Name: שלוש שיטות לניתוח ביטויים דיפרנציאליים לרצף RNA: לימה, EdgeR, DESeq2 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: למדו ניתוח ביטויים דיפרנציאליים ב-RNA-seq באמצעות שלוש שיטות מובילות: limma, EdgeR ו-DESeq2. הפרוטוקול מדגים יישום בנתוני סרטן כולדוקי עם RStudio לזיהוי גנים מבוטאים באופן שונה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מענק מס ' 81860276) ופרויקטים מרכזיים של הקרן המיוחדת של תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית (מענק מס '2018YFC1003200).

הערה: פתח את תוכנית R-studio לטעון קובץ R "DEGs.R", הקובץ ניתן לרכוש מקבצים משלימים / סקריפטים.
1. הורדה ועיבוד מראש של נתונים
<ol><li>הורד את נתוני ספירת הרצוף בעל התפוקה הגבוהה (HTSeq) של כולנגיוקרצינומה (CHOL) מאטלס הגנום הסרטני (TCGA). שלב זה יכול להיות מושג בקלות על ידי קוד R הבא.<ol>
<li>לחץ על הפעל כדי להתקין חבילות R.</li>
		<li>לחץ על הפעל כדי לטעון חבילות R. if(!requireNamespace("BiocManager", בשקט=TRUE)) + install.packages("BiocManager") BiocManager::install(c("TCGAbiolinks", "ניסיון מסוכם"))</li>
		<li>הגדר את ספריית העבודה. ספריה (TCGAbiolinks) ספריה (ניסיון מסוכם) setwd("C:/Users/LIUSHIYI/Desktop")</li>
		<li>בחר את סוג הסרטן. סרטן < - "TCGA-CHOL"</li>
		<li>הפעל את קוד ה- R מהקובץ "GDCquery.R" כדי להוריד את הנתונים. ניתן לרכוש את הקובץ "GDCquery.R" מקבצים/סקריפטים משלימים: מקור("קבצים משלימים/סקריפטים/GDCquery.R") head(cnt) ##TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ##ENSG00000000003 4262 ##ENSG00000000005 1 ##ENSG00000000419 1254 ##ENSG00000000457 699 ##ENSG00000000460 239 ##ENSG00000000938 334 הערה: לאחר ביצוע, נתוני ספירת CHOLHTSeq יורדו וייקראו "cnt", כאשר שורות מייצגות מזהי גנים ועמודות של הרכב מייצגות מזהים לדוגמה. אנא שימו לב למספרים במיקומים 14-15 בתמותות הת"י לדוגמה; מספרים הנעים בין 01 ל -09 מצביעים על גידולים הנעים בין 10 ל -19 מצביעים על רקמות רגילות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>המר זהות גנים של אנסמבל לסמלים גנטיים.<ol>
<li>יבא את קובץ הביאורים ל- R בהתאם לנתיב האחסון שלו. ניתן לרכוש את קובץ הביאורים (gencode.v22.annotation.gtf) מקבצים משלימים. gtf_v22 <- rtracklayer::import('קבצים משלימים/gencode.v22.annotation.gtf')</li>
		<li>הפעל את קוד R מ"gtf_v22. קובץ R, אשר ניתן לרכוש מקבצים משלימים / סקריפטים: מקור("קבצים משלימים/סקריפטים/gtf_v22. R")</li>
		<li>החל את הפונקציה "ann" כדי להמיר את זהות הגן הרכב לסמלים גנטיים. cnt= ann(cnt,gtf_v22)</li>
	</ol>
</li>
	<li>סינון גנים בעלי ביטוי נמוך<ol>
<li>לחץ על הפעל כדי להתקין את חבילת R "edgeR". BiocManager::install("edgeR")</li>
		<li>לחץ על הפעל כדי לטעון את חבילת R "edgeR". library(edgeR)</li>
		<li>הפעל את קוד ה- R הבא כדי לשמור על גנים עם ערכי ספירה למיליון (עלות לאלף חשיפות) הגדולים מאחד מכל שתי דגימות לפחות. שמור <- שורותsums(cnt)>1)>=2 cnt <- as.matrix(cnt[keep,]) הערה: נעשה שימוש בערך ספירה למיליון (עלות לאלף חשיפות) במקום ספירת הקריאה כדי לבטל את הסטייה הנגרמת על-ידי עומקי רצף שונים.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. ניתוח ביטוי דיפרנציאלי באמצעות "לימה"
<ol><li>לחץ על הפעל כדי להתקין את חבילת R "limma". BiocManager::install("limma")</li>
	<li>לחץ על הפעל כדי לטעון את חבילות R "לימה", "edgeR". library(limma) library(edgeR)</li>
	<li>הפעל את קוד ה- R הבא כדי ליצור את מטריצת העיצוב. קבוצה <- substring(colnames(cnt),14,15) # Extract group information קבוצה [קבוצה %ב% "01"] <- "Cancer" # set '01' as tumor tissue קבוצה [קבוצה %ב% "11"] <- "Normal" # set '11' as normal tissue קבוצה <- factor (group, levels = c("Normal","Cancer"))
	<ol><li>צור את מטריצת העיצוב. עיצוב <- model.matrix (~group) שמות שורה (design) <- colnames(cnt)</li>
		<li>צור את האובייקט DGEList. dge <- DGEList(counts = cnt, group = group)</li>
		<li>לנרמל את הנתונים. dge <- calcNormFactors(dge, method = "TMM")</li>
		<li>הפעל את קוד ה- R הבא כדי לבצע את ניתוח הביטוי הדיפרנציאלי המבוסס על שיטת מגמת לימה. dge אובייקט #An של מחלקה "DGEList" ##$counts ##TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ##TSPAN6 4262 ##DPM1 1254 ##SCYL3 699 ##C1orf112 239 ##FGR 334</li>
		<li>חשב את ערך ה- CPM. logdge <- cpm(dge, log=TRUE, prior.count=3)</li>
