זיהוי נוגדן דומיין מחייב קולטן SARS-CoV-2 באמצעות ביו-דו"ח מבוסס HiBiT

המעבדה שלי עובדת במחקר COVID-19, ולאחרונה פיתחנו בדיקת ניסיון חדשנית שאפשרה לנו לזהות במהירות ובדייקנות נוגדני SARS-CoV-2. פרוטוקול זה מתאר בדיקת תפוקה גבוהה לאיתור נוגדנים נגד SARS-CoV-2 בדגימות סרום מטופלים, וזה קריטי בהתחשב במגפה הנוכחית. רוב ההקרבות הסרולוגיות הנוכחיות מקריבות מהירות לרגישות או להיפך.

הנתונים שלנו מראים שביידת התחת שלנו רגישה ויש לה זמן תגובה מהיר. על מנת לייצר כמות מספקת של bioreporter HiBiT-RBD גבוה, להתחיל על ידי הכנה לתרבות התא. ראשית, הכינו את מדיום הנשר המותאם של דולבק המכיל 10% סרום בקר עוברי ו-1%פניצילין וסטסטרוטומיצין.

ואז לחמם את התקשורת באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. הפעל את ארון הבטיחות הביולוגי והשתמש ב-70% אתנול לחיטוי פני הארון. כדי לתרבות קו התא, להוציא אותו ממינוס 80 מעלות צלזיוס או חנקן נוזלי ולהפשיר אותו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.

מערבבים את התאים המופשרים עם לפחות 10 מיליליטר של מדיום מלא. פיפטה את התליית התא לתוך צלחת פטרי 15 ס"מ מערבבים את הצלחת כדי להפיץ את התאים באופן אחיד. מניחים את המנה באינקובטור תרבית תאים ב-37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו-חמצני ו-85 עד 95% לחות.

התבונן בתאים מתחת למיקרוסקופ עד שרמת ההשפעה מגיעה ל -80 עד 90% בעוצמה גבוהה, הסר את המדיום, שטף את התאים עם PBS חם והוסף שלושה עד חמישה מיליליטר של 0.25% טריפסין-EDTA כדי לנתק את התאים מפני השטח. לאחר כחמש דקות, להסתכל על התאים תחת מיקרוסקופ. אם כל התאים צפים, להוסיף לפחות ארבעה מיליליטר של בינוני ולהעביר את השעיית התא לתוך צינור סטרילי חדש.

לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולהוסיף מיליון תאים לתוך כל באר של צלחת שש באר עבור transfection. כדי לבצע טרנספקטציה של הפלסמיד HiBiT-RBD, השתמש במיקרוגרם אחד של ביטוי HiBiT-RBD plasmid עם ריאגנט transfection מתאים. דגירה במשך 10 עד 15 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להוסיף את הנפח הכולל לכל באר של הצלחת dropwise.

למחרת, להחליף את המדיום המכיל את תערובת transfection עם מדיום מלא. שימו לב לבקרת ההדבקה היטב 48 שעות לאחר ההדבקה. לאסוף את supernatant ב 1.5 מיליליטר microtubes.

הוסף 500 מיקרוליטרים של חיץ תמה פסיבית 1X או PLB לתאים, ולאחר מכן לדגור ולנער את הצלחת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר עבור תמה תא. לאחר מכן, כדי להעריך את אות luminescence מן bioreporter באמצעות בדיקת לוציפראז, ראשית להכין את רכיבי התגובה ולהשתמש supernatant כמקור של bioreporter. יש לדלל את ה-BiT הגדול ואת המצע לפי 1 לפני השימוש.

העבר 50 מיקרוליטרים של supernatant מכל באר או צינור לצלחת 96 טוב ולהוסיף 50 microliters של 1X גדול BiT לכל באר. דגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. פתח את תוכנת לומינומטר, הוסף 50 מיקרוליטרים של מצע פי 1 לכל באר, מקם את הצלחת ב- luminometer והפעל את התוכנה.

