ספיגת של שלל פלואורסצנטי שכותרתו שלשלות חוץ תאיות קטנות במבחנה ובחוט השדרה

הדמיית ספיגה של שלל חוץ תאי קטן, הידוע גם בשם sEVs, על ידי תאים שונים בחוט השדרה, יכול לאשר משלוח מוצלח של sEVs. זה מאפשר מחקרים מכניים וטיפוליים של SEV מנוהל תוך-אטקלי ממקורות שונים במודלים רודן. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לדמיין ספיגת SEVs על ידי תאים בחוט שדרה מתון, והוא יכול לעזור להעריך את התפקיד של SEVs ומולקולות המטען שלה בהפרעות בעמוד השדרה, כאב ודלקת.

הליך זה יודגם על ידי, יחד עם שואן לואו ו nd ז'וצנג לין, שני סטודנטים לתארים מתקדמים במעבדה של ד"ר Seena אג'יט. התחל על ידי הצבת 18 מילימטר כיסוי מחליק בצלחת 12 טוב, ולאחר מכן צלחת נוירו-2a תאים בכל באר עם סך של 1 מיליליטר של DMEM מלא המכיל 10%FBS ו 1%סטרפטופון עט. כאשר שטף ספירת התאים הגיע ל- 80 עד 90%שנה את המדיום המדולדל של בינוני ל- DMEM exosome בכל באר הוסף אחד, 5 או 10 מיקרוגרם של SEVs המסומנים בתווית.

במשך שעה, ארבע ו-24 שעות. עבור מינון וזמן תלוי ספיגה לשאר בארות בנפח שווה של בקרת צבע. לאסוף את המוחות של גורים לאחר הלידה בצלחת 60 מילימטר, פטרי המכילה קר קרח הנקס פתרון מלח מאוזן בתוספת 10 hepes מילימולר, לנתח את שתי האונות קליפת המוח ולהסיר את קרום המוח.

ואז לטחון את הרקמות עם להב מעוקר. מעבירים את הרקמות לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר המכיל פפאן או deoxyribonucleus חיץ דיסוציאציה אחד ודגרה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, מערבל את הצינור כל 5 דקות, לשאוף supernatant ולהוסיף 5 מיליליטר של DMEM מלא לצינור. כדי לנטרל את פעילות האנזים, נסו לדרג בזהירות לנתק את הרקמות עם פיפטה סרולוגית מזכוכית של 5 מיליליטר, ופיפטת מרעה מלוטשת להבה.

להעביר את ההשעיה התא דרך מסננת תא 40 micrometer, ולאחר מכן צנטריפוגה התאים ב 250 פעמים G במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, לשאוף את המדיום ולראות את התאים ב 10 מיליליטר של DMEM מלא בבקבוק 75 סנטימטר רבוע. לאחר 4 שעות של ציפוי, להחליף את supernate ובינוני עם 15 מיליליטר של בינוני DMEM טרי. לאחר 14 ימים במבחנה כדי לנתק את המיקרוגליה ואוליגודנדרוציטים, להעביר את הבקבוקון לשייקר מסלולית ב 320 סל"ד במשך 6 שעות.

השתמש 5 מיליליטר של אנזים דיסוציאציה התא במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לשוטט, אסטרוציטים הנותרים, כדי לנטרל את הפעולה אנזימטית, להוסיף 5 מיליליטר של DMEM מלא ולאחר מכן גלולה את התאים ב 250 פעמים G במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. resuspend התאים ב DMEM מלא ולראות את התאים על 12 מילימטר מספר כיסוי 1.5 פתקים בלוח 24 באר.

באמצעות PBS לשטוף את התאים 3 פעמים ולאחר מכן לתקן אותם עם 4% כוח פורמלדהיד או PFA ב- PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים הקבועים 3 פעמים במשך 5 דקות עם PBS ולחלחל להם באמצעות 0.1% Triton X 100 ב- PBS במשך 10 עד 15 דקות. ואז לחזור על הכביסה עם PBS.

השתמש 5% סרום עז רגיל או NGS ב- PBS במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי לחסום את התאים, לדגור על תאי neuro-2a עם מפות נוגדנים דו כיווניים ואת אסטרוציטים העיקריים עם נוגדני GFAP ביחס 1 עד 500 טרי 5%NGS או PBS לילה ב 4 מעלות צלזיוס עם רועד עדין. לאחר שטיפת התאים 3 פעמים ב- PBS, הוסיפו את הנוגדנים המשניים הצומדים פלואורופור ב-5% NGS. דגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור על רוקר.