		<li>לחץ על הפעל כדי להתאים למודל ליניארי כדי לחזות את הנתונים או להסיק את קשר הגומלין בין משתנים. התאם <- lmFit (logdge, design)</li>
		<li>חשב את ערך T, ערך F וסיכויי יומן רישום בהתבסס על Bayesian. התאם <- eBayes(בכושר, מגמה= TRUE)</li>
		<li>חלץ את טבלת התוצאות. res_limma<- as.data.frame(topTable(התאמה,n=Inf)) ראש(res_limma) ## logFC AveExpr t P.Value adj. פ.ואל. ##RP11-252E2.2 -4.899493 -2.488589 -20.88052 2.386656e-25 4.931786e-21 47.28823 ##BX842568.1 -4.347930 -2.595205 -20.14532 1.082759e-24 1.118706e-20 45.83656 ##CTC-537E7.3 -5.154894 -2.143292 -19.59571 3.452354e-24 2.216114e-20 44.72001 ##RP11-468N14.3 -6.532259 -2.029714 -19.49409 4.289807e-24 2.216114e-20 44.51056 ##AP006216.5 -4.507051 -2.670915 -19.25649 7.153356e-24 2.956339e-20 44.01704 ##RP11-669E14.4 -4.107204 -2.828311 -18.93246 1.448209e-23 4.987633e-20 43.33543 #The תוצאה של ניתוח ביטוי דיפרנציאלי נשמרת ב- "res_limma", הכולל את מזהה הגן, ערך שינוי הקיפול של log2 (logFC), רמת הביטוי הממוצעת של log2 של הגן בניסוי (AveExpr), סטטיסטיקת t שהשתנתה (t), ערך p מחדש (P.Value), ערך p המתוקן של שיעור גילוי כוזב (FDR) (adj). פ.ואל) וסיכויי היומן של הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי (ב) הערה: הפונקציה "calcNormFactors()" של "edgeR" שימשה לנרמול הנתונים כדי לחסל את ההשפעה הנגרמת על ידי הכנת מדגם או בניית ספריה ורצף. בבניית מטריצת עיצוב, יש צורך להתאים עיצוב ניסיוני (למשל, סוג רקמה: רקמות רגילות או גידול) כדי לדגום מזהים של המטריצה. מגמת לימה מתאימה לנתונים שעומק הרצף שלהם זהה, ואילו לימה-וום מתאים: (i) כאשר גודל ספריית הדגימה שונה; (ii) נתונים שאינם מנורמלים על-ידי TMM; (iii) יש הרבה "רעש" בנתונים. logFC חיובי אומר כי הגן הוא מוסדר למעלה בניסוי, בעוד מספר שלילי אומר כי הגן הוא למטה מוסדר.</li>
		<li>זהה את הדי-ג'י. res_limma$sig <- as.factor( ifelse(res_limma$adj. P.Val < 0.05 & res_limma$logFC) > 2, ifelse(res_limma$logFC > 2 ,'למעלה','down'),'')) # הערך של adj.p < 0.05 ו- |log2FC| >= 2 הם סף לזיהוי DEGs סיכום(res_limma$sig) ##down לא למעלה ##1880 ​17341 1443</li>
		<li>פלט טבלת התוצאות לקובץ. כתיבה.csv(res_limma, קובץ = 'result_limma.csv')</li>
		<li>לחץ על הפעל כדי להתקין את חבילת R "ggplot2". install.packages("ggplot2")</li>
		<li>לחץ על הפעל כדי לטעון את חבילת R "ggplot2". library(ggplot2)</li>
		<li>הפעל את קוד R מ "הר הגעש. R" כדי ליצור את חלקת הר הגעש. הקובץ "הר געש. R" ניתן לרכוש מקבצים משלימים. מקור("קבצים משלימים/ סקריפטים / הר געש. R") הר געש(res_limma,"logFC","adj. פ.ואל",2,0.05) הערה: ניתן למפות גנים למיקומים שונים בהתאם לערכי log2FC ו- adj-p שלהם, ה- DEGs המפוקחים למעלה נצבעים באדום, ו- DEGs המוסדר כלפי מטה נצבע בירוק.</li>
		<li>לחץ על ייצוא כדי להציל את חלקת הר הגעש. הערה: ניתן ליצור ולהוריד את מגרשי הר הגעש בפורמטים שונים (למשל, pdf, TIFF, PNG, פורמט JPEG). ניתן למפות גנים למיקומים שונים בהתאם לערכי log2FC ו- adj p שלהם, ה- DEGs המוסדרים (log2FC > 2, adj p < 0.05) צבועים באדום, ו- DEGs המוסדר כלפי מטה (log2FC < -2, adj p < 0.05) צבועים בירוק, שאינם DEGs צבועים באפור.</li>
	</ol></li>
</ol>3. ניתוח ביטוי דיפרנציאלי באמצעות "edgeR"
<ol><li>לחץ על הפעל כדי לטעון את חבילת R "edgeR". library(edgeR)</li>
	<li>הפעל את קוד ה- R הבא כדי ליצור מטריצת עיצוב. group <-substring(colnames(cnt),14,15) קבוצה [קבוצה %ב% "01"] <- "סרטן" קבוצה [קבוצה %ב% "11"] <- "רגיל" group=factor(קבוצה, רמות = c("נורמלי","סרטן")) עיצוב <-model.matrix(~קבוצה) שמות שורה(design) = colnames(cnt)</li>
	<li>לחץ על הפעל כדי ליצור את האובייקט DGEList. dge <- DGEList(counts=cnt)</li>
	<li>לנרמל את הנתונים. dge <- calcNormFactors(dge, method = "TMM")</li>
	<li>לחץ על הפעל כדי להעריך את הפיזור של ערכי ביטוי גנים. dge <- estimateDisp(dge, design, robust = T)</li>
	<li>לחץ על הפעל כדי להתאים מודל לספירת נתונים. התאם <- glmQLFit(dge, עיצוב)</li>
	<li>ערוך בדיקה סטטיסטית. התאם <- glmQLFTest (התאמה)</li>
