Name: ספיגת של שלל פלואורסצנטי שכותרתו שלשלות חוץ תאיות קטנות במבחנה ובחוט השדרה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: למדו פרוטוקול לסימון ומעקב אחר ספיגת vesicles תאיים קטנים (sEVs) בחוט השדרה באמצעות צבעי PKH. שיטה זו מאפשרת הערכת יעילות טיפולית בדגמים של כאב ודלקת עצבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענקים מ NIH NINDS R01NS102836 ואת מחלקת הבריאות של חבר העמים הבריטי אוניברסלי שיפור מחקר (CURE) הוענק Seena ק אג'יט. אנו מודים לד"ר בראדלי נאש על הקריאה הביקורתית של כתב היד.

הערה: כל ההליכים בוצעו בהתאם למדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש במכללה לרפואה של אוניברסיטת דרקסל. עכברי CD-1 בהריון מתוזמן שימשו לתרבות אסטרוציטית, וכל הסכרים התקבלו 15 ימים לאחר הספגה. עכברי C57BL/6 בני 10-12 שבועות שימשו לניסויי ספיגת ויוו.
1. בידוד של SEVs מתאי מקרופאגים RAW 264.7
<ol><li>תרבות RAW 264.7 תאים ב 75 ס"מ2 צלוחיות במדיום DMEM exosome-מרוקן המכיל 10% סרום בקר עוברי exosome מרוקן (FBS) ו 1% פניצילין-סטרפטוצין (עט-סטרפטוקוקוס) עבור 24-48 שעות.</li>
	<li>לאסוף 300 מ"ל של בינוני מותנה צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 10 דקות ב 4 °C (70 °F).</li>
	<li>לאסוף את supernatant וצנטריפוגה ב 2,000 × גרם במשך 20 דקות ב 4 °C (70 °F).</li>
	<li>מעבירים את הסופר-נט לצינורות צנטריפוגות, צנטריפוגה למשך 35 דקות ב-12,000 × גרם ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאסוף את supernatant ולסנן דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.</li>
	<li>העבר צינורות אולטרה צנטריפוגה וצנטריפוגה במשך 80 דקות ב 110,000 × גרם ב 4 °C (50 °F).</li>
	<li>אחסן את החומר-על (בינוני מרוקן אקסוזום), תגדיל מחדש את הכדור ב-2 מ"ל של תמיסת מלח עם פוספט אחד (PBS) וצנטריפוגה למשך שעה אחת ב-110,000 גרם × ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>Resuspend הכדור ב 100 μL של PBS לאפיון נוסף באמצעות ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (NTA) ומיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM) או ב- radioimmunoprecipitation assay (RIPA) חוצץ עבור סופג מערבי.</li>
</ol>2. אפיון של SEVs
<ol><li>ניתוח מעקב חלקיקים (NTA) הערה: התפלגות הגודל ומספר החלקיקים/ריכוז ה- sEV המטוהרים מתאי RAW 264.7 נמדדו על ידי NTA.<ol>
<li>לדלל את ה- sEVs ב- PBS מסונן כדי להשיג 20-60 של שלל לכל שדה תצוגה למעקב מיטבי.</li>
		<li>הציגו את הדגימה המדוללת לתא זרימה באמצעות משאבת מזרק עם קצב זרימה קבוע.</li>
		<li>צ'3-5 סרטונים של 30 שניות כל אחד. הגדר את מהירות הצמצם ואת הרווח, ומקד באופן ידני את הגדרות המצלמה עבור המספר המרבי של שלל להיות גלוי ומסוגל להיות במעקב וניתוח.</li>
		<li>קדם את הדגימות בין כל הקלטה כדי לבצע מדידות שכפול. מטב את ההגדרות לאחר הרכישה של NTA ושמור על ההגדרות קבועות בין הדוגמאות.</li>
		<li>נתח כל סרטון באמצעות תוכנת NTA כדי להשיג את הגודל והריכוז הממוצעים של השלל.</li>
		<li>בצע את כל מדידות NTA עם הגדרות מערכת זהות לעקביות.</li>
	</ol></li>
	<li>כתם מערבי<ol>
<li>לכמת את כמויות החלבון הכוללות ב- sEV, בליזאטים של תאים ומדיה מרוקנת אקסוזום באמצעות ערכת חלבון לפי הוראות היצרן.</li>
		<li>להכנת ליסאט תא, תרבית RAW 264.7 תאים ב 75 ס"מ2 צלוחיות עד 80-90% confluent. לנתק את התאים עם 0.25% טריפסין במשך 10-15 דקות, לנטרל את טריפסין עם מדיה תרבית, ולגלות את התאים על ידי ספינינג ב 400 × גרם במשך 5 דקות. resuspend התאים במדיום צמיחה טרי.</li>
		<li>לספור את התאים באמצעות hemocytometer ולהעביר 1 × 106 תאים לצינור אחר. לשטוף את התאים עם PBS פעמיים באמצעות אותם תנאי צנטריפוגה כמו לעיל ולהוסיף 50 μL של מאגר תמוגה (חוצץ RIPA עם קוקטייל מעכב פרוטאז הוסיף) לכדור התא מן הסיבוב הסופי.</li>
		<li>מערבולת את התאים ולשמור אותם על קרח במשך 20 דקות. נושא את התערובת לצנטריפוגה ב 10,000 × גרם במשך 30 דקות ב 4 °C (4 °F), לאסוף את supernatant (כלומר, ליסאט) בצינורות microcentrifuge טרי, ולשמור על −80 °C (70 °F) עד השימוש.</li>
		<li>מרכז 2 מ"ל של מדיה מרוקנת אקסוזום ל 100 μL באמצעות 3 מסננים צנטריפוגליים חתוך kDa לפני כימות כמות החלבון. מערבבים את ה-sEVs עם חיץ תמוגה ביחס של 1:1, מערבולת ל-30 מעלות ודגרה על קרח למשך 15 דקות כדי לכמת את כמות החלבון.</li>
		<li>ערבבו כמויות שוות של חלבון (2 מיקרוגרם) של ה-sEVs, ליסאט תאי RAW 264.7 ומדיה מרוקנת אקסוזום עם הפחתת מאגר הדגימה.</li>
		<li>דנטורה את הדגימות ב 95 °C (5 דקות), לשמור אותם על קרח במשך 5 דקות, ולהסתובב במשך 2 דקות ב 10,000 × גרם. טען את הדגימות על ג'ל חלבון טריס-גליצין 12% והפעל את הג'ל ב 125 V במשך 45 דקות.</li>
