות, מגזריות או ספציפיות לאתר36,41,42,43,44 הן גישות כדי להקל על הקצאת תהודה או להפחית את החפיפה של תהודה כי הם עניין בניסויי מו"פ תוארו באריכות בספרות. שיטה זו מאפשרת שימוש בתיוג אחיד של כל זהות נוקלאוטיד, אשר כבר יכול לפשט את הקצאת התהודה באופן משמעותי.
שיטת ה- IVT המוצגת כאן מתגברת על בעיות ידועות עם רצפים ותיוג, מגדילה את התשואה ומקטינה את העלות ואת זמן העבודה בהשוואה לשיטות אחרות. השימוש ברצף החניכה הנגיפי מפחית את הצורך באופטימיזציה של תגובה, שהיא בעיה ידועה בתחום שיכולה לגזול זמן רב לביצועים ומניבה רק עותקים מעטים של התמליל במקרה של חניכה שאינה G. מחשוף T7 IVT ו- RNase H של תעתיק הטנדם יכול להתבצע בו זמנית באותו כלי. דפוס של חזרות דו-מושביות רב-מרתיות ניתן לראות על ג'ל PAGE מתמתק במהלך התגובה, המתמזג לפס אחד על הרנ"א היעד עם השלמת תגובת RNase H(איור 3A,נתיבים 1 ו- 2b). תשואות אופייניות בשיטה זו נעות בין RNA של 30 ל- 70 ננומטר לכל 1 מ"ל IVT. עם זאת, השיטה המבוססת על מחשוף RNase H של חזרות טנדם אינה באה ללא בעיות מסוימות משלה. תגובת מחשוף RNase H לעתים קרובות אינה יורדת להשלמה כאשר היא פועלת בו זמנית עם תמלול T7(איור 3A,נתיב 2a).
ניתן להשלים את ההפרדה בין יחידות טנדם על ידי חישול מדריך המחשוף לתעתיק והוספת RNase H(איור 3A,נתיב 2b, שלב 2.1.2). כמו חימום של כמויות גדולות הוא איטי ומוביל Mg2 +- מזורז הידרוליזה של RNA, מיקרוגל קונבנציונאלי שימש, אשר מחמם את המדגם כדי >95 °C (55 °F) ב 10-15 s. תופעות לוואי על הדגימות המיוצרות לא נצפו עד כה. מבנים מסוימים מראים רצועה שנייה קטנה שלא ניתן היה לבטלה על ידי אופטימיזציה של תנאי התגובה(איור 3A, נתיב 4). בדרך כלל אלה נראים בבירור ככתף בכרומטוגרמה של HPLC, אם נעשה שימוש בשיפוע אלוטציה ממוטב היטב, וניתן להסיר אותם (שלב 2.2.5). הדיון הבא נועד להדגיש צעדים קריטיים בפרוטוקול, במיוחד בכל הנוגע להשגת נתונים באיכות גבוהה המאפשרים פרשנות של דינמיקה קונפורמיאלית.
זיהום RNase RNases חוץ תאיים נמצאים בכל מקום, יציב מאוד, ומהווים את האיום הגדול ביותר ליציבות ארוכת טווח של דגימות NMR. לכן, זה חיוני לעבוד בסביבה ללא RNase ולשמור על כל ריאגנטים ותוכנות פלסטיק RNase ללא. מומלץ להשתמש בטיפים לסינון ואולי אפילו במסות פנים. הדבר חשוב במיוחד לאחר טיהור HPLC. דגימות NMR מזוהמות עם RNases בדרך כלל להציג פסגות צרות גלויות ספקטרום 1H-1D לאחר ימים או שבועות עקב מוצרי השפלה נוקלאוטיד יחיד. מדגם כזה אינו מתאים למדידות R1ρ. 
דגימת NMR בשל אופיו הטעון מאוד, ניתן להשתמש ב- RNA בריכוזים גבוהים ללא משקעים בהשוואה לרוב החלבונים. השימוש בצינורות שיגמי NMR (ראה טבלת החומרים) הוא יתרון שכן הם מאפשרים ריכוז המדגם המרוכז ביותר במרכז סליל תוך מתן תנאי שיימינג ונעילה אידיאליים בשל תחתית הזכוכית הבוכנה תואמת הרגישות ואת הבוכנה. בדרך זו, B1-inhomogeneity מצטמצם, מה שמוליד קווים צרים יותר. נפח המדגם הטיפוסי בצינור NMR הוא 250 μL, וריכוז טיפוסי הוא 1-2 mM. דגימות מתחת 500 מיקרומטר אינן מומלצות לניסויי מו"פ מכיוון שהניסוי ייקח יותר מדי זמן ו- shim טוב. באופן דומה, נפח מדגם מתחת 200 μL אינו מומלץ כי שיים טוב ויציבות שדה (מנעול) נדרש. בעת החדרת הבוכנה, חשוב להימנע מהיווצרות בועות במדגם (שלב 2.4.5). אם לא קבוע כראוי, הבוכנה יכולה להחליק למטה לתוך המדגם, הפחתת עוצמת הקול הניתן לזיהוי. יתר על כן, שינויים מהירים בטמפרטורה יכולים להוביל להיווצרות של בועות חדשות במדגם. לכן, יש לנקוט זהירות בעת הובלת המדגם וכאשר משנים את טמפרטורת הבדיקה בספקטרומטר NMR. בדוק את המדגם עבור בועות בעת מדידה שוב לאחר תקופה ארוכה יותר.
קיפול RNA מולקולות RNA דינמיות יכולות להתקיים בקונפורציות מרובות כאשר הן אינן מקופלות כראוי. למרות שטמפרטורות ההיתוך של מבנים משניים יכולות להיות רק מעט מעל טמפרטורת החדר, מומלץ הליך חימום וקירור יסודי לפני המדידה. דגימות סיכת ראש מרוכזות במיוחד המתקפלות תחת שליטה קינטית (חימום וקירור הצמדה) יכולות ליצור הומודימרים לאורך זמן, מה שמחייב שליטה קפדנית בקיפול RNA לפני כל מדידת NMR. אם הרנ"א הנמדד אינו מבנה סיכת ראש אלא דופלקס RNA, יש להחיל קיפול איטי תחת שליטה תרמודינמית.
במקרה זה, תהליך הקירור לאחר החימום צריך להיות בטווח של שעות, בעוד RNA משמש בנפח הסופי שלה וריכוז במדגם NMR. ספירה ראשונית של תהודה אימונית וארומטית צפויה יכולה לספק תובנה על ההומוגניות של המדגם. אם המדגם לא נראה כמו צפוי, זה צריך להיות מקופל מחדש. מ"ג2+ (נוסף כמלח כלוריד) יכול לעזור עם קיפול מבני RNA45. בפועל, בקרת הקיפול משמשת כהשוואה לדגימה ששימשה לפחות באופן חלקי להקצאת תהודה של NMR ולפתור את המבנה המשני באופן ניסיוני.