	<li>חלץ את טבלת התוצאות. התוצאה נשמרת ב- "res_edgeR", הכוללת את ערך שינוי קיפול יומן הרישום, יומן הרישום עלות לאלף חשיפות, F, ערך p וערך p מתוקן של FDR. res_edgeR=as.data.frame(topTags(התאמה, n=Inf)) ראש(res_edgeR) ## logFCFC F PValue FDR ##GCDH -3.299633 5.802700 458.5991 1.441773e-25 2.979280e-21 ##MSMO1 -3.761400 7.521111 407.0416 1.730539e-24 1.787993e-20R ##CL1 -3.829504 5.319641 376.5043 8.652474e-24 5.516791e-20 ##ADI1 -3.533664 8.211281 372.6671 1.067904e-23 5.516791e-20 ##KCNN2 -5.583794 3.504017 358.6525 2.342106e-23 9.679455e-20 ##GLUD1 -3.287447 8.738080 350.0344 3.848408e-23 1.194406e-19 תוצאת #The נשמרת ב- "res_edgeR", הכוללת את ערך השינוי של קיפול יומן הרישום (logFC), עלות לאלף חשיפות של יומן רישום, F, ערך p וערך p מתוקן של FDR</li>
	<li>זהה את הדי-ג'י. res_edgeR$sig = as.factor( ifelse(res_edgeR$FDR < 0.05 & abs(res_edgeR$logFC) > 2, ifelse(res_edgeR$logFC > 2 'למעלה','down'),'not')) סיכום(res_edgeR$sig) ##down לא למעלה ##1578 15965 3121</li>
	<li>פלט טבלת התוצאות לקובץ. כתיבה.csv(res_edgeR, קובץ = 'res_edgeR.csv')</li>
	<li>צור את חלקת הר הגעש. הר געש(res_edgeR,"logFC","FDR",2,0.05)</li>
	<li>לחץ על ייצוא כדי להציל את חלקת הר הגעש.</li>
</ol>4. ניתוח ביטוי דיפרנציאלי באמצעות "DESeq2"
<ol><li>לחץ על הפעל כדי להתקין חבילות R "DESeq2". BiocManager::install("DESeq2")</li>
	<li>לחץ על הפעל כדי לטעון חבילות R "DESeq2". library(DESeq2)</li>
	<li>הפעל את קוד ה- R הבא כדי לקבוע את גורם הקבץ. group <-substring(colnames(cnt),14,15) קבוצה [קבוצה %ב% "01"] <- "סרטן" קבוצה [קבוצה %ב% "11"] <- "רגיל" group=factor(קבוצה, רמות = c("נורמלי","סרטן"))</li>
	<li>צור את האובייקט DESeqDataSet. dds <-DESeqDataSetFromMatrix (cnt, DataFrame(group), design = ~group) dds ##class: DESeqDataSet ##dim: 20664 45 ##metadata(1): גירסה ##assays(1): ספירה ##rownames(20664): TSPAN6 DPM1 ... RP11-274B21.13 LINC01144 שמות #rowData(0): ##colnames(45): TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ... ##colData שמות(1): קבוצה</li>
	<li>בצע את הניתוח. dds <- DESeq(dds)</li>
	<li>צור את טבלת התוצאות. res_DESeq2 <- data.frame(תוצאות(dds)) ראש(res_DESeq2) ## baseMean log2FoldChange lfcSE stat pvalue padj ##TSPAN6 4704.9243 -0.8204515 0.3371667 -2.433370 1.495899e-02 2.760180e-02 ##DPM1 1205.9087 -0.3692497 0.1202418 -3.070894 2.134191e-03 4.838281e-03 ##SCYL3 954.9772 0.2652530 0.2476441 1.071106 2.841218e-01 3.629059e-01 ##C1orf112 277.7756 0.7536911 0.2518929 2.992109 2.770575e-03 6.101584e-03 ##FGR 345.8789 -0.6423198 0.3712729 -1.730047 8.362180e-02 1.266833e-01 ##CFH 27982.3546 -3.8761382 0.5473363 -7.081823 1.422708e-12 1.673241e-11 הערה: התוצאה נשמרת ב- "res_DESeq2", הכוללת את הממוצע של ספירת הקריאה המנורמלת (baseMean), ערך שינוי קיפול יומן (log2FoldChange), שגיאת תקן שינוי קיפול יומן (lfcSE), סטטיסטיקת Wald (stat), ערך p המקורי (pvalue) וערך p מתוקן (padj)</li>
	<li>זהה DEGs. res_DESeq2$sig = as.factor( ifelse(res_DESeq2$padj < 0.05 & abs (res_DESeq2$log2FoldChange) > 2, ifelse(res_DESeq2$log2Foldשינוי > 2 'למעלה','down'),'not')) סיכום(res_DESeq2$sig) ##down לא למעלה ##1616 16110 2938</li>
	<li>פלט טבלת התוצאות לקובץ. כתיבה.csv(res_DESeq2, קובץ = 'res_DESeq2.csv')</li>
	<li>צור את חלקת הר הגעש. הר געש(res_DESeq2,"log2FoldChange","padj",2,0.05)</li>
	<li>לחץ על ייצוא כדי להציל את חלקת הר הגעש.</li>
</ol>5. דיאגרמת ון
<ol><li>לחץ על הפעל כדי להתקין את חבילת R "VennDiagram". install.packages("VennDiagram")</li>
	<li>לחץ על הפעל כדי לטעון את חבילת R "VennDiagram". ספריה (דיאגרמת ון)</li>
	<li>הפוך דיאגרמת ון של DEGs מוסדר. grid.newpage() grid.draw(venn.diagram(list(Limma=rownames(res_ לימה[res_limma$sig=="up",]), edgeR=rownames(res_edgeR[res_edgeR$sig=="up",]), DESeq2=rownames(res_DESeq2[res_DESeq2$sig== "למעלה",])), NULL, גובה = 3, רוחב = 3,יחידות = "in", קול="שחור", lwd = 0.3,fill =c("#FF6666", "#FFFF00", "#993366"), אלפא = c(0.5, 0.5, 0.5),ראשי = "למעלה מוסדר DEGs"))</li>
	<li>לחץ על ייצוא כדי לשמור את דיאגרמת חיתוך ההון.</li>
	<li>הפוך דיאגרמת ון של DEGs מוסדר למטה. grid.newpage() grid.draw(venn.diagram(list(Limma=rownames(res_ לימה[res_limma$sig=="down",]), edgeR=rownames(res_edgeR[res_edgeR$sig== "למטה",]), DESeq2=rownames(res_DESeq2[res_DESeq2$sig=="down",])), NULL, גובה = 3, רוחב = 3,יחידות = "in", קול="שחור", lwd = 0.3,fill =c("#FF6666", "#FFFF00", "#993366"), אלפא = c(0.5, 0.5, 0.5),ראשי = "DEGs מוסדר למטה"))</li>
	<li>לחץ על ייצוא כדי לשמור את דיאגרמת חיתוך ההון.</li>
</ol>