		<li>העבר את החלבון על קרום פוליווינילידן דיפלואוריד (PVDF) ב 25 V עבור 2 שעות.</li>
		<li>לאחר ההעברה, לחסום את ממברנות PVDF עם חוצץ חסימה (ראה טבלת החומרים) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר.</li>
		<li>לדגור את כתם עם נוגדנים ראשוניים על שייקר לילה ב 4 °C (50 °F). הערה: נוגדנים עיקריים בשימוש היו אנטי CD81 (1:1,000), אנטי אלפא-1,3/1,6-mannosyltransferase (ALG-2)-אינטראקציה חלבון X (Alix) (1:1,000), אנטי קלנקסין (1:1,000), ו anti-גליצרלדהיד 3-פוספט דהידרונאז (GAPDH) (1:1,000).</li>
		<li>לשטוף את כתמים 3 x 15 דקות עם 1x תמיסת מלח חוצצת טריס, 0.1% Tween 20 (TBST), ודגרה בטמפרטורת החדר עם עיזים נגד עכבר IgG-חזרת peroxidase (HRP)- או נוגדנים משניים נגד ארנב IgG-HRP-HRP(1:10,000) עבור 1 שעה על שייקר.</li>
		<li>לשטוף את כתמים 3 x 15 דקות עם 1x TBST, ולזהות את החלבונים באמצעות מצע HRP.</li>
		<li>נתח את הכתמים על ידי כימותרפיה משופרת באמצעות צלם כתם מערבי.</li>
	</ol></li>
	<li>מיקרוסקופיית אלקטרונים שידור (TEM)<ol>
<li>תקן sEVs על-ידי שימוש חוזר בהם ב- paraformaldehyde של 2% (PFA) במאגר פוספט (PB) של 0.1 M; מערבולת עבור 2 x 15 s.</li>
		<li>מניח טיפה של 10 μL של השעיית sEV על parafilm נקי. צפים את רשת ה-formvar מצופה הפחמן בטיפה כשצדם מצופה פונה אל המתלים. תן לממברנות להיספג במשך 20 דקות בסביבה יבשה.</li>
		<li>מניחים את הרשתות (בצד הממברנה כלפי מטה) על טיפה של PB לשטוף במשך 3 x 2 דקות.</li>
		<li>העבר את הרשתות ל 50 μL של 1% glutaraldehyde במשך 5 דקות.</li>
		<li>לשטוף את הרשתות עם 100 μL של מים מזוקקים במשך 8 x 2 דקות.</li>
		<li>השווה את המדגם על ידי הצבת הרשתות על ירידה של 1% אורניל אצטט במשך 2 דקות.</li>
		<li>הטמיע את המדגם עם 50 μL של 0.2% אורניל אצטט עם 2% פתרון methylcellulose במשך 10 דקות על צלחת קרח מכוסה parafilm.</li>
		<li>השתמש לולאות נירוסטה להחזיק את הרשתות ולהסיר נוזל עודף עם נייר מסנן.</li>
		<li>ייבש את הרשת במשך 10 דקות בעוד עדיין בלולאה.</li>
		<li>צפה תחת מיקרוסקופ אלקטרונים שידור ב 80 kV.</li>
	</ol></li>
</ol>3. תיוג של SEVs
<ol><li>לדלל 20 מיקרוגרם של sEVs ב 1 מ"ל של מאגר דילול או אותו נפח של PBS ב 1 מ"ל של מאגר דילול לשליטה בצבע.</li>
	<li>לדלל 3 μL של PKH67 או PKH26 צבע ב 1 מ"ל של חיץ דילול ומערבבים על ידי pipetting.</li>
	<li>הוסיפו צבע PKH מדולל לארופי ה-SEV המדוללים וערבבו על ידי צנרת. דגירה במשך 5 דקות בחושך בטמפרטורת החדר. לשליטה בצבע, ערבבו את הצבע מדולל עם PBS מדולל משלב 3.1.</li>
	<li>הוסיפו 2 מ"ל של 1% סרום בקר (BSA) ב-PBS לצינור עם הצבע ותערובת ה-sEV ולצינור בקרת הצבע כדי לספוג עודפי צבע.</li>
	<li>צנטריפוגה עבור 1 שעה ב 110,000 × גרם ב 4 °C (50 °F). השלך את supernatant, resuspend הכדור ב 2 מ"ל של PBS, וצנטריפוגה עבור 1 שעה ב 110,000 × גרם ב 4 °C (60 °F). חזור על הכביסה עם PBS וערך מחדש את ה- sEV המסומן או את פקד הצבע בנפח שווה של PBS.</li>
	<li>לכמת את כמות החלבון הכוללת בשיטת ברדפורד.</li>
</ol>4. ספיגת SEVs על ידי תאי Neuro-2a
<ol><li>מניחים כיסויים של 18 מ"מ בצלחת 12-well ולוח 10 × 104 תאי Neuro-2a בכל באר בסך הכל 1 מ"ל של מדיום DMEM מלא המכיל 10% FBS ו 1% סטרפטוקוקו אחר עט.</li>
	<li>שנה את המדיום הבינוני למדיום המרוקן מ- DMEM כאשר ההשפעה על התא היא 80-90%. הוסף 1, 5 או 10 מיקרוגרם של SEVs המסומנים בכל באר עבור 1, 4 ו- 24 שעות עבור ספיגה תלוית מינון וזמן, או הוסף נפח שווה של בקרת צבע.</li>
</ol>5. תרבויות אסטרוציטיות עיקריות
<ol><li>מרדים 4 גורים לאחר הלידה 4 ימים לאחר הלידה על ידי גרימת היפותרמיה.</li>
	<li>לאסוף את המוחות בצלחת פטרי 60 מ"מ המכילה קר כקרח האנק פתרון מלח מאוזן (HBSS) בתוספת 10 mM 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES).</li>
	<li>לנתח את שתי האונות קליפת המוח ולהסיר את קרום המוח. טחון את הרקמות עם להב מעוקר.</li>
	<li>להעביר את הרקמות לצינור חרוט 15 מ"ל המכיל פפאין / deoxyribonuclease אני חוצץ דיסוציאציה ודגרה במשך 20 דקות ב 37 °C (7 °F). מערבבים כל 5 דקות. הערה: עבור 4 קליפות עכבר, 9 מ"ל של 7.5 U /mL פפאין ב HBSS מופעל ב 37 °C לפחות 30 דקות, מסונן דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר, מעורבב עם deoxyribonuclease I לריכוז סופי של 0.1 מ"ג / מ"ל.</li>
	<li>שאפו את supernatant ולהוסיף 5 מ"ל של DMEM מלא כדי לנטרל את פעילות האנזים. בזהירות טריטורציה כדי לנתק את הרקמות עם פיפטה סרולוגית זכוכית 5 מ"ל ופפטת פסטר מלוטשת להבה.</li>