ספין נעילת שיקולי חשמל וחימום במקרה של הפעלת ניסויי 1H R1ρ RD כניסויים סקירה 2D, כוח SL צריך להיות לא פחות מ 1.2 kHz. תדר משדר גלי הרדיו צריך להיות ממוקם באמצע אזור ppm של פסגות עניין (למשל .,7.5 ppm עבור פרוטונים ארומטיים). רוחב הפס של 1.2 קילו-הרץ יהיה גדול מספיק כדי לנעול פרוטונים אלה ללא אפקטים גדולים מחוץ לתהודה. אפקטים כאלה ניתן לזהות בפרופיל RD. אם הם מתרחשים, ערכי R2+REX גדלים במקום להקטין עם הגדלת ערכי צריכת החשמל של SL, במיוחד עבור צריכת SL נמוכה. בדוק אם ערכי צריכת החשמל המחושב של SL תואמים לצרימת החשמל המועברת לדגימה. בפועל, כוח SL מחושב יכול לשמש אם הדופק הקשה 1H 90° היה מכויל בקפידה על ספקטרומטרים חדשים יותר; עם זאת, ניתן לבדוק זאת על-ידי כיול עוצמת SL עבור כל רוחב פס רצוי.
טווח ההספק של SL, אשר ניתן להשתמש בניסויי RD H R1ρ הוא רחב מאוד, המוביל לחימום מדגם משתנה (1.2 kHz עד 15 kHz עבור HSQC עבור רצפים מבוססי HCP ו 50 הרץ עד 15 kHz לניסויי SELOPE). חימום מדגם לא שוויוני ניתן לזהות כשינוי קל בשינוי כימי בעת השוואת 1Ds המתקבל עבור SLs בהספק נמוך לעומת. אס.אל. השפעה זו בדרך כלל אינה נחשבת פיצויי חום בניסויי R1ρ על heteronuclei. פיצוי חום בניסויים אלה מוגדר בדרך כלל כדי לתקן עבור חימום שונה בשל משכי נעילת ספין שונים שצוינו ברשימת vd של כל סדרת כוח נעילת ספין. במיוחד עבור ניסוי SELOPE, פיצוי חום שני צריך לשמש על פני כל נקודות החוזק SL החלות כפי שתואר ב20.
שיקולי רשימת vd כפי שהוזכר קודם לכן, רשימת VD צריך להכיל נקודת זמן מספיק זמן כדי להשיג ריקבון משמעותי של אינטנסיביות (באופן אידיאלי עד 30% של האות הראשוני, או נמוך ככל האפשר אם לא ניתן להגיע 70% ריקבון בתוך המפרט של הבדיקה). למרות שרשימת VD הייתה ממוטבת עבור הספק SL נמוך (1.2 kHz), רשימת vd זו צריכה להיבדק גם בהספק SL הגבוה ביותר לשימוש (למשל., 15 kHz). זאת בשל העובדה, כי עבור פסגות עם תרומת REX משמעותית, הריקבון יהיה הרבה יותר איטי בעוצמה SL גבוהה. אז ריקבון מספיק צריך להיות מאומת גם בעוצמה SL גבוהה. אותו הדבר יש לשקול עבור ריקבון ב קיזוזים גבוהים בניסויים מחוץ תהודה. נקודת הזמן המרבית האידיאלית של רשימת VD יכולה להיות שונה באופן משמעותי עבור האזורים השונים של ניסוי הפיזור. במקרה זה, ניתן לכלול יותר נקודות ברשימת VD, ונקודות רשימת VD הארוכות יותר עבור כוח SL גבוה יותר או היכודים גבוהים יותר במהלך הניתוח, בהתבסס על SINO נמוך הם יובילו, ניתן לבטל. באופן כללי, יש לשקול 5-8 נקודות רשימה vd להיות מסוגל לזהות חפצים פוטנציאליים המובילים ריקבון לא מעריכי כגון J-צימוד (ראה להלן).
1D-שיקולי סלקטיביות של HCP יש לנקוט זהירות מיוחדת בעת הפעלת גירסת 1D מבוססת HCP אם יש שיא נוסף החופף לשיא העניין בממד 1H של הניסוי מבוסס HSQC 2D. העברות מבוססות HCP הן מאוד, אך אף פעם לא סלקטיביות ב-100%, ולכן יכול לקרות ששיא נוסף תורם לאינטנסיביות ולריקבון של שיא העניין ב-1D. אינדיקציה לכך תהיה הבדל בערכי R 1ρ בתהודה המתקבלים באמצעות גרסאות 1D ו- 2D של הניסוי שכותרתו.
שיקולי ROE: עבור עקומות מחוץ לתהודה של אטומים עם חילופי ביניים איטיים, ניתן לזהות חפצי ROE בהתבסס על השוואה של Δω המתקבל עם ספקטרום NOESY או ROESY. אם ניתן לזהות פסגת חוצה בהפרש תזוזה כימי המתאים ל- Δω, אז המצב הנרגש הנצפה עשוי למעשה להיות חפץ ROE (למשל. מניסיון, זה תמיד הוביל גם להתקפים גרועים עם שגיאות גדולות, אולי בגלל ROE לא בעקבות אותה תבנית כמו REX עם הגדלת כוח SL. המצב הופך להיות קשה יותר עבור חילופי ביניים מהירים. בעוד עקומת התהודה היא (בהשוואה לנתוני 13C המתקבלים בגרעין השכן) עדיין מייצגת את תהליך החליפין בין GS ו- ES, עקומת התהודה מושפעת מחפצי ROE מרובים.
במקרה זה, כוח SL כדי לזהות את תהליך החליפין הוא גדול יותר (>1.5 kHz) ולכן משתרע על פני מספר גדול יותר של פרוטונים כמו עקומות מחוץ תהודה משתרע על הבדלי משמרות כימיות של מועמדים ROE שונים (עבור H8 אלה יהיו: פרוטוני אמינו ב ca. ±1000 הרץ, H5 / H1 של ב ca. -1200 הרץ, פרוטונים imino ב ca. 3500 הרץ). עד כה, לא נמצאה שיטה לדיכוי חפצי ROE אלה (מלבד שימוש בנוקלאוטידים מפורקים חלקית46), ולא ניתן לכלול נתוני תהודה להחלפה מהירה, שכן לא ניתן לחלץ מידע אמין על Δω בפועל בשיטה זו, אם לא ניתן לשלול תרומת NOE /ROE באמצעות ספקטרום NOESY.
J-צימוד (הרטמן-האן) שיקולים למרות עקומות על תהודה עבור פרוטונים J-מצמיד הומונוקלאר, כגון H6, נרשמו בהצלחה10,20, יש לנקוט טיפול מיוחד עבור מדידות מחוץ תהודה, במיוחד עבור כוח SL נמוך כמו התנאים התואמים הרטמן-האן יכול להתפרש על מגוון רחב של קיזוזים נחקרים. ניתן לזהות את חפצי הרטמן-האן כתנודות על הריקבון המעריכי או להגדיל את ערכי R2+REX עם עוצמות SL הולכות וגדלות בחלקות מו"פ על התהודה20.