<ol><li>Tambonis, T., Boareto, M., Leite, V. B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Expression+Analysis+in+RNA-seq+Data+Using+a+Geometric+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential Expression Analysis in RNA-seq Data Using a Geometric Approach.</a> Journal of Computational Biology. 25, 1257-1265 (2018).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature Reviews. Genetics. 10, 57-63 (2009).</li>
<li>Anders, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Count-based+differential+expression+analysis+of+RNA+sequencing+data+using+R+and+Bioconductor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Count-based differential expression analysis of RNA sequencing data using R and Bioconductor.</a> Nature Protocols. 8, 1765-1786 (2013).</li>
<li>McDermaid, A., Monier, B., Zhao, J., Liu, B., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interpretation+of+differential+gene+expression+results+of+RNA-seq+data%3A+review+and+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Interpretation of differential gene expression results of RNA-seq data: review and integration.</a> Briefings in Bioinformatics. 20, 2044-2054 (2019).</li>
<li>Costa-Silva, J., Domingues, D., Lopes, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+differential+expression+analysis%3A+An+extended+review+and+a+software+tool%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq differential expression analysis: An extended review and a software tool.</a> PloS One. 12, 0190152(2017).</li>
<li>Law, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+analysis+is+easy+as+1-2-3+with+limma%2C+Glimma+and+edgeR%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">RNA-seq analysis is easy as 1-2-3 with limma, Glimma and edgeR.</a> F1000Research. 5, (2016).</li>
<li>Varet, H., Brillet-Guéguen, L., Coppée, J. Y., Dillies, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARTools%3A+A+DESeq2-+and+EdgeR-Based+R+Pipeline+for+Comprehensive+Differential+Analysis+of+RNA-Seq+Data%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SARTools: A DESeq2- and EdgeR-Based R Pipeline for Comprehensive Differential Analysis of RNA-Seq Data.</a> PloS One. 11, 0157022(2016).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43, 47(2015).</li>
<li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edgeR%3A+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26, Oxford, England. 139-140 (2010).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15, 550(2014).</li>
<li>Gentleman, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioconductor%3A+open+software+development+for+computational+biology+and+bioinformatics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics.</a> Genome Biology. 5, 80(2004).</li>
<li>Law, C. W., Chen, Y., Shi, W., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((voom%3A+Precision+weights+unlock+linear+model+analysis+tools+for+RNA-seq+read+counts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">voom: Precision weights unlock linear model analysis tools for RNA-seq read counts.</a> Genome Biology. 15, 29(2014).</li>
<li>Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+models+and+empirical+bayes+methods+for+assessing+differential+expression+in+microarray+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Statistical+Applications+in+Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 3, (2004).</li>
<li>Lund, S. P., Nettleton, D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+differential+expression+in+RNA-sequence+data+using+quasi-likelihood+with+shrunken+dispersion+estimates%5BTitle%5D)+AND+%22Statistical+Applications+in+Genetics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detecting differential expression in RNA-sequence data using quasi-likelihood with shrunken dispersion estimates.</a> Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology. 11, (2012).</li>
<li>Reeb, P. D., Steibel, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+statistical+analysis+models+for+RNA+sequencing+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Evaluating statistical analysis models for RNA sequencing experiments.</a> Frontiers in Genetics. 4, 178(2013).</li>
<li>Rocke, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+False+Positive+Rates+in+Methods+for+Differential+Gene+Expression+Analysis+using+RNA-Seq+Data%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Excess False Positive Rates in Methods for Differential Gene Expression Analysis using RNA-Seq Data.</a> bioRxiv. , (2015).</li>
<li>Agarwal, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+calibration+of+transcriptome+data+from+RNA-Seq+and+tiling+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomics%22%5BJournal%5D)">Comparison and calibration of transcriptome data from RNA-Seq and tiling arrays.</a> BMC genomics. 11, 383(2010).</li>
<li>Leng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBSeq%3A+an+empirical+Bayes+hierarchical+model+for+inference+in+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">EBSeq: an empirical Bayes hierarchical model for inference in RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 29, Oxford, England. 1035-1043 (2013).</li>
</ol>