	<li>להעביר את ההשעיה התא דרך מסננת תא 40 מיקרומטר וצנטריפוגה התאים ב 250 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (5 °F). שאפו את המדיום וזרעו את התאים ב-10 מ"ל של DMEM שלםבבקבוקון 2 של 75 ס"מ. החלף את המדיום העל-טבעי ב-15 מ"ל של DMEM בינוני טרי 4 שעות לאחר ה ציפוי.</li>
	<li>לאחר 14 ימים במבחנה, להעביר את הבקבוקון לשייקר מסלולית לנתק את המיקרוגליה ואוליגודנדרוציטים ב 320 סל"ד עבור 6 שעות.</li>
	<li>Trypsinize את אסטרוציטים הנותרים באמצעות 5 מ"ל של אנזים דיסוציאציה התא (שולחן החומרים) במשך 10 דקות ב 37 °C (7 °F). הוסף 5 מ"ל של DMEM מלא כדי לאפעיל את הפעולה אנזימטית ולכדור את התאים ב 250 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (70 °F).</li>
	<li>תקיף מחדש את התאים ב- DMEM מלא. זרע 5 × 104 תאים על 12 מ"מ #1.5 מכסה בצלחת 24-well.</li>
</ol>6. ספיגת SEVs על ידי אסטרוציטים
<ol><li>כאשר אסטרוציטים מגיעים ל-80-90% שיתוף, שנה את המדיום למדיום מרוקן DMEM.</li>
	<li>הוסף 1 מיקרוגרם של sEV ללא תווית, עם תווית, נפח שווה של בקרת צבע או PBS לתאים. השתמש בתאים להכתמה 1 שעות ו 24 שעות לאחר טיפול sEV.</li>
</ol>7. אימונופלואורסצנטיות
<ol><li>לשטוף את התאים עם PBS 3x ולתקן אותם עם 4% PFA ב PB במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף את התאים הקבועים 3 x 5 דקות עם PB ולחלחל להם באמצעות 0.1% Triton X-100 ב PB במשך 10-15 דקות לשטוף עם PB 3 x 5 דקות.</li>
	<li>לחסום את התאים עם 5% סרום עז נורמלי (NGS) ב PB במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לדגור על התאים עם נוגדנים ראשוניים: חלבון הקשור microtubule 2 (MAP2A, 1:500) עבור תאי Neuro-2a או חלבון חומצי פרברי גליה (GFAP, 1:500) עבור אסטרוציטים ראשוניים טרי 5% NGS / PB לילה ב 4 °C עם רועד עדין.</li>
	<li>לשטוף 3 x 10 דקות עם PB ולהוסיף נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור (עז אנטי עכבר IgG1, אלכסה פלור 594; או עז אנטי עכבר IgG H&L, אלכסה פלור 488) ב 5% NGS ודגרה עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר על רוקר.</li>
	<li>לשטוף 3 x 10 דקות עם PB ודגורה עם 1 מיקרוגרם / מ"ל של כתם גרעיני 4 ',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים שוב 3x עם PB.</li>
	<li>טען את כיסויי השער בשקופיות #1 באמצעות מדיום הרכבה נגד פיד. תן להם להתייבש לילה בחושך, ולאחסן את שקופיות הזכוכית המוכנות ב 4 °C (5 °F) עד הדמיה על מיקרוסקופ קונפוקלי.</li>
</ol>8. ספיגת ויוו של SEVs
<ol><li>בצע הזרקה תוך-תיאטרלית של 5 מיקרוגרם של sEVs ללא תווית או תווית resuspended ב 10 μL של PBS, או נפח שווה (10 μL) של בקרת צבע (כפי שהוכן בסעיף 3) לתוך עכברי C57BL /6.</li>
	<li>לאחר 6 ו 18 שעות לאחר הזרקה של SEVs, עמוק להרדים עכברים על ידי הזרקה תוך-אישית של 100 מ"ג/ק"ג משקל גוף של קטמין ו 10 מ"ג/ק"ג משקל גוף של xylazine.</li>
	<li>בצע זלוף תוך-קרדיאלי של עכברים עם 0.9% תמיסת מלח כדי לשטוף את הדם, ואחריו קר קרח טרי 4% PFA / PB.</li>
	<li>לנתח את חוט השדרה ולתקן ב 4% PFA / PB ב 4 °C (55 °F) עבור 24 שעות. Cryoprotect על הרקמות ב 30% סוכרוז ב PB ב 4 °C (50 °F) במשך 24 שעות או עד הרקמות לשקוע. לאחסן את הרקמות ב 4 °C (55 °F) עד immunohistochemistry.</li>
</ol>9. אימונוהיסטוכימיה
<ol><li>הטמע חוט השדרה L4-L5 במתחם O.C.T. יש להקפיא על קרח יבש עד להתגבשות מלאה.</li>
	<li>חלק את הרקמות ב 30 מיקרומטר (חתך עבור חוט השדרה) באמצעות cryostat, ולאסוף את החלקים בצלחת 24 באר המכיל PB. לשטוף את החלקים 3 x 5 דקות עם 0.3% טריטון PB.</li>
	<li>חסום אתרי כריכה לא ספציפיים עם 5% NGS ב- 0.3% טריטון/PB למשך 2 שעות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לדלל נוגדנים עיקריים: אנטי MAP2A (1:500), GFAP (1:1,000), Iba1 עבור מיקרוגליה (1:2,000) עם 5% NGS ב 0.3% טריטון / PB, ודגורת המקטעים לילה ב 4 °C על שייקר.</li>
	<li>לשטוף את החלקים 3 x 5 דקות עם 0.3% טריטון / PB, ולהוסיף נוגדנים משניים (חמור נגד ארנב IgG אלכסה פלואור 488, 1:500, או עז נגד עכבר IgG אלכסה פלור 488, 1:500) ב 5% NGS / PB עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשטוף 3 x 5 דקות עם PB, ולדגירה את החלקים ב 1 מיקרוגרם / מ"ל של DAPI במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את החלקים 3 x 5 דקות עם PB.</li>
	<li>הר את המקטעים על שקופית דבק נקי (שולחן חומרים) עם מברשת צבע עדינה תחת מיקרוסקופ אור.</li>
	<li>מרטיבים את כיסוי עם בינוני הרכבה. לרפא לילה בחושך בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>תמונה תחת מיקרוסקופ קונפוקלי עם הלייזרים המתאימים.</li>
</ol>

