ניתוח של הגבלת SAMHD1 על ידי ציטומטריה של זרימה בתאי מיאלואיד U937 אנושיים

עם העניין הגובר בתפקידם של גורמים תאיים בהידבקות ב-HIV של מקרופאגים, פיתחנו מערכת ניתוח גמישה, במיוחד עבור SAM HG אחד, שאינו בא לידי ביטוי בתאי U937. היתרון העיקרי של המערכת הוא הגמישות שלה. לאחר הגדרתו, ניתן להשתמש בו כדי לנתח מגוון חלבונים, תאים או נגיפי מטרה.

חשוב לשמור על בריאות התאים וגם להרגיש בנוח עם ציטומטריה של זרימה צבעונית. הפעל את הציטומטר ואת המחשב 10 דקות לפני תחילת הניתוח. ודאו שהפסולת ריקה ומיכל הנדן מלא.

לאחר מכן היכנס ופתח את תוכנת הניתוח. לאחר הזזת הזרוע, הורידו את צינור המים. הגדר את קצב הזרימה לגבוה ולחץ על prime.

המתן עד שהאור יכבה וחזור על תהליך זה שלוש פעמים נוספות. החזירו את צינור המים לפעולה ורצו בקצב זרימה גבוה במשך שלוש דקות. לאחר מכן, הגדר את קצב הזרימה לנמוך ולחץ על מצב המתנה עד לרכישה.

בחר ניסוי, ניסוי חדש, ולחץ על אישור כדי לבחור ניסוי ריק, לחץ לחיצה ימנית על הניסוי והוסף דגימה חדשה. לחץ על אישור לחלונית ריקה. לחץ לחיצה ימנית כדי לשנות שם עם שם מתאים ופתח את הדגימה על ידי לחיצה על סימן הפלוס כדי לחשוף צינור חדש.

לחץ פעמיים על הצינור כדי לראות את הגדרות הציטומטר במפקח. בתפריט הפרמטרים, מחק את הפלואורוכרומים הלא נדרשים למעט הלייזר הכחול 53030 והלייזר הצהוב 61020. בגליון העבודה, צור אזור פיזור קדימה לעומת תרשים נקודה של אזור פיזור צדדי, היסטוגרמה של YFP, היסטוגרמה של RFP ותרשים נקודה של RFP לעומת YFP על-ידי לחיצה על הסמל המתאים ושינוי הצירים על-ידי לחיצה על תווית הציר.

טען את הבקרה הלא נגועה והלא מתורגמת ולחץ על הפעל על המכשיר. לאחר מכן לחץ על רכישה בלוח המחוונים של הרכישה. התאם את מתחי הפיזור קדימה והצד בלוח המחוונים כדי למקם את התאים ברביע השמאלי התחתון.

שער סביב אוכלוסייה זו ותייג אותה כ- P אחד. לחץ לחיצה ימנית על העלילות האחרות ובחר הצג P אחד כדי להסיר את הפסולת מהניתוח הבא. כוונן את מתחי ה-RFP וה-YFP כלפי מטה כך שהשיא יישב משמאל להיסטוגרמה.

טען את פקד הצבע היחיד עבור YFP ולחץ על רכישה. התאם את מתח ה- YFP בלוח המחוונים כך שהתאים הפלואורסצנטיים ביותר יהיו בטווח הגלאים. לאחר מכן חזור על אותו הדבר עבור פקד RFP.

בחר את הניסוי. עבור אל הגדרת התגמול ובחר צור פקדי פיצוי ואשר לך לעבור לגליון עבודה רגיל ולאחר מכן בחר גליון עבודה רגיל שאינו מוכתם. לחץ תוך כדי ריצה ורכוש עבור השליטה הלא מוכתמת.

צייר שער P אחד סביב התאים השלמים והקליט. הסר את הצינור והנח את המכונה על המתנה. לחץ לחיצה ימנית על P אחד.

לחץ על החל על כל בקרות הפיצוי ועבור לגליון העבודה הרגיל של RFP. לחץ על הריצה והקלט את בקרת ה- RFP בצבע יחיד והתוכנה תשער באופן אוטומטי את התאים החיוביים. העבר את ההתקן למצב המתנה וחזור על אותו הדבר עבור פקד YFP.

בחר ניסוי, עבור אל הגדרת פיצוי, בחר חשב פיצוי ולאחר מכן לחץ על קישור ושמור. עבור לגליון העבודה הכללי וחזור לצינור הדגימה. רכשו את התאים המתמרים עם SAM HD פראי אחד נגוע ב- HIV RFP, ובדקו כי ניתן לראות ארבע אוכלוסיות שונות בפינות הרבעים מיושרות אנכית ואופקית עבור YFP ו- RFP.

הסר את הצינור ולחץ על מצב המתנה. טען מחדש את הדגימה הלא מתוקשרת והלא נגועה ולחץ על הפעלה. בלוח המחוונים של הרכישה, הגדר את שער העצירה ל- P אחד ואת האירועים לרישום 30, 000 אירועים.

הקלט הקשה. חזור על אותו הדבר עבור דגימות ופקדים אחרים על ידי לחיצה על הצינור הבא בין כל צינור. שנה את שמות הדוגמאות תוך כדי ריצה או פוסט-הוק, וייצא את הנתונים כקבצי FCS נקודה.

פתח את התוכנה וגרור את כל קבצי FCS ללוח המחוונים. בחר את פקדי הפיצוי וגרור אותם לתיקיית המשנה של הפיצויים. לחץ פעמיים על הצינור הלא מתומר והלא נגוע כדי לפתוח את הקובץ ולפזר קדימה פיזור לעומת צד של עלילה.