כתב היד לא פורסם בעבר ואינו נשקלת לפרסום במקומות אחרים. כל המחברים תרמו ליצירת כתב יד זה לתוכן אינטלקטואלי חשוב וקראו ואישרו את כתב היד הסופי. אנו מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

תמלילים חריגים בשפע בסרטן ניתן לזהות בקלות על ידי ניתוח דיפרנציאלי RNA-seq5. עם זאת, היישום של ניתוח ביטוי דיפרנציאלי RNA-seq מוגבל לעתים קרובות כפי שהוא דורש מיומנויות מסוימות עם שפת R ואת היכולת לבחור שיטות מתאימות. כדי לטפל בבעיה זו, אנו מספקים מבוא מפורט לשלוש השיטות הידועות ביותר (לימה, EdgeR ו- DESeq2) וערכות לימוד להחלת ניתוח הביטוי הדיפרנציאלי של RNA-seq. זה יאפשר את הבנת הדמיון וההבדלים בכל שלוש השיטות, יאפשר בחירה של שיטה מתאימה לנתונים בודדים, ויאפשר לנו להבין את התהליכים הביולוגיים הדי...

RNA-sequencing (RNA-seq) היא אחת הטכנולוגיות הנפוצות ביותר בתעתיק עם יתרונות רבים (למשל, שחזור נתונים גבוה), והגדילה באופן דרמטי את הבנתנו את הפונקציות והדינמיקה של תהליכים ביולוגיים מורכבים1,2. זיהוי של תמלילים חריגים בהקשר ביולוגי שונה, הידועים גם כגנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי (DEGs), הוא צעד מפתח בניתוח RNA-seq. RNA-seq מאפשר לקבל הבנה עמוקה של מנגנונים מולקולריים הקשורים פתוגנזה פונקציות ביולוגיות. לכן, ניתוח דיפרנציאלי נחשב בעל ערך עבור אבחון, פרוגנוסטיקה וטיפולים של גידולים3,4,5. נכון לעכשיו, חבילות R/Bioconductor קוד פתוח יותר פותחו עבור ניתוח ביטוי דיפרנציאלי RNA-seq, במיוחד לימה, DESeq2 ו EdgeR1,6,7. עם זאת, ניתוח דיפרנציאלי דורש מיומנויות מסוימות עם שפת R ואת היכולת לבחור את השיטה המתאימה, אשר חסר בתוכנית הלימודים של החינוך הרפואי.
בפרוטוקול זה, המבוסס על נתוני ספירת הרנ"א-seq של cholangiocarcinoma (CHOL) שחולצו מאטלס הגנום הסרטני (TCGA), שלוש מהשיטות הידועות ביותר (לימה8, EdgeR9 ו- DESeq210) בוצעו, בהתאמה, על ידי תוכנית R11 כדי לזהות את DEGs בין CHOL ורקמות נורמליות. שלושת הפרוטוקולים של לימה, EdgeR ו- DESeq2 דומים אך יש להם שלבים שונים בין תהליכי הניתוח. לדוגמה, נתוני ספירת הרנ"א-seq המנורמלים נחוצים עבור EdgeR ו- limma8,9, ואילו DESeq2 משתמשת בסתירות ספריה משלה כדי לתקן נתונים במקום נורמליזציה10. יתר על כן, edgeR מתאים במיוחד לנתוני RNA-seq, בעוד שהלימה משמשת למיקרו-arrays ו- RNA-seq. מודל ליניארי מאומץ על ידי לימה כדי להעריך את DEGs12, בעוד הסטטיסטיקה ב edgeR מבוססים על הפצות בינומיות שליליות, כולל הערכת בייס אמפירית, בדיקות מדויקות, מודלים ליניאריים כלליים ובדיקות מעין סבירות9.
לסיכום, אנו מספקים את הפרוטוקולים המפורטים של ניתוח ביטוי דיפרנציאלי RNA-seq באמצעות לימה, DESeq2 ו- EdgeR, בהתאמה. בהתייחסם למאמר זה, משתמשים יכולים לבצע בקלות את הניתוח הדיפרנציאלי של RNA-seq ולבחור את שיטות הניתוח הדיפרנציאלי המתאימות עבור הנתונים שלהם.

<table><tbody><tr><td>R</td><td></td><td>גרסה 3.6.2</td><td>תוכנה חופשית</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td></td><td></td><td>תוכנה חופשית</td></tr></tbody></table>

שלוש שיטות לניתוח ביטויים דיפרנציאליים לרצף rna: לימה, edger, deseq2

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

רצף RNA (RNA-seq) היא אחת הטכנולוגיות הנפוצות ביותר בתעתיק, שכן היא יכולה לחשוף את הקשר בין השינוי הגנטי לתהליכים ביולוגיים מורכבים ויש לה ערך רב באבחון, פרוגנוסטיקה וטיפולים של גידולים. ניתוח דיפרנציאלי של נתוני RNA-seq חיוני לזיהוי תמלולים חריגים, ולימה, EdgeR ו- DESeq2 הם כלים יעילים לניתוח דיפרנציאלי. עם זאת, ניתוח דיפרנציאלי RNA-seq דורש מיומנויות מסוימות עם שפת R ואת היכולת לבחור שיטה מתאימה, אשר חסר בתוכנית הלימודים של החינוך הרפואי.
בזאת, אנו מספקים את הפרוטוקול המפורט לזיהוי גנים מבוטאים דיפרנציאלי (DEGs) בין cholangiocarcinoma (CHOL) ורקמות נורמליות באמצעות לימה, DESeq2 ו- EdgeR, בהתאמה, והתוצאות מוצגות בחלקות הר געש ודיאגרמות ון. שלושת הפרוטוקולים של לימה, DESeq2 ו- EdgeR דומים אך יש להם שלבים שונים בין תהליכי הניתוח. לדוגמה, מודל ליניארי משמש עבור סטטיסטיקה בלימה, בעוד ההתפלגות הבינומית השלילית משמשת ב- edgeR וב- DESeq2. בנוסף, נתוני ספירת הרנ"א-seq מנורמלים נחוצים עבור EdgeR ולימה, אך אינם נחוצים עבור DESeq2.
כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לשלוש שיטות ניתוח דיפרנציאליות: לימה, EdgeR ו- DESeq2. התוצאות של שלוש השיטות חופפות חלקית. לכל שלוש השיטות יש יתרונות משלהן, ובחירת השיטה תלויה רק בנתונים.