<ol><li>Mulcahy, L. A., Pink, R. C., Carter, D. R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Routes+and+mechanisms+of+extracellular+vesicle+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Routes and mechanisms of extracellular vesicle uptake.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), 24641(2014).</li>
<li>Betzer, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+imaging+strategies+for+in+vivo+tracking+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews.+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Advances in imaging strategies for in vivo tracking of exosomes.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews. Nanomedicine and Nanobiotechnology. 12 (2), 1594(2020).</li>
<li>Dehghani, M., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of extracellular vesicles.</a> Methods in Enzymology. 645, 15-42 (2020).</li>
<li>González, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+labeled+fluorescent+exosomes+for+in+vitro+and+in+vivo+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Covalently labeled fluorescent exosomes for in vitro and in vivo applications.</a> Biomedicines. 9 (1), 81(2021).</li>
<li>Chuo, S. T. -Y., Chien, J. C. -Y., Lai, C. P. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+extracellular+vesicles%3A+current+and+emerging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Imaging extracellular vesicles: current and emerging methods.</a> Journal of Biomedical Science. 25 (1), 91(2018).</li>
<li>vander Vlist, E. J., Nolte-'tHoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li>
<li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li>
<li>Heinrich, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+laser+scanning+microscopy+using+dialkylcarbocyanine+dyes+for+cell+tracing+in+hard+and+soft+biomaterials%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research.+Part+B%2C+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Confocal laser scanning microscopy using dialkylcarbocyanine dyes for cell tracing in hard and soft biomaterials.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part B, Applied Biomaterials. 81 (1), 153-161 (2007).</li>
<li>Haney, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+as+drug+delivery+vehicles+for+Parkinson%27s+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Exosomes as drug delivery vehicles for Parkinson's disease therapy.</a> Journal of Controlled Release. 207, 18-30 (2015).</li>
<li>Grange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+in+a+model+of+acute+kidney+injury+monitored+by+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a model of acute kidney injury monitored by optical imaging.</a> International Journal of Molecular Medicine. 33 (5), 1055-1063 (2014).</li>
<li>Wiklander, O. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+in+vivo+biodistribution+is+determined+by+cell+source%2C+route+of+administration+and+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle in vivo biodistribution is determined by cell source, route of administration and targeting.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 4, 26316(2015).</li>
<li>Lai, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+and+tracking+of+tumour+extracellular+vesicle+delivery+and+RNA+translation+using+multiplexed+reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters.</a> Nature Communications. 6 (1), 7029(2015).</li>
<li>Deddens, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+extracellular+vesicles+contain+miRNAs+and+are+released+as+early+biomarkers+for+cardiac+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Translational+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating extracellular vesicles contain miRNAs and are released as early biomarkers for cardiac injury.</a> Journal of Cardiovascular Translational Research. 9 (4), 291-301 (2016).</li>
<li>Montecalvo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+transfer+of+functional+microRNAs+between+mouse+dendritic+cells+via+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mechanism of transfer of functional microRNAs between mouse dendritic cells via exosomes.</a> Blood. 119 (3), 756-766 (2012).</li>
<li>Escrevente, C., Keller, S., Altevogt, P., Costa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+and+uptake+of+exosomes+by+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Interaction and uptake of exosomes by ovarian cancer cells.</a> BMC Cancer. 11, 108(2011).</li>
<li>Cho, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+exosomes+and+ferritin+protein+nanocages+for+the+delivery+of+membrane+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Comparison of exosomes and ferritin protein nanocages for the delivery of membrane protein therapeutics.</a> Journal of Controlled Release. 279, 326-335 (2018).</li>
<li>Mantel, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Malaria-infected+erythrocyte-derived+microvesicles+mediate+cellular+communication+within+the+parasite+population+and+with+the+host+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Malaria-infected erythrocyte-derived microvesicles mediate cellular communication within the parasite population and with the host immune system.</a> Cell Host & Microbe. 13 (5), 521-534 (2013).</li>
<li>Porro, C., Trotta, T., Panaro, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+in+the+brain%3A+Biomarker%2C+messenger+or+mediator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">Microvesicles in the brain: Biomarker, messenger or mediator.</a> Journal of Neuroimmunology. 288, 70-78 (2015).</li>
<li>De Toro, J., Herschlik, L., Waldner, C., Mongini, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+exosomes+in+normal+and+pathological+conditions%3A+new+insights+for+diagnosis+and+therapeutic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of exosomes in normal and pathological conditions: new insights for diagnosis and therapeutic applications.</a> Frontiers in Immunology. 6, 203(2015).</li>
<li>Matsumoto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+alpha-synuclein-containing+erythrocyte-derived+extracellular+vesicles+across+the+blood-brain+barrier+via+adsorptive+mediated+transcytosis%3A+another+mechanism+for+initiation+and+progression+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Transmission of alpha-synuclein-containing erythrocyte-derived extracellular vesicles across the blood-brain barrier via adsorptive mediated transcytosis: another mechanism for initiation and progression of Parkinson's disease.</a> Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 71(2017).</li>
<li>Matsumoto, J., Stewart, T., Banks, W. A., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transport+mechanism+of+extracellular+vesicles+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">The transport mechanism of extracellular vesicles at the blood-brain barrier.</a> Current Pharmaceutical Design. 23 (40), 6206-6214 (2017).</li>
<li>Shaimardanova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+in+the+diagnosis+and+treatment+of+central+nervous+system+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regeneration+Research%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles in the diagnosis and treatment of central nervous system diseases.</a> Neural Regeneration Research. 15 (4), 586-596 (2020).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28MISEV2018%29%3A+a+position+statement+of+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles+and+update+of+the+MISEV2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Hoen, E. N. M. N. -t, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%3A+Nanotechnology%2C+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li>
<li>Gangadaran, P., Hong, C. M., Ahn, B. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+on+in+vivo+imaging+of+extracellular+vesicles+as+drug+delivery+vehicles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">An update on in vivo imaging of extracellular vesicles as drug delivery vehicles.</a> Frontiers in Pharmacology. 9, 169(2018).</li>
<li>Teare, G. F., Horan, P. K., Slezak, S. E., Smith, C., Hay, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+tracking+of+lymphocytes+in+vivo%3A+the+migration+of+PKH-labeled+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Long-term tracking of lymphocytes in vivo: the migration of PKH-labeled lymphocytes.</a> Cellular Immunology. 134 (1), 157-170 (1991).</li>
<li>Kuffler, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+survival+and+sprouting+in+culture+by+motoneurons+isolated+from+the+spinal+cord+of+adult+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Long-term survival and sprouting in culture by motoneurons isolated from the spinal cord of adult frogs.</a> Journal of Comparative Neurology. 302 (4), 729-738 (1990).</li>
<li>Takov, K., Yellon, D. M., Davidson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confounding+factors+in+vesicle+uptake+studies+using+fluorescent+lipophilic+membrane+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Confounding factors in vesicle uptake studies using fluorescent lipophilic membrane dyes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1388731(2017).</li>
<li>Pužar Dominkuš, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKH26+labeling+of+extracellular+vesicles%3A+Characterization+and+cellular+internalization+of+contaminating+PKH26+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta.+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles.</a> Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).</li>
<li>Dehghani, M., Gulvin, S. M., Flax, J., Gaborski, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+PKH+labelling+on+extracellular+vesicle+size+by+nanoparticle+tracking+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of PKH labelling on extracellular vesicle size by nanoparticle tracking analysis.</a> Scientific Reports. 10 (1), 9533(2020).</li>
<li>Shimomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+lipophilic+fluorescent+dyes+for+labeling+extracellular+vesicles%3A+characterization+and+monitoring+of+cellular+uptake%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">New lipophilic fluorescent dyes for labeling extracellular vesicles: characterization and monitoring of cellular uptake.</a> Bioconjugate Chemistry. 32 (4), 680-684 (2021).</li>
<li>Yuan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+exosomes+as+natural+nanocarriers+for+protein+delivery+to+inflamed+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain.</a> Biomaterials. 142, 1-12 (2017).</li>
<li>Polanco, J. C., Li, C., Durisic, N., Sullivan, R., Götz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+taken+up+by+neurons+hijack+the+endosomal+pathway+to+spread+to+interconnected+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica+Communications%22%5BJournal%5D)">Exosomes taken up by neurons hijack the endosomal pathway to spread to interconnected neurons.</a> Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 10(2018).</li>
<li>Jurgielewicz, B. J., Yao, Y., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+and+specificity+of+HEK293T+extracellular+vesicle+uptake+using+imaging+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Research+Letters%22%5BJournal%5D)">Kinetics and specificity of HEK293T extracellular vesicle uptake using imaging flow cytometry.</a> Nanoscale Research Letters. 15 (1), 170(2020).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