RNAs לבצע שפע שלרגולציה 1, קטליטי2, ופונקציות מבניות3 בתא, שרבים מהם מתואמים למבנה מולקולרי גמיש ושינויים מורכבים של מבנים אלה4,5,6,7. מדינות מאוכלסות נמוכות נשארות בלתי נראות לרוב השיטות לקביעת מבנים או אינן מאפשרות את חקר מצבים נסתרים אלה ברזולוציה אטומית גבוהה. ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) של מצב פתרון משלבת את שני ההיבטים על ידי מתן גישה לגרעיני אטומים בודדים, כמו גם הצעת ארגז כלים גדול של ניסויים המתמקדים בדינמיקה באמצעות משטרי כל הזמנים8. ניסויי RD NMR מספקים גישה לחילופי קונפורמציה בציר הזמן הבינוני, שבו צפויים שינויים בדפוסי זיווג הבסיס ובארגון מחדש מבני מקומי5,9,10,11,12,13,14. ניסויי מו"פ מבוצעים כמדידות R2 ארוכות בצורת רכבת פולס קאר-פרסל-מייבום-גיל15 או כמדידות הרפיה במסגרת המסתובבת, הנקראת ניסויי R1ρ RD16.
למרות ששניהם יכולים לשמש לחילוץ אוכלוסייה ושער חליפין והפרש תזוזה כימי למצב המשני, ניסויי R1ρ RD גם נותנים את הסימן להבדל המשמרת הכימית של המצב הנרגש. זה מאפשר מסקנה על מבנה משני, אשר מתאם מאוד לשינוי כימי במבני RNA17. השינוי הכימי הוא אינדיקטור טוב של helicity במקרה של פרוטונים ארומטיים ופחמנים על nucleobases, של שותפי זיווג בסיס עבור פרוטונים imino, ושל דסקי סוכר על C4 ' ו C1 ' אטומים18,19. יש לציין כי לאחרונה ניסוי העברת רוויית חילופי כימיקלים (CEST) באמצעות כוח נעילת ספין גבוהה יותר (SL), ובכך הסטת הישימות של ניסוי CEST כדי להחליף לוחות זמנים מהירים יותר, פורסם כחלופה לניסוי R1ρ RD למערכות עם מצב נרגש אחד.
למרות 13C ו 15N איזוטופים שימשו לעתים קרובות כדי לגשת חילופי מבנים, עבודה האחרונה ממעבדה זו השתמש פרוטונים ארומטיים imino כמו בדיקות עבור חילופי קונפורמציה9,10. השימוש ב- 1H כגרעין הנצפה מביא מספר יתרונות, לדוגמה, גישה להחלפה בלוחות זמנים מהירים ואיטיים יותר, רגישות גבוהה יותר זמני מדידה קצרים יותר. זה מתאפשר עוד יותר על ידי גישת ניסוי פרוטון ממוטב SELective (SELOPE), מתן גישה פרוטונים ארומטיים באמצעות decrowding של ספקטרום חד ממדי (1D) באמצעות צימודים סקלריים הומו-גרעיניים, במקום העברת מגנטיזציה הטרונוקלרית, וביטול הצורך בתוויות איזוטופ20. פרוטוקול זה מטפל במדידה בניסויי RD של 1H R1ρ של דגימות אחידות של 13C/15N עם תווית N ולא מתויגות. לכן, מאמר זה מציג שיטת הכנה לדוגמה שנמצאה כרב-תכליתית ביותר לצרכי הכנת מדגם שונים21 ודן בחלופות בחלק האחרון של מאמר זה (איור 1).
בשלב זה, הקורא צריך לציין כי טכניקות הכנה מדגם אחרות מקובלות עבור 1H R1ρ RD ניסויים, וכי שיטות אחרות של ניתוח מבני ופונקציונלי יכול להתבצע עם הדגימות מסונתז עם הטכניקה המוצגת. 1 ניסויי H R1ρ RD דורשים ריכוזי RNA גבוהים (באופן אידיאלי &gt;1 mM) כמו גם הומוגניות גבוהה, הן באורך RNA והן בקונפורמציה מבנית כדי להבטיח אפיון אמין של דינמיקה מולקולרית. תמלול במבחנה (IVT) היא שיטת הבחירה עבור חוקרים רבים לייצר 13 C/15 דגימותRNA עם תווית N בשל הזמינות של טריפוספטים נוקלאוזידים מסומנים (NTPs) והתאגדות facile בתגובה אנזימטית22. עם זאת, T7 RNA פולימראז בשימוש נרחב (T7RNAP)23,24,25 סובל הומוגניות נמוכה 5 'במקרה של רצפי חניכה מסוימים26,27 ולעתים קרובות גם 3 ' הומוגניות במהלך נגר תמלול28. טיהור מינים RNA היעד הופך יקר יותר ומייגע בשל הצורך בכמויות גדולות של ~ 200 נמול. השיטה המשמשת כאן הוצגה בעבר שבה נדונו היתרונותבכללותו 21. בקצרה, הוא פותר בעיות המתוארות על ידי תעתיק דו-מושבי גדול יותר, שאז הוא נבקע במיוחד על ידי Escherichia coli RNase H, בהדרכת אוליגונוקלאוטיד כימרי29,30 (ראה איור 2 לפרטים).
