בדיקת פעילות מצומדת אנזימים בתפוקה גבוהה לבדיקת אינטראקציה של מולקולות קטנות עם dNTPase SAMHD1

שיטה זו מאפשרת לנו לאפיין אילו תרופות כימותרפיות עוברות הידרוליזה על ידי SAMHD1 ויכולות לשמש כבדיקת סקר לזיהוי מעכבי מולקולות קטנות של אנזים זה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה, זולה ומניבה כמות עצומה של מידע על האופן שבו מולקולות קטנות שונות מתקשרות עם אנזים זה. מי שתדגים את ההליך תהיה מרים, פוסט-דוקטורנטית מהקבוצה.

כדי להתחיל, הכינו מאגר תגובה מלא של SAMHD1 על ידי הוספת Tween-20 ו-TCEP לריכוזים הסופיים של 0.005% ו-0.3 מילימולר בהתאמה. הכן את תמיסת עצירת EDTA על-ידי הוספת EDTA לריכוז סופי של 7.9 מילימולר במאגר תגובה מלא של SAMHD1. הכינו תמיסה ירוקה מלכיט או MG על ידי ערבוב 10 חלקים של תמיסת מלאי MG עם 2.5 חלקים של 7% מוליבדט אמוניום ו-0.2 חלקים של 11%Tween-20.

באמצעות פיפטה רב ערוצית, מדללים באופן סדרתי תרכובות בדיקה בממס הרלוונטי בריכוז פי 100 מהריכוז הסופי בצלחת פוליפרופילן תחתונה עגולה ושקופה 96 בארות. דילול נוסף של תרכובות אלה עד פי 25 מהריכוז הסופי עם חיץ תגובה מלא של SAMHD1 כדי לשמור על ריכוז הממס הסופי מתחת ל-1% העבירו חמישה מיקרוליטרים של רכיב מדולל לבארות המתאימות של צלחת בדיקה שטוחה שקופה בעלת תחתית שטוחה של 384 בארות וחזרו על התהליך עם דגימות בקרה של ממס בלבד. להכנת תערובת האב של האנזים, יש לדלל חלבון SAMHD1 אנושי רקומביננטי ופירופוספטאז רקומביננטי במאגר תגובה מלא של SAMHD1 עד פי ארבעה מהריכוז הסופי הרצוי.

הכן מפעיל או מצע dGTP על ידי דילול התמיסה במאגר תגובה מלא SAMHD1 כדי להשיג ריכוז 50 מיקרומולרית. לבארות המכילות דילול תרכובות ובקרת ממס בלבד, יש להוציא חמישה מיקרוליטרים של תערובת האב פירופוספטאז SAMHD1, ולבארות הבקרה ללא אנזימים, להוסיף חמישה מיקרוליטרים של מאגר תגובה מלא של SAMHD1. לאחר מכן שחררו 10 מיקרוליטר של תמיסת dGDP לכל הבארות כדי להתחיל את התגובה ולדגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

כדי לעצור את התגובה, הוסף 20 מיקרוליטר EDTA להפסיק פתרון. לאחר הוספת 10 מיקרוליטר של פתרון עבודה MG לכל הבארות, מערבבים את התוכן באמצעות שייקר צלחת microwell מסלולית וצנטריפוגה את הצלחת ב 1000 x גרם במשך דקה אחת. דוגרים על הצלחת במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר וקוראים את הספיגה ב-630 ננומטר בקורא לוחות מיקרווול.

חישוב סטיית התקן של בארות הבקרה החיוביות ולאחר מכן חישוב הממוצע. באופן דומה עבור בארות הבקרה השלילית, לחשב את סטיית התקן ולאחר מכן לחשב את הממוצע. חישוב גורם Z הוא אינדיקטור לאיכות הבדיקה.

נרמל כל ערך ספיגה לערכים הממוצעים של פקדים חיוביים ושליליים. הגדרת הבקרה החיובית כפעילות 100% SAMHD1 והבקרה השלילית כפעילות 0%SAMHD1. עלילה פעילות SAMHD1 היא פונקציה של ריכוז התרכובת ומתאימה לעקומת תגובת מינון בשיפוע משתנה של ארבעה פרמטרים, המאפשרת קביעת ריכוז מעכב חצי מקסימלי של התרכובת.