בפרוטוקול זה, הראינו את התיוג של SEVs עם צבעי PKH ואת ההדמיה של ספיגתם בחוט השדרה. PKH צבעי פלואורסצנטית ליפופילית נמצאים בשימוש נרחב לתיוג תאים על ידי ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית3,5,6,12,24,25. בשל מחצית החיים הארוכה יחסית שלהם וציטוקסיות נמוכה, צבעי PKH יכולים לשמש למגוון רחב של מחקרי מעקב אחר תאים במבחנה...

שלל חוץ-תאי קטן (sEVs) הם שלטי ננו-ממברנה שמקורם בממברנה עם טווח גודל של 50-150 ננומטר. מקורם בגופים רב-דרכים (MVBs) ומשוחררים מתאים עם היתוך ה-MVBs עם קרום הפלזמה. sEVs מכילים miRNAs, mRNAs, חלבונים, שומנים ביואקטיביים, ומולקולות אלה מועברות בין תאים בצורה של תקשורת בין תא לתא. sEVs יכול להיות מופנמ על ידי תאי הנמען על ידי מגוון של מסלולים אנדוציטיים, ו לכידה זו של sEVs על ידי תאי הנמען מתווכת על ידי זיהוי של מולקולות פני השטח הן על כלי עבודה והן על תאי היעד1.
sEVs צברו עניין בשל יכולתם לעורר שינויים מולקולריים ופנוטיפיים בתאים המקובלים, התועלת שלהם כסוכן טיפולי, ואת הפוטנציאל שלהם כמו נשאים עבור מולקולות מטען או סוכנים פרמקולוגיים. בשל גודלם הקטן, ההדמיה והמעקב אחר SEVs יכולים להיות מאתגרים, במיוחד עבור מחקרי vivo והגדרות קליניות. לכן, פותחו שיטות רבות לתיוג ותמונה sEVs כדי לסייע biodistribution ומעקב במבחנה ו in vivo2.
הטכניקה הנפוצה ביותר לחקר ייחוס ביולוגי של sEV ואינטראקציות בין תאי יעד כוללת תיוג אותם עם מולקולות צבע פלואורסצנטי3,4,5,6,7. EVs סומנו בתחילה עם צבעי קרום התא ששימשו בדרך כלל לתאי תמונה. צבעים פלואורסצנטיים אלה מכתימים בדרך כלל את דו-שכבתי השומנים או חלבונים מעניינים על SEVs. מספר צבעים ליפופיליים מציגים אות פלואורסצנטי חזק כאשר הם משולבים בציטוסול, כולל DiR (1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindotricarbocyanine יוד), DiL (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethyl indocarbocyanine perchlorate), ו- DiD (1, 1′-dioctadecyl-3, 3, 3′, 3′-tetramethyl indocarbocyanine 4-כלורובצנסולפונט מלח)8,9,10,11.
צבעים ליפופיליים אחרים, כגון PKH67 ו- PKH26, יש קבוצת ראש קוטב פלואורסצנטית מאוד וזנב פחמימנים אליפטי ארוך כי בקלות intercalate לתוך כל מבנה שומנים ומוביל שימור צבע לטווח ארוך פלואורסצנטיותיציבה 12. צבעי PKH יכולים גם לתייג EVs, המאפשר את המחקר של תכונות EV ב vivo13. צבעים רבים אחרים שימשו לצפייה אקסוזומים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית וציטומטריית זרימה, כולל צבעי תיוג שומנים14 וצבעים חדירים לתא כגון carboxyfluorescein diacetate succinimidyl אסתר (CFDA-SE)15,16 ו קלצ'ין אצטטוקסימתיל (AM) אסתר17.
מחקרים של sEV בתיווך צולב בין תאים שונים במערכת ן סיפקו תובנות חשובות על הפתוגנזה של מחלות נוירו-דליקות ונוירודגנרטיביות18. לדוגמה, SEVs מתאי עצב יכולים להפיץ פפטידים בטא עמילואיד וחלבוני טאו זרחן ולסייע בפתוגנזה של מחלתאלצהיימר 19. בנוסף, כלי עבודה אלקטרוניים הנגזרים אריתרוציטים מכילים כמויות גדולות של אלפא-סינוקלין ויכולים לחצות את מחסום הדם - מוח ולתרום לפתולוגיה של פרקינסון20. היכולת של SEVs לחצות מחסומים פיזיולוגיים21 ולהעביר biomolecules שלהם לתאי היעד עושה להם כלים נוחים כדי לספק תרופות טיפוליות ל- CNS22.
הדמיית ספיגת SEV על ידי תאי CNS רבים בחוט השדרה תאפשר הן מחקרים מכניים והן הערכת היתרונות הטיפוליים של SEV מנוהל אקסוגני ממקורות תאיים שונים. מאמר זה מתאר את המתודולוגיה לתייג SEVs הנגזר מקרופאגים ולדמיין את ספיגתם במבחנה וב- vivo בחוט השדרה המותני על ידי נוירונים, מיקרוגליה ואסטרוציטים כדי לאשר באופן איכותי את מסירת SEV על ידי הדמיה.