ישנן גישות שונות כדי לדמיין את התוצאה של ניתוח ביטוי דיפרנציאלי, ביניהם חלקת הר הגעש ודיאגרמת Venn משמשים במיוחד. לימה זיהתה 3323 DEGs בין CHOL ורקמות נורמליות עם |logFC|≥2 ו adj. P.Val &lt;0.05 כסף, ביניהם 1880 היו למטה מוסדר ברקמות CHOL ו 1443 היו מוסדר למעלה(איור 1a). בינתיים, edgeR זיהתה את דגי ה-DEGs המפוקחים מטה של 1578 ואת 3121 דגי DEGs מוסדרים כלפי מעלה (איור 1b); DESeq2 זיהה את דגי DEGs בפיקוח מטה 1616 ו DEGs 2938 למעלה מוסדר(איור 1...

פרוטוקול מפורט של שיטות ניתוח ביטוי דיפרנציאלי עבור רצף RNA סופק: לימה, EdgeR, DESeq2.

שלוש שיטות לניתוח ביטויים דיפרנציאליים לרצף RNA: לימה, EdgeR, DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...

שלוש שיטות ניתוח ביטוי דיפרנציאליות לרצף RNA:לימה, EdgeR ו- DESeq2. פתח את תוכנית RStudio ולאחר מכן טען קובץ R, DEGs. ניתן לרכוש את הקובץ מקבצים משלימים. אחד.הורדה ועיבוד מראש של data.1.1. הורד את נתוני ספירת הריצוף בעל התפוקה הגבוהה של כולנגיוקרצינומה מהאטלס של הגנום הסרטני. כרטיסיה זו יכולה להשיג בקלות על-ידי הקוד הבא.לחץ על הפעל כדי להתקין את חבילת ה- R. לחץ על הפעל כדי לטעון חבילת R. הגדר ספריית עבודה.בחר את סוג הסרטן. הפעל קוד R מקובץ GDCquery כדי להוריד את הנתונים. קובץ GDCquery ניתן לרכוש מקבצים משלימים / סקריפטים.לאחר ביצוע, ניתן להוריד את נתוני ספירת הרצף של Cholangiocarcinoma RNA ולהיקרא CNT, כאשר שורות מייצגות מזהי גנים ועמודות של הרכב מייצגים מזהי סמלים. אנא שימו לב למספרים במיקום 14 עד 15 בתמותות הסמלים. המספרים נעים בין 01 ל-09 מצביעים על גידולים ו-10 עד 19 מצביעים על רקמות רגילות.1.2.שיחה של מזהי גנים אנסמבל לסמלים גנטיים. יבא את קובץ הביאורים ל- R, בהתאם לנתיב האחסון שלו. ניתן לרכוש את קובץ הביאורים מקבצים משלימים.הפעל את קוד ה- R מקובץ gtf v22. אשר ניתן לרכוש מקבצים משלימים / סקריפטים. החל את פונקציית inn ולהמיר את זהות הגן של ההרכב לסמלים גנטיים.1.3.סנן גנים בעלי לבטא נמוך. לחץ על הפעל כדי להתקין את edgeR החבילה"לחץ על הפעל כדי לטעון את edgeR חבילת R"הפעל בעקבות קוד R כדי לשמור על גנים עם ספירות למיליון ערכים הגדולים מאחד לפחות שתי דוגמאות. שניים. ניתוח ביטוי דיפרנציאלי באמצעות limma"לחץ על הפעל כדי להתקין את לימה חבילת R"לחץ על הפעל כדי לטעון חבילת R limma"edgeR"הפעל את קוד R הבא כדי ליצור מטריצת עיצוב.חלץ מידע קבוצתי. הגדר 01 "כרקמת הגידול. הגדר 11 "כרקמה נורמלית.צור מטריצת עיצוב. צור את האובייקט DGEList. לנרמל את הנתונים.הפעל את קוד ה- R הבא כדי לבצע את ניתוח הביטוי הדיפרנציאלי המבוסס על שיטת מגמת לימה. חשב את ערך ה- CPM. לחץ על הפעל כדי להתאים למודל ליניארי כדי לחזות את הנתונים או להסיק את קשר הגומלין בין משתנים.חשב ערך T, ערך F וסיכויי יומן רישום בהתבסס על בייסיאן. חלץ את טבלת התוצאות. התוצאות של ניתוח ביטוי דיפרנציאלי נשמרות ב- res_limma", הכוללת את ערך השינוי של הקיפול של log2.רמת הביטוי הממוצעת של הגן בניסוי. סטטיסטיקת T שהשתנתה, ערך P, שיעור הגילוי השגוי תוקן p ערך ואת סיכויי יומן הרישום של גנים מבוטאים באופן דיפרנציאלי. זהה את הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי.אז ערך P המותאם פחות מ- 0.05, והערך המוחלט של שינוי יומן רישום כפול גדול או שווה לשניים הם סף כדי לסנן את הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי. התוצאות res limma מראה כי בהשוואה עם הרקמות הרגילות, 1, 443 גנים הם מוסדר, ו 1, 880 גנים מווסתים למטה ברקמות Cholangiocarcinoma. פלט טבלת התוצאות לקובץ.לחץ על הפעל כדי להתקין חבילת R ggplot2"לחץ על הפעל כדי לטעון חבילת R ggplot2"הפעל קוד R מקובץ הר הגעש כדי ליצור את חלקת הר הגעש ואת הר הגעש קובץ ניתן לרכוש מקבצים משלימים. ניתן למפות גנים למיקומים שונים בהתאם לשינוי הקיפול של log2 וערכי P מותאמים. אז גנים המוסדרים באופן דיפרנציאלי נצבעים באדום.