חזור על הכביסה עם PBS ודגר את התא עם 1 מיקרוגרם למיליליטר של DAPI במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שוב, לשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS. באמצעות מדיום נגד דהייה, לעלות את כיסוי מחליק על שקופיות מספר 1, לתת להם להתייבש לילה בחושך ולאחסן את שקופיות זכוכית מוכן ב 4 מעלות צלזיוס עד הדמיה על מיקרוסקופ קונפוקלי.

לנתח את חוט השדרה ולתקן אותו ב 4%PFA ב PBS ב 4 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לפני להגן על הרקמות ב 30% סוכרוז ב PBS ב 4 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות או עד הרקמות לשקוע ולאחר מכן לאחסן את הרקמות ב 4 מעלות צלזיוס עד immunohistochemry, imbed חוט השדרה L4 L5 במתחם OCT, ולאחר מכן להקפיא אותו על קרח יבש עד שהוא מוצק לחלוטין. השתמש cryostat כדי לחלק את הרקמות ב 30 מיקרומטר ואת לאסוף את החלקים בצלחת 24 באר המכיל PBS.

לשטוף את הסעיפים 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 0.3% טריטון ב- PBS, לחסום את אתרי הכריכה שאינם ספציפיים באמצעות 5% MGS ב 0.3% טריטון PBS במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר. לדגור את החלקים לילה ב 4 מעלות צלזיוס על שייקר. לשטוף את הסעיפים 3 פעמים במשך 5 דקות עם 0.3% טריטון ב PBS.

לאחר מכן להוסיף את הריכוז המתאים של הנוגדנים המשניים. על פי כתב היד של הטקסט, דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים, לשטוף את החלקים באמצעות PBS בלבד ולדגור אותם 1 מיקרוגרם למיליליטר של DAPI במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן חזרו על שטיפת ה-PBS תחת מיקרוסקופ בהיר, הרכיבו את המקטעים על שקופית דבק ברורה עם מברשת צבע עדינה.

הרטיבו את פתק הכיסוי עם המדיום הרכבה ורפאו בן לילה בחושך בטמפרטורת החדר, רכשו תמונות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי עם הלייזרים המתאימים, הגודל הממוצע הממוצע של RA 2 6 4 0.7 sEVs נגזר היה 140 ננומטר וגודל החלקיקים השיא היה 121.8 ננומטר. עם החלקיקים הניתנים לגילוי ביותר נופלים בטווח הגודל של אקסוזומים או sEVS. ב 50 עד 150 ננומטר, סופג מערבי של SEVs, תא ליסאט ומדיה exodeted, הוכיח כי דגימות חלבון נגזר sEV הכיל את חלבוני סמן SEV Alix CD81 ו GAPDH.

ליסאט התא הועשר ברטיקולום אנדופלסמי, חלבון תושב Calnexin ולכן Calnexin שימש סמן שלילי לזיהום התא כפי שהוא נעדר ב- sEVs. נצפתה כי ספיגת ה- SEVs התרחשה בשעה אחת וב- 1, 5 ו - 10 מיקרוגרם SEVs, פלואורסצנטיות לאחר הדגירה יכולה להיות מזוהה ב 4 שעות, עבור 4, 5, ו 10 מיקרוגרם של SEVs. ספיגת ה- SEVs המסומנים PKH 26 על ידי אסטרוציטים ראשוניים נבדקה ונבדקה פלואורסצנטיות מרבית מספיגת SEVS באסטרוציטים קליפת המוח העיקריים התרחשה ב 24 שעות PKH26-labeled sEVs נלקחו פלואורסצנטיות מקסימלית נצפתה ב 6 שעות, לאחר הזרקה אסטרוציטים נוירונים ותאים מיקרוגליאליים.

הכללת בקרות, SEVs ללא תווית, ובקרת צבע זה ליצור קוד לרוח חיובית אותות לאחרונה בשל עכשיו ספציפי תיוג ריקוד Opry של חופי טלאי צבע מאוגדים. ספיגת רכבים יכולים להיות מאושרים על ידי חקירת העברת מטען ביומולקולרית למתכון ותאים ורקמות וקביעת השינויים ברמות הביטוי של ביומולקולות או גנים ממוקדים. מחקרי התנהגות יכולים להתבצע גם, כדי לחקור את ההשפעה התפקודית של משלוח sEV.