ייצור חלבוני PRMT רקומביננטיים באמצעות מערכת וקטור הביטוי של Baculovirus

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא הקרנת ביטוי של מבנה מרובה של חלבון ארגינין מתילטרנספראזים בייצור בקנה מידה גדול כדי להשיג את כמות מיליגרם של החלבון למחקרים ביוכימיים, ביופיזיים, ומבניים במצב נתמך בינוני, חסכוני בכיסוי פלטפורמת הביטוי S, מערכת וקטור ביטוי baculovirus. ד"ר עלמה סיטובה תציג את הצעדים הבאים. לדלל את תאי SF9 הגדלים באופן אקספוננציאלי לצפיפות התאים הסופית של 0.4 מיליון למיליון במדיית החרקים ללא סרום, ולשפוך לתוך מאגר ריאגנט סטרילי.

השתמש פיפטה רב ערוצי לתכנות כדי לזרוע 0.5 mils של תאי SF9 מדולל לכל באר של צלחת 24-well. נפח זה מספיק כדי להבטיח כיסוי שווה של משטח העבודה של הבאר. עם זאת, היא אינה מדללת את תמהיל ההעתקה יותר מדי, דבר המאפשר יעילות טרנס-פליטה.

תווית באר אחת של הלוח כתא בלבד, ולהשתמש בו כפקד להשוואה של התא transfected ולא נגוע כדי להעריך סימנים פוטנציאליים של זיהום. דגירה את הצלחות ב 27 מעלות עד הצורך, כשעה, כדי לאפשר לתאים לצרף את צלחות תרבות התא. מדללים מגיב טרנס-פקציה מעורב היטב במדיום החרקים הלא מפואר ובמאגר ריאגנט סטרילי, ומערבבים בעדינות במשך 10 שניות.

באמצעות פיפטה 12 ערוצים, להעביר 102 microliters של ריאגנט עסקה מדולל לתוך צלחת סטרילית 96 MicroWell. מעבירים 10 מיקרוליטרים של 0.2 מיקרוגרם למיקרוליטר של דנ"א bacmid רקומביננטי לבאר המתאימה של צלחת MicroWell 96-well ומערבבים על ידי טלטול עדין, הקשה על הצלחת מהצדדים. דגירה תערובת transfection במשך 15 עד 20 דקות עבור היווצרות מורכבת.

באמצעות פיפטה מתכווננת בת שישה ערוצים המיועדת להעברה בין צלחת של 96 ל-24 באר, כיסוי תערובת ההעתקה על התאים מבחינת טיפה בבארות מקבילות של לוחות ההמרה, והדגירה במשך ארבע שעות ב-27 מעלות. כדי להבטיח התפלגות שווה של תערובת transfection על המונולייר של התאים, בעדינות לנענע את הצלחות הלוך ושוב מספר פעמים במהלך זמן הדגירה. ארבע עד חמש שעות לאחר זמן transfection, להוסיף 1.5 מיל של מדיה חרקים ללא סרום.

להשלים אותו עם 10%הסופי של סרום שור עוברי מומת חום ו 1% אנטיביוטי ו antimycotic. דגירה תאים באינקובטור 27 מעלות במשך 72 עד 96 שעות. בעדינות לנענע את צלחות transfection פעם ביום כאשר הדבר אפשרי.

חפש סימנים של זיהום ניכר בתאים נגועים ב 72 עד 96 שעות לאחר ההדבקה. ארבעה עד חמישה ימים לאחר transfection, סימנים של זיהום צריך להיות ניכר בתאים transfected בהשוואה לתאי הבקרה תחת מיקרוסקופ הפוך, ואת baculoviruses רקומביננטי הראשוני מופרש לתוך המדיום תרבות התא צריך להיות מוכן לאסוף. השתמש multichannel אלקטרוני לתכנות כדי לאפשר בו זמנית את האוסף של וירוסי P1, זיהום של תאי SF9 זרע טרי בזיהום של תאים תלויים שלהם 24 בלוקים היטב עם 150 microliters של וירוסי P1.

ספין למטה שאר המניות הקולקטיביות P1 ויראלי במשך 15 דקות, לכסות את 24 בלוקים היטב עם תרבות ההשעיה של תאי SF9 נגועים עם גיליון AirPore. דגירה בלוק 24 גם ב 27 מעלות עם רועד ב 245 RPMs במשך 72 עד 96 שעות. ארבעה ימים לפני זמן הייצור המתוכנן, התפצלו תאי SF9 הגדלים באופן אקספוננציאלי, בצפיפות תאים סופית של 2 מיליון למיליון לתוך חוט טלטול זכוכית ארלנמייר עם מבלבלים במדיית חרקים ללא סרום המכילה 1% אנטיביוטיקה סופית ואנטימיקוטית.