לדלל מלאי אנלוגי של נוקלאוטידים ולהשלים את מאגר התגובה SAMHD1 עד פי ארבעה מהריכוז הסופי ולהעביר חמישה מיקרוליטרים לבארות המתאימות של צלחת בדיקה של 384 בארות. להכנת אנזים SAMHD1 או תערובת מאסטר פירופוספטאז, יש לדלל חלבון SAMHD1 אנושי רקומביננטי ואת Escherichia coli pyrophosphatase במאגר תגובה מלא של SAMHD1 עד לריכוז סופי כפול מהריכוז הסופי הרצוי. הכינו רק תמיסת פירופוספטאז על ידי דילול רקומביננטי Escherichia coli pyrophosphatase לריכוז סופי כפול מהריכוז הסופי הרצוי במאגר תגובה מלא של SAMHD1.

באופן דומה, הכינו את המפעילים GTP ו-dGTP alpha S על ידי דילול המלאי במאגר תגובת SAMHD1 מלא עד פי ארבעה מהריכוז הסופי. יש לוותר על חמישה מיקרוליטרים של האקטיבטור, GDP או dGTP אלפא S או חיץ תגובה מלא של SAMHD1 לבארות המתאימות של צלחת בדיקה של 384 בארות המכילה את האנלוגים הנוקלאוטידים. התחל את התגובה על ידי ניפוק 10 מיקרוליטר של תערובת מאסטר פירופוספטאז SAMHD1, פירופוספטאז בלבד או חיץ תגובה מלא של SAMHD1 לבארות המתאימות ודגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר עצירת התגובה באמצעות תמיסת עצירה EDTA, הוסף 10 מיקרוליטר של פתרון עבודה MG לכל הבארות. לאחר ערבוב התכולה, צנטריפוגות את הצלחת ב 1000 x גרם במשך דקה אחת ולדגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן למדוד את הספיגה ב 630 ננומטר.

חשב את ערכי הספיגה הממוצעים עבור בארות התגובה pyrophosphatase בלבד, אשר יהיה ערך הרקע. לאחר מכן הפחת את ערך הרקע מהבארות המתאימות בתגובות SAMHD1 או פירופוספטאז. לבסוף, התווה את ערכי הבליעה המתוקנים עבור כל אנלוגי נוקלאוטיד עם תנאי חיץ GTP ו- dGTP אלפא S.

במחקר הנוכחי, החומר הסופג עלה עם עלייה בריכוז נתרן פוספט בעקבות דגירה עם מגיב ירוק מלכיט והגיע לרוויה בריכוז של 0.25 מילימולרי. טווח הזיהוי הליניארי של פוספט נראה בין 0.004 ל -0.03 מילימולרי. מודגמת הדרישה של רכיבי בדיקה להשגת פעילות SAMHD1 מדידה.

לא SAMHD1 ולא פירופוספטאז לבדם יכולים לייצר פוספט אורגני בנוכחות dGTP. עם זאת, כאשר כל רכיבי הבדיקה היו נוכחים, נצפתה עלייה באות. עקומות תגובת המינון שהתקבלו עבור תרכובות מעכבות SAMHD1 הראו כי ריכוזים הולכים וגדלים מעכבים ביעילות את פעילות SAMHD1.

Hydroxyurea אינו מעכב את פעילות SAMHD1 במבחנה, אשר התבטאה בפעילות SAMHD1 שלא נפגעה עם מינונים הולכים וגדלים של הידרוקסיוריאה. קישור dGTP לשני האתרים האלוסטטריים מפעיל את SAMHD1, ומאפשר הידרוליזה עוקבת של נוקלאוטיד זה, בעוד ששלושת ה-dNTPs הקנוניים האחרים דורשים תחילה הפעלת GTP של האתר האלוסטרי הראשון לפני שהם יכולים לקשור את האתר האלוסטארי השני ולאחר מכן לעבור הידרוליזה באתר הקטליטי. עבור אנלוגים נוקלאוטידים, clofarabine triphosphate הוא אתר אלוסטרי שני activator ומצע כמו פעילות נצפתה בנוכחות GTP.

בעוד cytarabine triphosphate הוא מסוגל רק לתפוס את האתר הקטליטי כמו dGTP אלפא S נדרש כדי לצפות בפעילות. לא נצפתה פעילות עם גמציטאבין טריפוספט. לאחר זיהוי מולקולות קטנות המעכבות SAMHD1 בבדיקה זו על ידי גישות פיזיקליות, כגון מבחני שינוי תרמי, ניתן להשתמש כדי לחקור את מעורבות המטרה.

השיטה שהוצגה כאן עזרה לנו להבין אילו מהתרופות לסרטן יכולות לעבור הידרוליזה על ידי SAMHD1 ולבסס את האנזים הזה כיעד טיפולי פוטנציאלי להתגבר על עמידות לתרופות.