ניתוח נפח בלוטות הלימפה על ידי הדמיית אולטרסאונד בתדר גבוה במיוחד במודל העכבר המהונדס גנטית Braf /Pten של מלנומה

השיטה שלנו מאפשרת ניטור הגידול במעורבות גרורתית של בלוטות הלימפה המפשעתיות על ידי מדידת הגידול בנפחן. שיטה לא פולשנית זו נסבלת היטב, ולכן ניתן לתזמן מפגשי הדמיה מרובים על אותה חיה ניסיונית במהלך שבועיים. שיטה זו אידיאלית להערכת ההשפעה של טיפול תרופתי על מחלות גרורתיות.

יישמנו שיטה זו למודל מלנומה Braf / Pten, אבל באופן עקרוני, זה יכול להיות מותאם כדי להעריך את היעילות של תרופות שונות במגוון מודלים של עכבר פרה קליני של סרטן גרורתי. הדגמת ההליך תהיה ד"ר מריאנה ויטילו, פוסט-דוקטורנטית מהמעבדה שלי, וד"ר קלאודיה קוסמיק, חוקרת עמיתה ב-IFC-CNR. עבור אינדוקציה מלנומה, להחיל שלושה microliters של חמישה מילימולרי 4-hydroxytamoxifen על כ סנטימטר מרובע אחד של עור מגולח של הגב העליון במשך שלושה ימים ברציפות.

שישה שבועות לאחר צביעת העור, השתמשו בקליפרים כדי למדוד את נפח הגידול העיקרי, ובסופו של דבר, של גרורות תת עוריות. לאחר מכן, השתמש הדמיית אולטרסאונד כדי למדוד את הנפח של בלוטות הלימפה מפשעתיות. לאחר ניתוח הגידול העיקרי ובלוטות הלימפה על ידי בדיקה חזותית, excise אותם למחקרים היסטולוגיים.

לאחר אישור הרדמה, להעביר את החיה ללוח מחומם של תחנת הדמיה אולטרסאונד בתדר גבוה במיוחד, מחזיק את החיה בתנוחה עלובה. התאם את טמפרטורת הלוח באמצעות בדיקה רקטלית משומנת בג'לי נפט כדי לשמור על טמפרטורת הגוף של העכבר בטווח הפיזיולוגי. מצופים את כפות הרגליים הקדמיות והאחוריות בדבק מוליך ומדביקים אותן לאלקטרודות צלחת האק"ג המוטמעות בלוח.

ודא שהפרמטרים הפיזיולוגיים נרכשים ומוצגים כראוי. הסר את השיער משני האזורים מפשעתיים על ידי החלת סוכן depilatory וציפוי אותם עם מדיום צימוד אקוסטי. לאחר מכן, מהדק את הבדיקה הליניארית אולטרסאונד בתדר גבוה במיוחד לתוך מנוע 3D מיוחד מוטבע בתחנת ההדמיה, המאפשר תנועה אוטומטית צעד של הגשוש.

כראוי לכוון ולהתאים את המיקום של הבדיקה אולטרסאונד כדי לקבל תמונות גישה קצרה של בלוטות הלימפה מפשעתי, ולמקם את האזור של עניין את אזור המוקד. הגדר את מרחק הסריקה בין שניים לחמישה מילימטרים, גודל צעד ל -44 מיקרומטר עם תוצאה של 46 עד 114 שלבי סריקה לכל פרוסת בלוטות הלימפה, וזמן רכישה של דקה עד שלוש דקות לכל בעל חיים. סרוק את כל הנפח של בלוטות הלימפה המפשעתיות כרצף של תמונות במצב B 2D, רכישת תמונות ברמות מרובות על ידי תנועה ליניארית של המתמר עם גדלי צעדים בסולם מיקרומטר כדי ליצור נתונים תלת-ממדיים במונחים של נשימה ולולאות cine מגודרות לב.

לאחר ההדמיה, אחסן באופן דיגיטלי את התמונות שנרכשו בתבנית גולמית לניתוחים לא מקוונים נוספים. לאחר עיבוד תמונות אולטרסאונד, פתחו את ערכת הנתונים של תמונות בלוטות הלימפה המפשעתיות התלת-ממדיות, בחרו בשיטה מרובת פרוסות ולחצו על כפתור 'התחל' כדי להמחיש הן את המסגרות הנוכחיות והן את התמונות הממוזערות של כל המסגרות המתאימות לכל תמונה שנלכדה במהלך רכישת התלת-ממד. בחר את התמונה הממוזערת של המסגרת הראשונה שבה בלוטות הלימפה ניכרת כדי לטעון אותה לתצוגת קווי המתאר.

בתצוגת המתאר, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי להוריד נקודות לאורך גבול בלוטות הלימפה. לאחר שנקבע מספר הנקודות הרצוי, ללקק ימינה כדי להשלים את קווי המתאר. לאחר השלמת קווי המתאר הראשונים, השתמשו בתצוגת התמונות הממוזערות כדי לבחור את התמונה הבאה לקווי מתאר.

במידת הצורך, דלג/י על מספר תמונות בין קווי מתאר כדי להפחית את מספר המעקבים הידניים הדרושים לכל אמצעי אחסון תלת-ממדי. חזור על תהליך זה עד לחלוקה לרמות של אמצעי האחסון כולו ולאחר מכן לחץ על סיום. בסביבת העבודה של החלון במצב תלת-ממד, לחצו על סמל מדידת עוצמת הקול מתחת לאזור תצוגת התמונה כדי להמחיש את הערך המספרי של נפח בלוטות הלימפה, ולהפעיל את תצוגת פני השטח עם העיבוד התלת-ממדי של נפח בלוטות הלימפה.

טיפול בעכברים עם 4-hydroxytamoxifen גורם לפעילות האנזים CreER, וגורם למתג ברמה הגנומית מ בראף מסוג בר ל- Braf V600E שעבר מוטציה, בעוד Pten הולך לאיבוד. ארבעה שבועות לאחר טיפול 4-hydroxytamoxifen, גידולים ראשוניים להגיע לנפח של 50 עד 100 מילימטרים מעוקבים ואת הצמיחה שלהם ניתן למדוד על ידי calipers במשך שבועיים נוספים, ובכך מראה עלייה הדרגתית פיגמנטציה נצפתה בלוטות הלימפה מפשעתית. מרבצי המלנין הם תמיד בשל נוכחות של תאי מלנומה גרורות, כפי שאושר על ידי כתמים אימונוהיסטוכימיקלים של מלנומה אנטיגן מלנה ו Braf V600E.

בסוף שלב הפילוח, כל החלקים הראו את שכבת העל של קווי המתאר החיצוניים של בלוטות הלימפה. העיבודים התלת-ממדיים של בלוטות לימפה מפשעתיות ימניות, מנותחים בארבעה, חמישה ושישה שבועות לאחר טיפול 4-HT מוצגים כאן. הגידול בנפח של בלוטות הלימפה המפשעתיות השמאלית והימנית של אותה חיה לאורך זמן היה גם כימת.

מומלץ להצמיד הדמיית אולטרסאונד עם כתמים אימונוהיסטוכימיים מתאימים, כך שנוכחותם של תאים סרטניים מאושרת ברמה המולקולרית. מלבד בלוטות הלימפה, הנפח של גרורות תת עוריות יכול גם להיות במעקב לאורך זמן באמצעות הדמיית אולטרסאונד. אם מסגרת הזמן של שבועיים קצרה מדי כדי להעריך את ההשפעות של התרופה תחת המחקר, בחר אתר אינדוקציה היקפי יותר או גנוטיפ פחות נוטה לגידול.