<table><tbody><tr><td>Amicon Ultra 0.5 מ"ל מסננים צנטריפוגליים</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z677094</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן Anti-Alix</td><td>Abcam</td><td>ab186429</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>נוגדן נגד קלנקסין</td><td>Abcam</td><td>Ab10286</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>נוגדן Anti-CD81 Santa</td><td>Cruz Biotechnology</td><td>sc-166029</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>נוגדן חד שבטי נגד GAPDH (14C10)</td> <td>איתות תאים טכנולוגיה</td><td>2118</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>נוגדן חלבון חומצי סיבי נגד גליה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>MAB360</td><td>1:500 עבור IF; 1:1000 עבור</td></tr><tr><td>IHC Anti-Iba1 נוגדן</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>נוגדן Anti-MAP2A</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>MAB378</td><td>1:500</td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים, 40 &mu; m</td><td>VWR</td><td>15-1040-1</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td>12,000 x</td></tr><tr><td>g Coverslip, 12 מ"מ, #1.5</td><td>Electron Microscopy</td><td>Sciences 72230-01</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip, 18 מ"מ, #1.5</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72222-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>1 & micro; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>בדיקת חלבון DC</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>דאוקסיריבונוקלאז I (DNAse I)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D4513-1VL</td><td></td></tr><tr><td>חמור נגד ארנב IgG H& L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab16284</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>חמור נגד ארנב IgG H& L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1:500</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ חלביות כפולות, #1</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>DPBS ללא קורנינג סידן ומגנזיום</td><td></td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הנשר השונה של Dulbecco (DMEM)</td> <td>קורנינג</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי מדולדל אקסוזום</td><td>Gibco</td><td>A27208-01</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td> <td>קורנינג</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>מערכת הדמיה FluorChem M</td><td>חלבון פשוט</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV3000 מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>עז אנטי עכבר IgG H& L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG H& L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>1:500</td></tr><tr><td>עז נגד עכבר IgG1, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-21125</td><td>1:500</td></tr><tr><td>תמיסת המלח המאוזנת של האנק (HBSS)</td><td>VWR</td><td>02-0121</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>HRP מצע</td><td>Thermo Scientific</td><td>34094</td><td></td></tr><tr><td>מאגר חסימת יירוט, TBS</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-60001</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli SDS מאגר מדגם</td><td>אלפא Aesar</td><td>AAJ61337AC</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו כיסוי זכוכית, #1</td><td>VWR</td><td>48404-454</td><td></td></tr><tr><td>מיקרום HM550</td><td>תרמו מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300 מערכת</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NTA 3.2 תוכנה</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קו תאים Neuro-2a</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>מעבדות וקטור</td><td>סרום עיזים רגיל</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T תרכובת</td><td>סאקורה פינטק</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>פפאין</td><td>וורת'ינגטון תאגיד ביוכימי</td><td>NC9597281</td><td></td></tr><tr>מדעי <td>מיקרוסקופיית אלקטרונים</td><td>פרפורמלדהיד</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PKH26</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>MINI26-1KT</td><td></td></tr><tr><td>PKH67</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז קוקטייל</td><td>תרמו מדעי</td><td>1862209</td><td></td></tr><tr><td>PVDF ממברנת העברת</td><td>MDI</td><td>SVFX8302XXXX101</td><td></td></tr><tr><td>RAW 267.4 קו תאים</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RIPA מאגר</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>אמרסקו</td><td>0241-2.5 ק"ג</td><td></td></tr><tr><td>סופרפרוסט פלוס זהב שקופיות</td><td>תרמו מדעי</td><td>15-188-48</td><td>שקופיות דבק</td></tr><tr><td>T-75 צלוחיות</td><td>קורנינג</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai 12 שידור דיגיטלי מיקרוסקופ אלקטרונים</td><td>חברת FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>FSF300-cu</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל חלבון Tris-Glycine, 12%</td> <td>Invitrogen</td><td>XP00120BOX</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine SDS מאגר ריצה</td><td>Invitrogen</td><td>LC26755</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine Transfer Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td></td><td>12605028 אנזים דיסוציאציה של תאים</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327371000</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין, 0.25%</td> <td>Corning</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>צינורות אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן</td><td>344058</td><td>110,000 x גרם</td></tr></tbody></table>

ספיגת של שלל פלואורסצנטי שכותרתו שלשלות חוץ תאיות קטנות במבחנה ובחוט השדרה

Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

שלל חוץ-תאי קטן (sEVs) הם שלל 50-150 ננומטר המופרש על ידי כל התאים ונוכח בנוזלי גוף. sEVs מעבירים ביומולקולים כגון RNA, חלבונים ושומנים מתורם לתאים מקבלים, מה שהופך אותם למתווכים מרכזיים בין תאים. במערכת העצבים המרכזית (מערכת העצבים המרכזית), sEVs יכול לתווך איתות בין תאי, כולל אינטראקציות נוירואימוניות. פונקציות sEV ניתן ללמוד על ידי מעקב אחר ספיגת sEVs מסומן בתאי הנמען הן במבחנה והן ב- vivo. מאמר זה מתאר את התיוג של sEVs מהמדיה המותנית של תאי מקרופאגים RAW 264.7 באמצעות צבע קרום PKH. זה מראה את ספיגת ריכוזים שונים של sEVs מסומן בנקודות זמן מרובות על ידי תאי Neuro-2a אסטרוציטים ראשוניים במבחנה. כמו כן מוצגת ספיגת SEVs המועברת באופן תוך-רחמי בנוירונים של חוט השדרה של העכבר, אסטרוציטים ומיקרוגליה המודגמים על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. התוצאות הייצוגיות מדגימות שונות תלוית זמן בספיגת ה- SEVs על ידי תאים שונים, אשר יכול לעזור לאשר מסירת SEVs מוצלחת לחוט השדרה.

לאחר בידוד של SEVs מ RAW 264.7 מדיה מותנית באמצעות צנטריפוגה, NTA שימש כדי לקבוע את הריכוז ואת התפלגות הגודל של SEVs מטוהר. הגודל הממוצע הממוצע של ה-RAW 264.7 sEVs נגזר היה 140 ננומטר, וגודל החלקיקים שיא היה 121.8 ננומטר, המאשר כי החלקיקים הניתנים לזיהוי ביותר במדידת פיזור האור נפלו בטווח הגודל של exosomes או sEVs ב 50-150 ננומטר (איור 1A). כפי שהוצע במידע המינימלי למחקרים של שלל חוץ תאי 2018 (MISEV2018)23, ניתחנו קבוצה של חלבונים שיש להציג או לא לכלול מאוכלוסיות EV נ...

אנו מתארים פרוטוקול לתיוג שלטי מקרופאג' קטנים חוץ-תאיים עם צבעי PKH ומתבוננים בקליטתם במבחנה ובחוט השדרה לאחר הלידה התוך-תאית.

Small extracellular vesicles (sEVs) are 50-150 nm vesicles secreted by all cells and present in bodily fluids. sEVs transfer biomolecules such as RNA, ...