שילוב של רצף מרווחים בקצוות 5' ו-3' של תמליל הטנדם מאפשר שימוש ברצף ייזום בתפוקה גבוהה והסרת אובר-התייבשות סופניות קרוב לאתר הליניאריזציה של תבנית הפלסמיד, בהתאמה (איור 2B). השיטה הוצגה כדי לשפר את התשואות באופן משמעותי, תוך הפחתת עלות ועבודה, עם אזהרה של סינתזת תבנית מורכבת יותר ואת הצורך אנזים נוסף אוליגונוקלאוטיד. הספציפיות הגבוהה של מחשוף RNase H מקלה על הטיהור בשל היעדר מינים RNA בטווח גודל דומה. הפרוטוקול הנוכחי משתמש בשלב כרומטוגרפיה נוזלית (HPLC) של החלפת יונים שפורסם על ידי מעבדה זו לאחרונה31, אם כי שיטות אחרות הן חלופות אפשריות. 1 H R1ρ RD יכול, באופן כללי, להיות נרכש על דגימות מסומנות או ללא תווית עם שני רצפי פעימה בהתאמה, "מסומן" 1H R1ρ הטרונוקליר יחיד מתאם קוונטי (HSQC) מבוסס ניסוי עם 13 C עקיף ממד 10ואת "לא תווית" 1H R1ρ SELOPE מבוסס על ממד עקיף 1H20.
ניסויים דו-ממדיים אלה (דו-ממדיים) יכולים לשמש בדיקה ראשונה, ללא קשר לשאלה אם הדינמיקה בציר הזמן R1ρ קיימת במדגם. סקירה כללית של מו"פ עבור כל הפסגות שנפתרו בספקטרום ניתן להשיג, ופסגות עניין לניתוח מו"פ יסודי יותר ניתן לזהות. משמעות הדבר היא כי אפילו דגימות ללא תווית ניתן לבדוק לפני החלטה לייצר מדגם יקר יותר, מתויג מתקבל. לאחר שיא עם תרומת חילופי קונפורמציה נבחר להיחקר ביסודיות רבה יותר, עדיף לעבור לגרסאות 1D של הניסויים לעיל (אם השיא עדיין ניתן לפתור) כדי לבצע מה שנקרא ניסויים מחוץ תהודה. עבור הגירסה המסומנת, העברת HSQC ל- 13C מוחלפת בשלב סלקטיבי של קיטוב הטרונוקלרי (HCP) כפי שנעשה שימוש בניסויים 32,33,34,35, בעוד שבמקרה של ניסוי SELOPE, הניסוי פשוט מנוהל כ- 1D, אשר שימושי במיוחד עבור אותות H8 ו- H2 השוכבים באלכסון ב- 2D בכל מקרה. קריטריון אחד לגבי איזה רצף להשתמש, בתנאי ששניהם, מסומנים כמו גם מדגם ללא תווית זמינים, הוא עד כמה מבודד שיא העניין בשני הניסויים.
באופן כללי, הניסוי SELOPE מומלץ עבור דגימות RNA של עד 50 נוקלאוטידים. עבור RNAs גדולים יותר, החפיפה תהיה גדולה יותר; עם זאת, נוקלאוטידים מעניינים מבחינה מבנית מופיעים לעתים קרובות באזורי שינוי כימיים שהם פחות חופפים ועדיין עשויים להיות נגישים ב- RNAs גדולים עוד יותר. טיעון נוסף יהיה כי בדגימות ללא תווית, אין J-צימוד מתרחש בין 1H ו 12C. עם זאת, מכיוון שכוח נעילת הסיבוב המינימלי מוגדר על ידי הכוח המינימלי המשמש לניתוק שני הסיבובים הללו (~ 1 kHz) בניסוי המסומן, הניסוי הלא מתויג מאפשר שימוש בטווח רחב יותר של עוצמות נעילת ספין (SL) ולכן, גישה לטווח זמן רחב יותר של חליפין. ניסויים אלה מחוץ תהודה לספק מידע נוסף kex, כגון אוכלוסיית המצב הנרגש (קונפורמייר חלופי), pES, כמו גם מידע משמרת כימית יקר מאוד בצורה של Δω (ההבדל שינוי כימי של מצב הקרקע ואת המצב הנרגש).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2.jpg"> איור 1: זרימת עבודה של הפרוטוקול המוצג. הכנה לפני ייצור מדגם בקנה מידה גדול בפועל, המורכב הכנת תבנית ואישור מוצלח של תמלול במבחנה ומחשוף RNase H. ייצור בקנה מידה גדול כולל טיהור HPLC, מילוי צינור NMR ואישור של קיפול RNA. במקרה של סינתזה עם תווית איזוטופ, יש לבצע טיהור ללא תווית לאופטימיזציה הדרגתית באותו יום. אפיון NMR של דינמיקה קונפורמציה עם ניסויי R1ρ. כל שלב יכול להתבצע באופן עצמאי, למשל., ניתוח 1H R1ρ RD ניתן להחיל על כל דגימת RNA מתאימה המיוצרת בשיטה אחרת. קיצורים: IVT = תמלול במבחנה; HPLC = כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים; NMR = תהודה מגנטית גרעינית; RD = פיזור הרפיה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62470/62470fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
מטרת פרוטוקול זה היא לספק פרטיםמעשיים ופרמטרים קריטיים לחקר הדינמיקה הקונפורמציה עם פיזור הרפיה 1 H R1ρ במולקולות סיכת ראש RNA. לאחר מתן פרוטוקול מפורט של טיהור HPLC של תכנון, סינתזה והחלפת יונים של RNA יעד שניתן לבצע באמצעות כל, חלקם, או אף אחד NTPs כגירסאות 13C /15N-labeled, זרימת העבודה של השלמת מדגם NMR ואישור חילופי הקונפורמציה עם ספקטרוסקופיית NMR תוארה. לבסוף, הפרטים על ההתקנה של 1H R1ρ RD ניסויים על ספקטרומטר NMR Bruker מתוארים (איור 1). הפרוטוקול נותן כל שלב כדי להגדיר את גירסת 1D עבור דוגמאות מסומנות בתווית והערות נוספות וטבלה להתאמה עבור ההגדרה של גירסת SELOPE (טבלה 2). לאחר הפרוטוקול, נדונים צעדים קריטיים ודרכים חלופיות להכנת מדגם והגדרת RD 1H R1ρ.