על מנת לבצע את בדיקות זיהוי הנוגדנים HiBiT-RBD, הכינו את הביו-דו"ח HiBiT-RBD כפי שתואר בעבר ושלבו 50 מיקרוליטרים של HiBiT-RBD המכילים סופרנטנט עם מיקרוגרם אחד של נוגדן SARS-CoV-2 RBD מסחרי במיקרו-טיוב של 1.5 מיליליטר. הוסיפו לתמיסה 20 מיקרוליטרים של חלבון מחייב אימונוגלובולין או חלבון G. הבא את הנפח הכולל ל- 300 מיקרוליטרים על-ידי הוספת PBS.

לדגור את הצינורות על שייקר צינור או סיבוב במשך 30 דקות. צנטריפוגה ב-12, 000 אלף למשך 30 שניות. ואז להשליך את supernatant ולשטוף עם PBS.

חזור על התהליך שלוש פעמים כדי להסיר HiBiT-RBD בחינם. resuspend התאים ב 50 microliters של PBS ולהעביר אותו לצלחת 96 באר. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של BiT גדול פי 1 והמתינו חמש דקות.

לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטרים של מצע 1X NanoLuc. מיד לקרוא את אות הזוהר עם לומינומטר. הכן כמויות גדולות יותר של bioreporter HiBiT-RBD לבדיקת תפוקה גבוהה ולשלב 20 מיקרוליטרים של חלבון G מגנטי עם 50 מיקרוליטרים של Supernatant HiBiT-RBD בכל באר של צלחת 96 טוב עבור כל מדגם.

הוסף 10 מיקרוליטרים של דגימת הסרום לכל באר והבא את הנפח הכולל ל-150 מיקרוליטרים על ידי הוספת PBS. דגירה במשך 30 דקות על שייקר בטמפרטורת החדר. לאחר מכן מניחים את הצלחת על מכונת כביסה מגנטית כדי לזרז את קומפלקס נוגדני חלבון G.

יש להשליך את הפתרון בחלק האמצעי של כל באר ולהוסיף PBS לשטיפה. חזור על שלב הכביסה לפחות שלוש פעמים כדי להסיר עודף HiBiT-RBD. הוסיפו 50 מיקרוליטרים של 1X PBS ו-50 מיקרוליטרים של BiT גדול פי 1 ודגרה למשך חמש דקות לפחות בטמפרטורת החדר.

הכן את תוכנת מד הזוהר. לאחר מכן הוסף 50 מיקרוליטרים של מצע פי 1. הנח את הלוח במכונה, הפעל תוכנה והקלט את האותות.

השווה את האותות מדגימות סרום, דגימות בקרה ואות רקע מבארות ריקות. האותות הן של HiBiT-RBD המכיל ליסאט תא סופרנטנט של התאים transfected נרשמו כדי להעריך את מקור החלבון המתאים. הנתונים הראו רקע נמוך בהשוואה לאות חזק כאשר שני החלקים שולבו.

התוספת של חלבון G מסייעת למשפכי נוגדנים. ההבחנה שימשה כדי להשוות את האות מנוגדן נטרול SARS-CoV-2 מסחרי עם IgG שליטה. אות הנוגדנים הספציפי היה חזק, בעוד שנוגדן הבקרה היה קרוב לרמת הרקע הזוהרת.

רקומביננט מוחלש על ידי וירוס ריסוליטיס או VSV עם מוטציה במיקום 51 של חלבון M המבטא RBD אקסוגני שימש לחיסון עכברים. הסרום שנאסף מעכברים מחוסנים יצר אות חזק בהשוואה ללא אות בעכברים שהוזרקו עם בקרת VSV. פרוטוקול זה יכול לשמש לגילוי נוגדני SARS-CoV-2 בדגימות סרום המטופל.

שלבי הכביסה לאחר הדגירה עם חלבון G הם קריטיים להפחתת הרקע. בנוסף, חשוב להוסיף את המצע מהר ככל האפשר כדי למנוע אובדן אות. עם כמה צעדי אופטימיזציה נוספים, ניתן להשתמש באותה בדיקת אסדה כדי לנתח דגימות דם ויכולה להיות שיטה יעילה לקביעת נוגדנים נגד SARS-CoV-2 בדגימות דם של מטופלים.