והגנים המווסתים בדיפרנציה נצבעים בירוק. לחץ על ייצוא"כדי להציל את חלקת הר הגעש. שלוש. ניתוח ביטוי דיפרנציאלי באמצעות edgeR"לחץ על הפעל כדי לטעון את EdgeR חבילת R"הפעל את קוד ה- R הבא כדי ליצור מטריצת עיצוב.לחץ על הפעל כדי ליצור את אובייקט DGEList ולנרמל את הנתונים. לחץ על הפעל כדי להעריך את הפיזור של ערך ביטוי הגנים. לחץ על הפעל כדי להתאים מודל לספירת נתונים.ערוך בדיקה סטטיסטית. חלץ את טבלת התוצאות. התוצאה נשמרת ב- res edgeR", הכולל את ערך שינוי קיפול יומן הרישום, logCPM, F, p value וקצב הגילוי השגוי שתוקן p.זהה את הגנים המבוטאים באופן דיפרנציאלי. התוצאה res edgeR"מראה כי בהשוואה עם הרקמות הרגילות, 3, 121 גנים הם מוסדר, ו 1, 578 גנים מווסתים למטה ברקמות Cholangiocarcinoma. פלט טבלת התוצאות לקובץ.צור את חלקת הר הגעש. לחץ על ייצוא כדי להציל את חלקת הר הגעש. ארבע. ניתוח ביטויים דיפרנציאליים באמצעות DESeq2.לחץ על הפעל כדי להתקין את חבילת R DESeq2"לחץ על הפעל כדי לטעון את חבילת R DESeq2"הפעל את קוד ה- R הבא כדי לקבוע את גורם המישוש. צור את אובייקט ערכת הנתונים DESeq2. בצע ניתוח.צור את טבלת התוצאות. התוצאה נשמרת ב- res DESeq2, הכולל את הממוצע של ספירת הקריאה המנורמלת, ערך שינוי קיפול יומן רישום, חץ סטנדרטי לשינוי קיפול יומן, סטטיסטיקת ריתוך, ערך P מקורי וערך P המתוקן. זהה DEGs.התוצאה res DESeq2 מראה כי בהשוואה עם הרקמות הרגילות, אלפיים תשע מאות ושלושים ושמונה גנים מווסתים, ואלף שש מאות ושש עשרה גנים מווסתים למטה ברקמות Cholangiocarcinoma. פלט טבלת התוצאות לקובץ. צור את חלקת הר הגעש.לחץ על ייצוא כדי להציל את חלקת הר הגעש. חמש. דיאגרמת ון. לחץ על הפעל כדי להתקין את דיאגרמת ה- Venn של חבילת R.לחץ על הפעל כדי לטעון את דיאגרמת ה- Venn של חבילת R. הפוך דיאגרמת venn של גנים מוסדר דיפרנציאלי מבוטא. לחץ על ייצוא כדי לשמור את דיאגרמת הטנדר, הפוך דיאגרמת חיתוך קבוצות (Venn) של גנים המוסדרים כלפי מטה.לחץ על ייצוא כדי לשמור את דיאגרמת ה- Venn. שש. תוצאות מייצגות. איור 1 מראה את חלקות הר הגעש של כל הגנים שנרכשו על ידי לימה, edgeR ו- DESeq2.ערך p יומן שלילי מותוות כנגד שינוי קיפול יומן הרישום. נקודות אדומות מייצגות את הגנים המוסדרים באופן דיפרנציאלי, והנקודות הירוקות מייצגות את הגנים המווסתים כלפי מטה. לימה מזהה את אלף 800 גנים מווסתים כלפי מטה, ואת אלף ארבע מאות וארבעים ושלושה גנים מוסדרים דיפרנציאליים ברקמות Cholangiocarcinoma.EdgeR מזהה את אלף 578 הגנים המווסתים בדיפרנציה, ושלושת אלפים מאה ועשרים ואחת גנים מווסתים למעלה. DESeq2 מזהה אלף 6606 גנים המווסתים בדיפרנציה, ואלפיים 938 גנים מווסתים דיפרנציאליים. איור שני, דיאגרמות Venn מציגות חפיפה בין התוצאות המפרידות בין קצוות לימה EDGER ו- DESeq2.השווה את התוצאות של שלוש השיטות הללו, אלף ארבע מאות ושלושים ואחת גנים מווסתים למעלה מבוטאים באופן דיפרנציאלי, ואלף 531 גנים מוסדרים בדיפרנציה הם חופפים. מסקנה. בפרוטוקול זה, סיפקנו כאן פרוטוקול מפורט של סוגים שונים של ניתוח מידה עבור רצף גבוה של נתוני ספירה באמצעות חבילות R, לימה, edgeR ו- DESeq2. שלוש שיטות יש דומה צוותים בין תהליך הניתוח שלהם.ואז שלהם משלוש התרופות האלה חופפות חלקית. לכל שלוש התרופות יש יתרונות משלהן. והבחירה תלויה רק בזמן הנתונים שלך.אם יש את הנתונים הנוכחיים שלי, לימה צריכה להינתן עם עדיפות, אך נתוני ריצוף הדור, ב- edgeR וב- DESeq2 מועדפים.

three-differential-expression-analysis-methods-for-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

פרוטוקול זה מציג הליך מלא ומפורט להחלת RNA-seq, טכנולוגיית דור הבא DNA עצמת רצף, לtranscriptomes פרופיל בתאים אנושיים ריאות כלי דם אנדותל עם או בלי טיפול תרומבין. פרוטוקול זה הוא להכליל לתאים או רקמות שונים שנפגעו על ידי חומרים כימיים שונים או במחלות.