<table><tbody><tr><td>40% אקרילאמיד/תמיסת BIS</td><td>&nbsp; ביו-רד</td><td>&nbsp; 161-0144</td><td></td></tr><tr><td>5-אלפא מוכשר&nbsp; E. coli</td><td>NEB</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>49199</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>34851</td><td></td></tr><tr><td>AFC-3000, אספן שברים HPLC&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>5702.1</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; A9414</td><td></td></tr><tr><td>Amersham ImageQuant 800 UV</td><td>GE Healthcare</td><td>29399482</td><td>החלפת LAS-4000 או</td></tr><tr><td>יחידת מסנן אולטרה צנטריפוגלית מקבילה של Amicon</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; </td><td></td>UFC900324</tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; A3678</td><td></td></tr><tr><td>אמפיצילין</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; A9518</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; A2383</td><td></td></tr><tr><td>ATP-13C10/15N5</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>645702</td><td></td></tr><tr><td>אנזים הגבלה BamHI</td><td>NEB</td><td>&nbsp; R0136L</td><td></td></tr><tr><td>מסנן בקבוק עליון&nbsp;</td><td>VWR&nbsp;</td><td>514-1019</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>&nbsp; מדריך</td> מחשוף <td>1081220005</td><td></td>Sigma-Aldrich</tr><tr><td></td><td>IDT</td><td>N/A</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>CTP</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; C1506</td><td></td></tr><tr><td>CTP-13C10/15N5</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>645699</td><td></td></tr><tr><td>D2O</td><td>&nbsp; מערכת Sigma-Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr><tr><td>Dionex Ultimate 3000 UHPLC&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiotreitol</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; D8418</td><td></td></tr><tr><td>DNAPac PA200 22x250 עמודה למחצה&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SP6734</td><td></td></tr><tr><td>DNAPac PA200 עמוד שמירה 22x50&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>SP6731</td><td></td></tr><tr><td>E.coli RNase H</td><td>&nbsp; נב&</td><td>nbsp; M0297L</td><td>&nbsp; או שנעשה ב-Uniprot Ref. P0A7Y4&nbsp;</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; E6758</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה אפנדורף, רוטור: A-4-44</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 95%</td><td>&nbsp; פישר סיינטיפיק</td><td>11574139</td><td></td></tr><tr><td>אתנול 95% מפוגל&</td><td>nbsp; VWR</td><td>85829.29</td><td></td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>47671</td><td></td></tr><tr><td>ג'לרד</td><td>&nbsp; VWR</td><td>41003</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1kbp פלוס</td><td>&nbsp; פישר סיינטיפיק</td><td>&nbsp; SM1333</td><td>GMP אופציונלי</td></tr><tr><td></td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; G8377</td><td></td></tr><tr><td>GMP-13C10/15N5</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>650684</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; G8877</td><td></td></tr><tr><td>GTP-13C10/15N5</td><td>&nbsp; Sigma-Aldrich</td><td>645680</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; H1758</td><td></td></tr><tr><td>פירופוסטאז אנאורגני</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; I1643-100UN</td><td>&nbsp; או שנעשה ב-Uniprot Ref. P0A7A9</td></tr><tr><td>Invitrogen UltraPure 10X TBE-buffer</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; T4415</td><td></td></tr><tr><td>Julabo TW8 אמבט מים&nbsp;</td><td>VWR</td><td>461-3117</td><td></td></tr><tr><td>kuroGEL Midi 13 אלקטרופורזה ג'ל אופקית</td><td>VWR</td><td>700-0056</td><td>או</td></tr><tr><td>מרק LB דומה (Lennox)</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; מרק L3022</td><td></td></tr><tr><td>LB עם אגר (לנוקס)</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; סולם</td> ssRNA לטווח נמוך L2897<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>נב&</td><td>nbsp; N0364S</td><td></td></tr><tr><td>משאבת גפ"מ-3400RS</td> אופציונלית&nbsp;<td>Thermo Scientific</td><td>5040.0036</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידרט</td><td>&nbsp; סמן מיקרו-רנ"א סיגמא-אולדריץ'</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>תנור מיקרוגל NEB</td><td>N2102S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>&nbsp; סמסונג</td><td>&nbsp; </td><td></td>MS23F301EAW</tr><tr><td>ציוד אלקטרופורזה Mini-PROTEAN</td><td>&nbsp; Bio-Rad</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi</td><td>&nbsp; מכונות-Nagel</td><td>&nbsp; 740414.10M</td><td></td></tr><tr><td>פלסמיד pUC19 המכיל הכנסת טנדם</td><td>&nbsp; ג'נסקריפט</td><td>&nbsp; N/A</td><td>או שווה ערך</td></tr><tr><td>RNaseZAP</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; צינור שיגימי R2020</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"מ&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z529427</td><td></td></tr><tr><td>מזרק חד פעמי, קצה נעילת לואר</td><td>VWR</td><td>613-2008</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; S2889</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי&</td><td>nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; 730-1470</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פרכלורט</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>71853</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; S3264</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט מונובסיס</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>&nbsp; S3139</td><td></td></tr><tr><td>ספרמידין טריהידרוכלוריד</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>85578</td><td></td></tr><tr><td>SYBR זהב</td><td>&nbsp; תרמו-פישר</td><td>&nbsp; מסנני מזרק S11494</td><td></td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>514-0061</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA פולימראז</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>10881767001</td><td>&nbsp; או שנעשה ב-Uniprot Ref. P00573</td></tr><tr><td>TCC-3000RS תרמוסטט עמודה&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>5730</td><td></td></tr><tr><td>טטרמתילאתילאנדיאמין</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>טריס בסיס</td><td>&nbsp; פישר סיינטיפיק</td><td>10103203</td><td></td></tr><tr><td>UMP</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>U6375</td><td></td></tr><tr><td>UMP-13C9/15N2&nbsp;</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>651370</td><td></td></tr><tr><td>אוריאה</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>UTP</td><td>&nbsp; סיגמא-אולדריץ'</td><td>U6625</td><td></td></tr><tr><td>UTP-13C10/15N5</td><td>&nbsp; גלאי סיגמא-אולדריץ'</td><td>645672</td><td></td></tr><tr><td>VWD-3100&nbsp;</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>5074.0005</td><td></td></tr></tbody></table>