הדמיית ספיגה של שלל חוץ תאי קטן, הידוע גם בשם sEVs, על ידי תאים שונים בחוט השדרה, יכול לאשר משלוח מוצלח של sEVs. זה מאפשר מחקרים מכניים וטיפוליים של SEV מנוהל תוך-אטקלי ממקורות שונים במודלים רודן. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לדמיין ספיגת SEVs על ידי תאים בחוט שדרה מתון, והוא יכול לעזור להעריך את התפקיד של SEVs ומולקולות המטען שלה בהפרעות בעמוד השדרה, כאב ודלקת.הליך זה יודגם על ידי, יחד עם שואן לואו ו nd ז'וצנג לין, שני סטודנטים לתארים מתקדמים במעבדה של ד"ר Seena אג'יט. התחל על ידי הצבת 18 מילימטר כיסוי מחליק בצלחת 12 טוב, ולאחר מכן צלחת נוירו-2a תאים בכל באר עם סך של 1 מיליליטר של DMEM מלא המכיל 10%FBS ו 1%סטרפטופון עט. כאשר שטף ספירת התאים הגיע ל- 80 עד 90%שנה את המדיום המדולדל של בינוני ל- DMEM exosome בכל באר הוסף אחד, 5 או 10 מיקרוגרם של SEVs המסומנים בתווית.במשך שעה, ארבע ו-24 שעות. עבור מינון וזמן תלוי ספיגה לשאר בארות בנפח שווה של בקרת צבע. לאסוף את המוחות של גורים לאחר הלידה בצלחת 60 מילימטר, פטרי המכילה קר קרח הנקס פתרון מלח מאוזן בתוספת 10 hepes מילימולר, לנתח את שתי האונות קליפת המוח ולהסיר את קרום המוח.ואז לטחון את הרקמות עם להב מעוקר. מעבירים את הרקמות לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר המכיל פפאן או deoxyribonucleus חיץ דיסוציאציה אחד ודגרה במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, מערבל את הצינור כל 5 דקות, לשאוף supernatant ולהוסיף 5 מיליליטר של DMEM מלא לצינור. כדי לנטרל את פעילות האנזים, נסו לדרג בזהירות לנתק את הרקמות עם פיפטה סרולוגית מזכוכית של 5 מיליליטר, ופיפטת מרעה מלוטשת להבה.להעביר את ההשעיה התא דרך מסננת תא 40 micrometer, ולאחר מכן צנטריפוגה התאים ב 250 פעמים G במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, לשאוף את המדיום ולראות את התאים ב 10 מיליליטר של DMEM מלא בבקבוק 75 סנטימטר רבוע. לאחר 4 שעות של ציפוי, להחליף את supernate ובינוני עם 15 מיליליטר של בינוני DMEM טרי. לאחר 14 ימים במבחנה כדי לנתק את המיקרוגליה ואוליגודנדרוציטים, להעביר את הבקבוקון לשייקר מסלולית ב 320 סל"ד במשך 6 שעות.השתמש 5 מיליליטר של אנזים דיסוציאציה התא במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. כדי לשוטט, אסטרוציטים הנותרים, כדי לנטרל את הפעולה אנזימטית, להוסיף 5 מיליליטר של DMEM מלא ולאחר מכן גלולה את התאים ב 250 פעמים G במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. resuspend התאים ב DMEM מלא ולראות את התאים על 12 מילימטר מספר כיסוי 1.5 פתקים בלוח 24 באר.באמצעות PBS לשטוף את התאים 3 פעמים ולאחר מכן לתקן אותם עם 4% כוח פורמלדהיד או PFA ב- PBS במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את התאים הקבועים 3 פעמים במשך 5 דקות עם PBS ולחלחל להם באמצעות 0.1% Triton X 100 ב- PBS במשך 10 עד 15 דקות. ואז לחזור על הכביסה עם PBS.השתמש 5% סרום עז רגיל או NGS ב- PBS במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר כדי לחסום את התאים, לדגור על תאי neuro-2a עם מפות נוגדנים דו כיווניים ואת אסטרוציטים העיקריים עם נוגדני GFAP ביחס 1 עד 500 טרי 5%NGS או PBS לילה ב 4 מעלות צלזיוס עם רועד עדין. לאחר שטיפת התאים 3 פעמים ב- PBS, הוסיפו את הנוגדנים המשניים הצומדים פלואורופור ב-5% NGS. דגירה במשך שעתיים בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור על רוקר.חזור על הכביסה עם PBS ודגר את התא עם 1 מיקרוגרם למיליליטר של DAPI במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. שוב, לשטוף את התאים 3 פעמים עם PBS. באמצעות מדיום נגד דהייה, לעלות את כיסוי מחליק על שקופיות מספר 1, לתת להם להתייבש לילה בחושך ולאחסן את שקופיות זכוכית מוכן ב 4 מעלות צלזיוס עד הדמיה על מיקרוסקופ קונפוקלי.לנתח את חוט השדרה ולתקן אותו ב 4%PFA ב PBS ב 4 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות. לפני להגן על הרקמות ב 30% סוכרוז ב PBS ב 4 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות או עד הרקמות לשקוע ולאחר מכן לאחסן את הרקמות ב 4 מעלות צלזיוס עד immunohistochemry, imbed חוט השדרה L4 L5 במתחם OCT, ולאחר מכן להקפיא אותו על קרח יבש עד שהוא מוצק לחלוטין. השתמש cryostat כדי לחלק את הרקמות ב 30 מיקרומטר ואת לאסוף את החלקים בצלחת 24 באר המכיל PBS.לשטוף את הסעיפים 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם 0.3% טריטון ב- PBS, לחסום את אתרי הכריכה שאינם ספציפיים באמצעות 5% MGS ב 0.3% טריטון PBS במשך 2 שעות בטמפרטורת החדר. לדגור את החלקים לילה ב 4 מעלות צלזיוס על שייקר. לשטוף את הסעיפים 3 פעמים במשך 5 דקות עם 0.3% טריטון ב PBS.לאחר מכן להוסיף את הריכוז המתאים של הנוגדנים המשניים. על פי כתב היד של הטקסט, דגירה בטמפרטורת החדר במשך שעתיים, לשטוף את החלקים באמצעות PBS בלבד ולדגור אותם 1 מיקרוגרם למיליליטר של DAPI במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן חזרו על שטיפת ה-PBS תחת מיקרוסקופ בהיר, הרכיבו את המקטעים על שקופית דבק ברורה עם מברשת צבע עדינה.הרטיבו את פתק הכיסוי עם המדיום הרכבה ורפאו בן לילה בחושך בטמפרטורת החדר, רכשו תמונות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי עם הלייזרים המתאימים, הגודל הממוצע הממוצע של RA 2 6 4 0.7 sEVs נגזר היה 140 ננומטר וגודל החלקיקים השיא היה 121.8 ננומטר. עם החלקיקים הניתנים לגילוי ביותר נופלים בטווח הגודל של אקסוזומים או sEVS. ב 50 עד 150 ננומטר, סופג מערבי של SEVs, תא ליסאט ומדיה exodeted, הוכיח כי דגימות חלבון נגזר sEV הכיל את חלבוני סמן SEV Alix CD81 ו GAPDH.ליסאט התא הועשר ברטיקולום אנדופלסמי, חלבון תושב Calnexin ולכן Calnexin שימש סמן שלילי לזיהום התא כפי שהוא נעדר ב- sEVs. נצפתה כי ספיגת ה- SEVs התרחשה בשעה אחת וב- 1, 5 ו - 10 מיקרוגרם SEVs, פלואורסצנטיות לאחר הדגירה יכולה להיות מזוהה ב 4 שעות, עבור 4, 5, ו 10 מיקרוגרם של SEVs. ספיגת ה- SEVs המסומנים PKH 26 על ידי אסטרוציטים ראשוניים נבדקה ונבדקה פלואורסצנטיות מרבית מספיגת SEVS באסטרוציטים קליפת המוח העיקריים התרחשה ב 24 שעות PKH26-labeled sEVs נלקחו פלואורסצנטיות מקסימלית נצפתה ב 6 שעות, לאחר הזרקה אסטרוציטים נוירונים ותאים מיקרוגליאליים.הכללת בקרות, SEVs ללא תווית, ובקרת צבע זה ליצור קוד לרוח חיובית אותות לאחרונה בשל עכשיו ספציפי תיוג ריקוד Opry של חופי טלאי צבע מאוגדים. ספיגת רכבים יכולים להיות מאושרים על ידי חקירת העברת מטען ביומולקולרית למתכון ותאים ורקמות וקביעת השינויים ברמות הביטוי של ביומולקולות או גנים ממוקדים. מחקרי התנהגות יכולים להתבצע גם, כדי לחקור את ההשפעה התפקודית של משלוח sEV.