ניתוח RNA-seq של Transcriptomes בטרומבין טופל ותאי שליטה אנושי ריאת כלי דם האנדותל

ניתוחי RNA-רצף וביואינפורמטיקה שמשו לזהות גורמי שעתוק הביעו באופן משמעותי ואופן דיפרנציאלי בתת אוכלוסיות לין-CD34 + ולין-CD34- של EMLcells עכבר. גורמי שעתוק אלו עשויים לשחק תפקיד חשוב בקביעה לעבור בין תאי לין-CD34- לין-CD34 + ומובחן באופן חלקי עצמי חידוש.

זיהוי של גורמי מפתח עם הרגולציה עצמית התחדשות והתמיינות בתאי EML המטופואטיות מבשר על ידי ניתוח RNA-רצף

אנו מתארים שיטה מבוססת ריצוף RNA ממוקדת הכוללת הכנת ספריות cDNA באינדקס, הכלאה ולכידה עם בדיקות מותאמות אישית וניתוח נתונים כדי לחקור תעתיקים נבחרים לביטוי גנים, מוטציות ואיחוי גנים. RNAseq ממוקד מאפשר הערכה חסכונית ומהירה של תמלילים נבחרים ברצף שולחני.

ממוקד RNA רצף Assay לאפיון ביטוי גנים ושינויים הגנום

פרוטוקול זה מציג גישה לניתוח transcriptome כל מעוברים דג זברה, הזחלים, או תאים ממוינים. אנו כוללים בידוד של RNA, מסלול ניתוח של נתוני RNASeq, המבוססות על לרביעיית-PCR אימות של שינויים בביטוי הגנים.

הכנת הדוגמא וניתוח של נתונים ביטוי גנים מבוססת RNASeq דג זברה

פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה במהירות.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

מוצג כאן הוא הליך צעד צעד עבור הבידול במבחנה של keratinocytes האדם העיקרי על ידי עיכוב מגע ואחריו אפיון ברמה המולקולרית על ידי ניתוח RNA-seq.

אפיון של בידול במבחנה של Keratinocytes האדם העיקרי על ידי ניתוח RNA-Seq

שיטה זו מתארת את השלבים כדי לשפר את האיכות והכמות של נתוני הרצף שניתן להשיג באמצעות דגימות RNA מוטבעות (FFPE) קבועות של שעווה מוטבעת של formalin. אנו מתארים את המתודולוגיה להעריך יותר במדויק את האיכות של הדגימות FFPE-RNA, להכין ספריות ברצף, ולנתח את הנתונים מ FFPE-RNA דגימות.

אופטימיזציה לרצף וניתוח של הירידה FFPE-בדיקות RNA

DiCoExpress הוא כלי מבוסס סקריפט המיושם ב- R לביצוע ניתוח RNA-Seq מבקרת איכות לביטוי משותף. DiCoExpress מטפלת בעיצוב מלא ולא מאוזן עד 2 גורמים ביולוגיים. מדריך וידאו זה מנחה את המשתמש דרך התכונות השונות של DiCoExpress.

ניתוח ניסויי RNA-Seq מולטי-פקטוריאליים עם DiCoExpress

שחבור חלופי (AS) ופוליאדנילציה חלופית (APA) מרחיבים את מגוון האיזופורמים של שעתוק ותוצרים. כאן אנו מתארים פרוטוקולים ביואינפורמטיים לניתוח מבחני RNA-seq בתפזורת ו-3' של ריצוף קצה כדי לזהות ולהמחיש AS ו-APA המשתנים בין תנאי ניסוי.

זיהוי שחבור חלופי ופוליאדנילציה בנתוני RNA-seq

העבודה הנוכחית מתארת פרוטוקול להפעלת אלגוריתם Pathway2Targets, סקריפט R המנבא ומתעדף מטרות טיפוליות על סמך פרופיל מסלולי איתות תוך-תאיים שנוצרו על ידי השוואת דגימות מקרה לעומת ביקורת מניסוי ריצוף RNA בתפזורת.

שימוש ברשימות גנים המתבטאות באופן דיפרנציאלי אנושי לביצוע ניתוח העשרה במורד הזרם ותעדוף יעד

פרוטוקול זה מאפשר בקרת איכות ראשונית לניסויי RNA-seq עבור ביולוגים במעבדה רטובה עם ניסיון מוגבל בביואינפורמטיקה.

Rup (צינור הערכת שימושיות RNA-seq) - בקרת איכות לניסויי RNA-seq בתפזורת באיקריוטים

למדו ניתוח ביטויים דיפרנציאליים ב-RNA-seq באמצעות שלוש שיטות מובילות: limma, EdgeR ו-DESeq2. הפרוטוקול מדגים יישום בנתוני סרטן כולדוקי עם RStudio לזיהוי גנים מבוטאים באופן שונה.

שלוש שיטות לניתוח ביטויים דיפרנציאליים לרצף RNA: לימה, EdgeR, DESeq2

גלה סרטונים נוספים