היבטים מעשיים של הכנת מדגם והגדרת 1h r1ρ הרפיה ניסויים של rna

Practical Aspects of Sample Preparation and Setup of 1H R1&#961; Relaxation Dispersion Experiments of RNA

RNA הוא ביומולקולה גמישה מאוד, שבה שינויים במבנים ממלאים תפקידים מכריעים בפונקציות שמולקולות RNA מבצעות כשליחים ומאפננים תאיים. בעוד מצבים דינמיים אלה נשארים מוסתרים לרוב השיטות המבניות, ספקטרוסקופיית פיזור הרפיה (RD) R 1ρ מאפשרת לחקור דינמיקה קונפורמציה במשטר מיקרו-אלפיות השנייה ברזולוציה אטומית. השימוש ב- 1H כגרעין הנצפה מרחיב עוד יותר את משטר הזמן המכוסה ונותן גישה ישירה לקשרי מימן ולזוג בסיסים.
הצעדים המאתגרים במחקר כזה הם טוהר גבוה והכנת מדגם בתפוקה גבוהה, פוטנציאל 13C- ו 15N-labeled, כמו גם הגדרת ניסויים והתאמה של נתונים כדי לחלץ אוכלוסייה, שער חליפין, ומבנה משני של המצב הבלתי נראה בעבר. פרוטוקול זה מספק צעדים מעשיים קריטיים בהכנת מדגם כדי להבטיח הכנת דגימת RNA מתאימה והגדרת ניסויי 1 H R1ρ עם דגימותRNA איזוטופיות ולא מתויגות.

אנו מציגים פרוטוקול למדידת דינמיקה מיקרו-אלפית השנייה על ספקטרוסקופיית RNA עם תווית N של 13C/15עם תווית N עם ספקטרוסקופיית פיזור הרפיה של 1H R1ρ. המוקד של פרוטוקול זה טמון הכנה מדגם טוהר גבוהה והגדרת ניסויי NMR.

היבטים מעשיים של הכנת מדגם והגדרת 1H R1ρ הרפיה ניסויים של RNA

RNA is a highly flexible biomolecule, wherein changes in structures play crucial roles in the functions that RNA molecules execute as cellular messengers ...