uptake-fluorescent-labeled-small-extracellular-vesicles-vitro-spinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

אנו מתארים טכניקה פשוטה עלות נמוכה להכנסת ריכוז גבוה של צבעי ניאון וסידן רגיש אל הנוירונים או כל בדרכי העצבית באמצעות טפטפת יניקה פוליאתילן.

טוען מדרדר עצבים, קטעי צליל, ושורשים השדרה עם צבעי ניאון

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקה כדי לדמיין ולכמת את הספיגה התאית של שלפוחיות חוץ-תאיות או EVs. בדיקה זו עושה שימוש בהדמיה פלואורסצנטית תלת-ממדית באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ומאפשרת להבחין בין כלי רכב חשמליים מופנמים לבין רכבים חשמליים המודבקים לפני השטח של התא.

בדיקת ספיגת שלפוחית חוץ-תאית: שיטה לדמיין ולכמת ספיגה תאית של שלפוחיות חוץ-תאיות באמצעות טכניקת הדמיה פלואורסצנטית תלת-ממדית

סרטון זה מדגים כיצד שלפוחיות עצביות מסומנות בחלבונים פלואורסצנטיים ספציפיים כדי לדמיין את תנועתן. ראשית, פלסמיד המקודד לחלבון פלואורסצנטי מודגר עם סוכן טרנספקציה ולאחר מכן מוכנס לתרבית של נוירונים. לאחר מכן, תמונות של הנוירונים נרכשות ומנותחות כדי לעקוב אחר תנועת השלפוחיות.

הדמיה של תנועתיות שלפוחית בתאי עצב באמצעות הדמיה פלואורסצנטית

הכנה חדשה vivo לשעבר הדמיה חוט השדרה העכבר. פרוטוקול זה מאפשר לשני פוטונים הדמיה של אינטראקציות הסלולר בשידור חי בכל רחבי חוט השדרה.

הדמיה שני פוטונים של Dynamics הסלולרי בחוט השדרה העכבר

שלפוחית סינפטית אנדוציטוזה מזוהה על ידי מיקרוסקופ אור של pHluorin התמזגו עם שלפוחית סינפטית חלבונים על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים של ספיגת שלפוחית.

מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית

בעבודה זו, אנו מתארים פרוטוקולים לחקור את התפקיד של שלפוחית חוץ-תאית (EVs) שפורסמו על ידי הפלזמודיום falciparum זיהום אריתרוציטים. בפרט, אנו מתמקדים האינטראקציות של EVs עם תאי אנדותל.

הערכה של תפקוד שלפוחית חוץ-תאית במהלך מלריה זיהום

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לסימון שלטי דם חוץ-תאיים שמקורם בטסיות דם כדי לפקח על נדידתם וקליטתם בגזירי סחוס המשמשים כמודל לדלקת מפרקים ניוונית.

תיוג של שלל חוץ-תאי לניטור הגירה וספיגה של סחוס

שתי שיטות קשורות מתוארות כדי לדמיין אירועים תת-תאיים הנדרשים לשידור סינפטי. פרוטוקולים אלה מאפשרים ניטור בזמן אמת של הדינמיקה של זרם סידן presynaptic והיתוך קרום שלפוחית סינפטי באמצעות הדמיה של תאים חיים של נוירונים בתרבית הפריה חוץ גופית .

מדידה פלואורסצנטית בזמן אמת של פונקציות סינפטיות במודלים של טרשת אמיוטרופית לרוחב

שלל חוץ-תאי (EVs) תורמים לביולוגיה תאית ולתקשורת בין-תאית. יש צורך לבדיקות מעשיות כדי לדמיין ולתייג ספיגת EVs על ידי התאים. הפרוטוקול הנוכחי מציע את בדיקת ספיגת EV על ידי שימוש בהדמיית פלואורסצנטיות תלת ממדית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקל, לאחר בידוד EV על ידי מכשיר מיקרופלואידי מבוסס ננו-סינון.

ספיגת ארסיה חוץ-תאית באמצעות ניתוח הדמיית מיקרוסקופ קונפוצלי

סרט הווידאו הזה מדגים שיטה לנתח ותרבות נוירונים commissural מחוט השדרה הגבי E13 חולדה. נוירונים commissural ניתק מועילים כדי ללמוד את המנגנונים תאית ומולקולרית של צמיחה האקסון והדרכה.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

למדו פרוטוקול לסימון ומעקב אחר ספיגת vesicles תאיים קטנים (sEVs) בחוט השדרה באמצעות צבעי PKH. שיטה זו מאפשרת הערכת יעילות טיפולית בדגמים של כאב ודלקת עצבית.

ספיגת של שלל פלואורסצנטי שכותרתו שלשלות חוץ תאיות קטנות במבחנה ובחוט השדרה

גלה סרטונים נוספים