שלב זה ייצור תרבות השעיה של תאי חרקים נגועים ווירוסי P2 ב supernatant לזיהום של תאים חדשים באצוות הייצור. הוסף את הנגיפים P2 המתאימים דגירה תאים נגועים בטמפרטורה נמוכה יותר של 25 מעלות כדי להאט את צמיחת התא, רועד ב 165 RPMs על שייקר מסלולית עם שבץ של אינץ 'אחד. ארבעה ימים לפני זמן הייצור המתוכנן, זרע שני ליטרים של תאי SF9 הגדלים באופן אקספוננציאלי במדיה ללא סרום חרקים לצפיפות התא של 1 מיליון למיליון, בבקבוקון טלטול 2.8 ליטר פרנבך.

לנער את הבקבוק ב 27 מעלות עם רעידות ב 150 RPMs. מדען המחקר אשלי האצ'ינסון ידגים את הפרוטוקול הבא. לפצל ארבעה ליטרים של תאי SF9 הגדלים באופן אקספוננציאלי ומדיה ללא סרום חרקים לצפיפות התא הסופית של 4 מיליון למיליון לבקבוקי ריאגנט גדולים של חמישה ליטרים.

הוסף 10 עד 12 מיל של תרבות ההשעיה של תאי חרקים נגועים baculovirus. דגירה את התרבות הנגועה של תאי SF9 בשייקר רועד 145 סל"ד בטמפרטורה נמוכה יותר של 25 מעלות צלזיוס במשך 72 עד 96 שעות. כמויות מיליגרם של מספר חלבונים רקומביננטיים ממשפחת PRMT מבטאים את הייצור המיידי של הבקולווירוס בתאי SF9 משמשים למחקרי הדרכה ביוכימיים ביוכימיים, כפי שניתן לראות באיור חמש.

ב SGC, מבני גביש נפתרו ב מופקד לתוך מאגר נתוני החלבון עבור צורות אורך מלא או קטוע של החלבונים PRMT4, 6, 7, ו 9 עם בדיקה כימית שונים מעכבים. פלסמידים ביטוי עבור PRMTs אלה הופקדו כדי להוסיף איסוף גנים על ידי SGC והם זמינים לקהילת המחקר. בסרטון זה, הדגשנו אלמנטים מרכזיים להקרנת משלחת מוצלחת של המבנה המרובים שלהם של החלבון ארגינין מתילטרנספראזים בייצור בקנה מידה גדול במערכת הביטוי baculovirus.

השימוש בפיפטות הרב-ערוציות הניתנות לכוונון ולתיכנות באופן קבוע, הפך את כל התהליך שלהן למהיר ויעיל יותר. שימוש בעל ביצועים גבוהים ופחות רעיל בתאים עבור התאים, מגיב transfection עבור הדור של וירוסים רקומביננטי הוביל חסכוני יותר פרוטוקול transfection טיפול בתא זה. זיהום של אצווה בקנה מידה גדול לייצור חלבון עם תרבות ההשעיה של baculovirus נגוע בשישה תאים הפחית באופן משמעותי את העבודה זמן רב צעד הגברה המתנע חיוני.

הוא למשל, צנטריפוגה זה עם תרבות מיוחדת של תאים נגועים. זה כמובן לא כולל את הטיפול הנוסף של התאים הנגועים ב להימנע ההדוק שלהם השפלה וירוס. תרבות ההשעיה תרבות תחזוקת תאים בקנה מידה זה את הייצור בכלי התרבות היה נפח שדה גבוה לעזור לנו להתגבר על המגבלה של נפח הייצור ולאמץ פלטפורמה בקנה מידה גדול.

זה מאוד שימושי עבור מעבדות ללא גישה bioreactors או שטח מוגבל בצינור הייצור. למרות שהפרוטוקול שלנו תואר עבור החלבונים של משפחת החלבון ארגינין מתיל טרנספראזס, אותה גישה יכולה להיות מיושמת על כל משפחת חלבונים אחרים הדורשים פלטפורמת ביטוי כדי להשיג כמות מספקת של החלבון שלהם למחקרי הדרכה ביוכימיים.