פרוטוקול זה מתאר הכנת מדגם RNA והגדרת NMR למדידות פיזור הרפיה של פרוטון R1rho כדי לבחון חילופי אישור במולקולות RNA. מאז פרוטונים נחקרים, השיטה אינה זקוקה לתיוג איזוטופי ויכולה לגשת לתכונות מבניות כמו שיוך בסיס מוזז ישירות. הפיפטה היא מודולרית למדי במובן זה פיזור הרפיה R1rho ניתן למדוד גם אם המדגם מיוצר בשיטה אחרת.התחל בהכנת דגימת הפלסמיד והקמת תגובת תמלול ויוחן ומחשוף כמתואר בכתב היד של הטקסט. לדגור על התגובה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. ואז לדלל microliter אחד של המדגם פי עשרה בתמיסת טעינה.ולהפעיל microliter אחד על ג'ל דף denaturing. אם תגובת המחשוף מוצלחת, שנה את קנה המידה של התגובה לנפח הרצוי והפעל אותו בן לילה. לאחר מכן הפעל ג'ל PAGE דנטורינג נוסף ולהעריך אם תגובת המחשוף הושלמה.במקרה של מחשוף לא שלם, לחמם את פתרון התגובה במיקרוגל קונבנציונאלי ב 450 וואט במשך 15 שניות. ואז לקרר את הפתרון לאט ל 37 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות כדי לתזנות מחדש את הרנ"א ואת מדריך המחשוף. ושימו לב להיווצרות של משקעים חדשים.הוסף עוד pyrophosphatase אנאורגני ו RNase H.Incubate התגובה במשך שעה עד שלוש שעות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן אשר את השלמת תגובת המחשוף עם דף denaturing. כאשר תגובת מחשוף RNase H הושלמה, להרוות את התגובה על ידי הוספת EDTA לריכוז סופי 50 מילימולר.ומערבולת ביסודיות. סנן את הפתרון באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרון. ולרכז את הפתרון לאמצעי אחסון להזרקה למערכת HPLC לטיהור.לפני הוספת המדגם המרוכז והמטוהר לצינור NMR, לנקות את הצינור על ידי שטיפה עם מים בשפע. ואז ריאגנט טיהור RNase, מים, ו 95%אתנול. לאחר השטיפה הסופית במים, להשאיר אותו לייבוש.יש לשטוף את הבוכנה במים ולהשתמש במחיקה ללא מוך לניקוי עם טיהור RNase reagent ו-95%אתנול. לאחר ייבוש הצינור ואת הבוכנה, להוסיף 10% D2O לדגימת NMR. השתמש קצה פיפטה גדול כדי להעביר את דגימת ה- RNA לתוך צינור NMR, זורם אותו לאורך הצד של קיר הצינור.הכנס את הבוכנה לתוך הצינור על ידי דחיפת אותו למטה עם תנועה פיתול מהירה כדי להסיר בועות אוויר, ולאחר מכן למשוך את הבוכנה למעלה לאט מבלי ליצור בועות אוויר חדשות. ולתקן את זה עם סרט שעווה פרפין. צור ערכת נתונים חדשה המבוססת על ערכת נתונים ארומטית של פחמן פרוטון HSQC המשמשת בדגימות RNA עם תוויות מלאות להקצאת RNA.הגדר את הפרמטרים הכלליים ואת הפרמטרים הספציפיים RD. ואז להגדיר כוח נעילת ספין פרוטון ל 1.2 קילוהרץ לבדיקה. צור רשימת VD לבדיקה עם ערך אחד בלבד, אפס אלפיות שניה, הגדר את TDF1 לאחד ועדכן את D30 כדי להפעיל ספקטרום בדיקה.לאחר הגדרת רשימת VD בדיקה, עדכן D30 ו- TDF1. ולתוות את עוצמת הפסגה לאורכים שונים של נעילת ספין. זהה את אורך נעילת הסיבוב שבו עוצמת השיא המקורי יורדת לשליש.מהתוצאה של ריצות הבדיקה, צור את רשימת VD הסופית לשימוש בניסוי. בחר את מספר הסריקות כך שהשיא החלש ביותר ברשימה יהיה בעל יחס אות לרעש של 10 לפחות. התוצאות של מספר תגובות מחשוף של תמלילי טנדם מוצגים כאן.RNA יעד נוקלאוטיד 20 נוצר בתגובה מוצלחת. תגובות לא מוצלחות גרמו למחשוף לא שלם ונכשל של המדגם. הזרקת HPLC של דגימת הרנ"א חשפה שיא עבור RNA מטרה טהורה ב 38 דקות.בעוד מוצרים ארוכים וקצרים יותר הופרדו היטב משיא העניין. ניתוח סיכת הראש של הרנ"א הראה כי מספר הפרוטונים של האימינו שנצפו תאם את מספר הפרוטונים האימינו הצפויים מסימולציית מבנה משנית. ספקטרום הפחמן הפרוטוני HSQC של התהודה הארומטית של הרנ"א הראה ארבעה אותות לאחר הקיפול.ורק שלושה אותות לפני הקיפול. בנציג על עקומות תהודה המתקבלים עבור שני אטומי H8 שונים ושני סיכות שיער RNA סינתטי שונים, G6H8 חווה חילופי אישור. בעוד A4H8 לא.עבור G6H8, נבחרו כוחות נעילת הסיבוב הצבעוניים ונרשמו נתוני תהודה כבויים. במבנה CG שבו ההחלפה איטית, ערכי השורה R1rho לעומת חלקת היסט כבר הציגו א-סימטריה קלה של העקומה, המציינת את הסימן של הפרש השינוי הכימי דלתא אומגה. זה הופך להיות אפילו יותר ברור בעלילת R2 פלוס REX שבו תרומת R1 מוסרת.מצד שני, מבנה GC חווה החלפה מהירה יותר וערכי R1rho לעומת חלקת היסט הציגו עקומה רחבה יותר שבה החילוץ של אומגה דלתא הופך פחות ברור אפילו בחלקת R2 פלוס REX. לאחר שהדינמיקה של הרנ"א התבהרה, ניתן לאפיין וללכד את המדינות. מצבים לכודים אלה יכולים, למשל, להיבדק בבדיקות ביולוגיות.שיטה זו מאפשרת לנו להתבונן בשינויי זיווג בסיס פונקציונליים ורלוונטיים בקומפלקס מיקרו-רנ"א פעיל, סידורים מחדש של לולאות ברנ"א ריבוזומלי ויציבות זוג בסיס של בליטות נוקלאוטיד בודדות.

practical-aspects-sample-preparation-setup-1h-r1-relaxation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מתאר את טכניקת ספקטרוסקופיית התהודה המגנטית הגרעינית לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון בין 15חלבוני אנבופלקין מסוג פרא ומוטציה המסומנים N לבין חלבון וימנטין ללא תווית. האינטראקציה המוצלחת בין אנבופלקין פראי לווימנטין מובילה להרחבת קווים נרחבת ולהיעלמות שיא בספקטרום ה-NMR, בעוד שהיעדר אינטראקציה בין האנבופלקין המוטציה לווימנטין מביא לשיאים פתורים היטב בספקטרום ה-NMR.