בחר בכלי המצולע ובשער על אוכלוסיית התאים השלמים למעט לכלוך בפינה השמאלית התחתונה ותן לו שם תאים. הזז את התווית כך שלא תסתיר את התאים. גרור את השער הזה לכל אוכלוסיית הצינורות בסרגל כל הדגימות.

גלול בין כל האוכלוסייה באמצעות לחצני החצים האופקיים כדי להבטיח כוונון מתאים לכל צינור. לחץ פעמיים על התאים והתאם את הצירים לגובה לעומת שטח. בחר את האוכלוסייה הגדולה היחידה באמצעות שער מלבני כדי לא לכלול כפילים ולאפשר לתוכנה להציע לתת לה שם כתאים בודדים באופן אוטומטי.

לאחר מכן, גרור שער זה לכל אוכלוסיות התאים ובדוק שה- gating מתאים לכל הדגימות. בחר את אוכלוסיית התאים הבודדים עבור הדגימה הלא נגועה והלא מותמרת. שנה את ציר Y ללייזר כחול מפוצה עבור ציר YFP וציר X ללייזר צהוב מפוצה עבור RFP.

בחר בכלי ההטיה הרביע ולחץ בקצה הימני העליון של אוכלוסיית התאים השליליים. החל הגדרה ראשונית זו על כל אוכלוסיות התאים הבודדים על-ידי גרירה אל שער האב בסרגל כל הדגימות. אם שערי הרביע אינם מפרידים בין האוכלוסייה באופן משביע רצון, שער את הרבעים הבודדים באמצעות כלי המצולע.

גלול אל הסוג הפראי SAM HD דגימה אחת בלבד כדי לבדוק את ההתאמה הנכונה בין התאים השליליים של YFP שאינם מותמרים לבין התאים החיוביים של YFP. השתמש בתצוגת קווי המתאר כדי להבחין בין התאים השליליים לבין תאי YFP עמומים. השתמש בחלוקה הטובה ביותר בין YFP שלילי לחיובי שתקף לכל הדגימות וגלול בין הדגימות כדי לבדוק את ה- gating ביחס לחיוביות של YFP.

גלול אל הדגימה הנגועה ב- HIV RFP לא מותמר ובדוק אם ההבחנה בין RFP שלילי לא נגוע לחיובי RFP נגוע נכונה. השתמש בתצוגת קווי המתאר במידת הצורך וגלול בין הדוגמאות הנותרות כדי לבדוק שה- gating תקף עבור כל הדוגמאות. כל דגימה דורשת ארבעה רבעים.

Q1 YFP חיובי, Q2 חיובי כפול, Q3 RFP חיובי ורבעון 4 שלילי כפול. פתח את עורך הטבלה וגרור את ארבעת שערי הרבעים לתוך לוח המחוונים. בחר כדי לתייק ולהצטיין מהתפריט הנפתח.

בחר את יעד הקובץ שלך ולחץ על צור טבלה. שמור את הגיליון האלקטרוני שנוצר בהתאם למוסכמות מקומיות למתן שמות לקבצים. לחץ על סמל עורך הפריסה כדי לייצא את ייצוגי העלילות ואסטרטגיות ההגשה.

בחר כל אוכלוסייה וגרור אותה לעורך עם הצירים, התוויות והמרווחים הנדרשים. כדי ליצור פריסה עם אותן חלקות המוצגות עבור כל הדוגמאות תחת מקטע האצווה, הזן אחת מהן בעמודה והקש על צור דוח אצווה. בתפריט קובץ, בחר את קנה המידה לרוחב והימנע ממעברי עמוד.

לאחר מכן שמור בפורמט הקובץ הנדרש. בגיליון האלקטרוני המיוצא, צור את העמודות כמתואר בכתב היד של הטקסט. השתמש בתוכנת ניתוח נתונים מתאימה כדי לממוצע את נתוני השכפול עבור כל מבנה SAM HD אחד, ולחשב את ערכי יחס ההגבלה.

חלקות YFP מייצגות לעומת RFP נוצרו עבור נתונים אופטימליים ולא אופטימליים. עלילת הנתונים התת-אופטימלית מצביעה על כך שההדבקה ב- HIV הייתה נמוכה מדי ויצרה קשיים בפיצוי ובגטינג. יחס ההגבלה היה 0.5, שהוא גבוה מהיחס הצפוי של 0.3.

חלקות יחס ההגבלה עבור גרסאות של SAM HD אחד ביחס לסוג הפרוע ושליטה שלילית נוצרו עבור הנתונים האופטימליים והתת-אופטימליים. בנתונים האופטימליים, הסוג הפרוע הראה את ההגבלה הצפויה של כ-0.2 ובקרה שלילית HD 206 ל-7 AA הייתה בעלת יחס הגבלה של 1.0. הגרסה R372D הייתה שונה באופן משמעותי מהסוג הפראי, אך לא שונה באופן משמעותי מהשליטה השלילית ואיבדה את היכולת להגביל.

בנתונים הלא אופטימליים, הבקרה השלילית התנהגה כצפוי אך הסוג הפראי הראה יחס הגבלה של 0.5 בשל שיעור ההדבקה הנמוך. R143D הראה פנוטיפ ביניים שונה סטטיסטית מהסוג הפראי והבקרה השלילית. הגרסה G209S הייתה שונה משמעותית מהסוג הפראי אך לא שונה משמעותית מהבקרה השלילית ולכן איבדה את היכולת להגביל.

חשוב שיהיו לכם הרבה תאי בקרה, במיוחד אם אתם חדשים בזרימת ציטומטריה. בעקבות זאת או במקביל, ניתוח ביוכימי של אותם מוטנטים יכול להתבצע כדי ליצור תמונה הוליסטית.