תהודה מגנטית גרעינית לחקר אינטראקציות חלבון-חלבון ברמה האטומית

acylation הידרוקסיל '2 סלקטיבית תפוקה גבוהה נותח על ידי הארכה תחל (SHAPE) מנצל כימי רומן חיטוט טכנולוגיה, שעתוק לאחור, אלקטרופורזה נימים ותוכנות לחיזוי מבנה משנית כדי לקבוע את המבנים של RNAs מכמה מאה עד כמה אלף נוקלאוטידים ברזולוציה נוקלאוטיד יחידה.

חיזוי מבנה המשני RNA באמצעות SHAPE תפוקה גבוהה

RNA פולימראז II מסנתז RNA מבשר שמשתרע מעבר לקצה '3 של ה-mRNA הבוגרת. סוף RNA הבוגר מופק cotranscriptionally, באתר מוכתב על ידי רצפי הרנ"א, באמצעות פעילות endonuclease של מתחם המחשוף. הנה, אנחנו פירוט את השיטה ללמוד תגובות מחשוף במבחנה.

ניתוח של תגובות RNA עיבוד באמצעות מערכות חינם ניידים: 3 &#39;סוף המחשוף של Pre-mRNA מצעים<em&gt; במבחנה</em

כאן אנו מציגים פרוטוקול לנתח אינטראקציות RNA / חלבון. Assay ניידות electrophoretic המשמרת (Emsa) מבוסס על הגירת ההפרש של מתחמי RNA / חלבון ו- RNA ללא תשלום במהלך ג'ל אלקטרופורזה ילידים. באמצעות בדיקה RNA רדיואקטיבי, יכולים להיות דמיינו מתחמים / חלבון RNA על ידי autoradiography.

Shift electrophoretic הניידות Assay (Emsa) לחקר RNA אינטראקציות חלבון: IRE / IRP דוגמא

אנו מתארים פרוטוקול כדי לזהות רנ א מחייב חלבונים ולמפות אזורים מחייב RNA שלהם ב תאים חיים באמצעות photocrosslinking בתיווך UV וספקטרומטר מסה.

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

מאמר זה מספק הליך מפורט על סינתזה שלב מוצק, טיהור, אפיון של dodecamers של רנ"א שונה ב C2'- O -position. UV- מול וניתוח מעגלי דיכרואי פוטומטרי משמשים לכמת ולאפיין היבטים מבניים, כלומר , גדילים בודדים או פעמיים גדילים.

Protocol עבור שלב מוצק סינתזה של אוליגומרים של רנ&quot;א המכיל 2 &#39;<em&gt; הו</em&gt; שינוי ואפיון של תיאופנילמתיל באמצעות דיכרואיזם מעגלי

כאן, תיאור מפורט של הפרוטוקול מיושם במעבדה לרכישה וניתוח של 15N פרופילי פיזור הרפיה על ידי פתרון ספקטרוסקופיה NMR מסופק.

15 (15) N פיזור הרפיה CPMG לחקירת דינמיקה קונפורמטיבית חלבון על ציר הזמן μs-ms

פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה ניסיונית מלאה לחקר אינטראקציות חלבון RNA באמצעות פינצטה אופטית. מספר הגדרות ניסיוניות אפשריות מתארות כולל שילוב של פינצטה אופטית עם מיקרוסקופיה קונפוקלית.

פינצטה אופטית לחקר אינטראקציות בין RNA לחלבון בוויסות התרגום

MALDI-TOF שימש לאפיון שברים שהתקבלו מהתגובתיות בין RNA מחומצן לבין exoribonuclease Xrn-1. הפרוטוקול הנוכחי מתאר מתודולוגיה שניתן ליישם על תהליכים אחרים המערבים רנ"א ו/או דנ"א.

זיהוי שברי RNA כתוצאה מהשפלה אנזימטית באמצעות ספקטרומטריית מסה MALDI-TOF

ספקטרוסקופיית תהודה מגנטית גרעינית (NMR) יכולה לאפיין דינמיקה מבנית של חלבונים באופן ספציפי לשאריות. אנו מספקים פרוטוקול מעשי להקלטת NMR 15N R1 ו- R2 הרפיה ו {1H}-15N אפקט Overhauser הטרוגרעיני (hetNOE), רגיש לפיקושניות לציר הזמן של ננו-שניות.

NMR 15N ניסויי הרפיה לחקר דינמיקה מבנית של פיקו-שנייה עד ננו-שניות של חלבונים

פרוטוקול זה מתאר בדיקה ויזואלית באמצעות דיווחי RNA ברוקולי מפוצלים לזיהוי וכימות של זיווג בסיסים בין-מולקולריים באשכולות RNA במבחנה.

הדמיה וכימות של זיווג בסיסי RNA בין-מולקולריים באשכולות RNA במבחנה באמצעות דיווחי RNA ברוקולי מפוצל

למד הכנת מדגמי RNA וניסויי NMR מסוג R1rho להפצת הרפיה בפרוטונים לחקירת דינמיקה מבנית במולקולות RNA. השיטה מאפשרת תצפית ישירה בשינויים בזיווג בסיסים ברזולוציה אטומית ללא צורך בסימון איזוטופי.

היבטים מעשיים של הכנת מדגם והגדרת ¹H R_1ρ הרפיה ניסויים של RNA

גלה סרטונים נוספים