Name: הדמיה מיוצבת של אורך ב-Vivo ברמה התאית של הלבלב במודל מורין עם חלון הדמיה תוך-וינטלית של הלבלב (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: למד הדמיה תוך-ויטלית יציבה של הלבלב ברמה התאית בעכברים באמצעות חלון הדמיה תוך-וינטלי חדשני. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר איי לנגרהנס ותאי סרטן לאורך שלושה שבועות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי מענק מס '14-2020-002 מקרן המחקר SNUBH ועל ידי מענק קרן המחקר הלאומית של קוריאה (NRF) במימון ממשלת קוריאה (MSIT) (NRF-2020R1F1A1058381, NRF-2020R1A2C3005694).

כל ההליכים המתוארים במאמר זה נערכו בהתאם למהדורההשמינית של המדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה (2011)26 ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש במכון המתקדם למדע וטכנולוגיה בקוריאה (KAIST) ובאוניברסיטת סיאול הלאומית בונדאנג בית החולים (SNUBH).
1. הכנת החלון וחומרים אחרים
<ol><li>עיצוב מותאם אישית של חלון ההדמיה התוך-וינטלי של הלבלב כדי לבודד את הלבלב מהמעי בחלל הבטן18 (איור 1A,B). שרטוט מפורט של החלון מתואר בדמות משלימה של מחקר קודם18.</li>
	<li>השתמש בעכברים C57BL/6N, זכרים בני 8-12 שבועות, להדמיית לבלב תוך-ויאלית. הזריק נוגדן נגד CD31 מצומד עם פלואורופור Alexa 647, 2 שעות לפני ההדמיה, לצורך תיוג כלי18.</li>
	<li>למחקר האיים, הכינו מודל עכבר מהונדס שבו האיים מתויגים בחלבון עיתונאי פלואורסצנטי. כאן, השתמשנו MIP-GFP, שבו חלבון פלורסנט ירוק בא לידי ביטוי תחת שליטתו של מקדם גנים אינסולין העכבר 1, אשר פעיל בתאי ביתא של כל האיים בעכבר24.</li>
	<li>לחקר סרטן הלבלב, הכינו תאים סרטניים מהונדסים המתויגים בחלבון עיתונאי פלואורסצנטי ועכברים עירומים BALB/C. במחקר זה, PANC-1 NucLight תאים אדומים שימשו. PANC-1 תאים סרטניים25 תויגו עם גשושית הפלואורסצנט האדום NucLight.</li>
	<li>לחטא את כל הכלים הכירורגיים, לכסות זכוכית (עם PEG או לא), וחלונות הדמיה באמצעות autoclave.</li>
	<li>יש למרוח ציפוי PEG על הכיסוי כדי למנוע תגובה דלקתית ולהגביר את הכשירות הביולוגית, המתאימה להדמיה ארוכת טווח.</li>
</ol>2. ניתוח
<ol><li>הכן פלטפורמה כירורגית סטרילית וחטא את המשטחים עם 70% אתנול. הערה: עבור מפגשי הדמיה אורך, טכניקה אספטית היא חיונית.</li>
	<li>עכברים מרדים עם תערובת של טילטמין/זולאזפאם (30 מ"ג/ק"ג) וקסילאזין (10 מ"ג/ק"ג). הערה: מומלץ להשתמש בטילטמין/זולאזפאם במקום בקטמין בגלל השפעתו השלילית של היפרגליקמיה. הרדמה אופטימלית יש לבחור לצורך הניסוי9,27.</li>
	<li>נטר את טמפרטורת הגוף באמצעות בדיקה רקטלית עם כרית חימום מבוקרת הומיאותרמית.</li>
	<li>גילחו את האגף השמאלי של העכבר והחלו שלושה סיבובים של אלכוהול לסירוגין וקרצוף על בסיס יוד. הערה: אם קרם depilatory משמש, לא להשאיר יותר מ 1 דקה כדי למנוע כוויות כימיות.</li>
	<li>בצע 1.5 ס"מ חתכו על האגף השמאלי של העכבר ולנתק את העור והשריר.</li>
	<li>בצע תיל מחרוזת ארנק עם שחור או ניילון 4-0 תיל בשולי החתיכה.</li>
	<li>השתמש מפסק מיקרו על הסינג'ן וחשוף בעדינות את הטחול.</li>
	<li>בזהירות לאגד את הטחול עם מלקחיים טבעת ולזהות את הלבלב.</li>
	<li>הנח את החלון באגף העכבר והעבר את הטחול והלבלב דרך המרחב הפתוח של החלון. מניפולציה של הלבלב צריך להיות מאוד גוי כפי שהוא יכול לגרום לדימום או דלקת הלבלב</li>
	<li>מניחים בעדינות את הלבלב על צלחת חלון ההדמיה; הטחול יונח על השטח הפתוח של החלון.</li>
	<li>למחקר תא הסרטן, להזריק PANC-1 NucLight אדום (1.0 x 106 תאים) ישירות לתוך הלבלב. הערה: להדמיה את קסנוגרפטים סרטן הלבלב האנושי האורתוטופי, השתלה ישירה של תאים סרטניים כגון PANC-1 או תא סרטן לבלב אנושי אחר ניתן להקלעל 28. כדי לדמיין עם מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות תוך-וינטלית, תאי PANC-1 הועברו עם חלבון פלואורסצנטי אדום באמצעות ריאגנט לנטיוויראלי אדום NucLight המסמן את הגרעין29. למרות נפח הזרקה מקסימלי הוא לא בטוח, להקטין את הנפח ככל האפשר כדי למנוע את אפקט הלחץ בלבלב.</li>
	<li>החל טיפות של דבק N-בוטיל ציאנואקרילט בשולי חלון ההדמיה.<ol>
<li>כדי למזער את כמות הדבק המוחל, השתמש במחט קטטר 31 G עבור היישום. אם כמות הטיפה גדולה, אז הרקמה תדבוק בשוגג בחלון או בזכוכית הכיסוי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>יש למרוח בעדינות כיסוי עגולה 12 ממ על שולי חלון ההדמיה.</li>
	<li>משוך את לולאת התפר כדי להתאים לחריץ לרוחב של החלון ולקשור אותו שלוש פעמים.</li>
	<li>לחתוך את האתר הפרוקסימלי המרבי של הקשר כדי למנוע את ההפרעה של תפרים הדוקים כאשר עכברים אלה ערים.</li>
	<li>תן לעכברים להתאושש מהרדמה (2-3 שעות) ולהזריק ketoprofen (5 מ"ג / קילוגרם, תת עורי בעור הרופף בבסיס הצוואר או הירך של החיה) לשיכוך כאבים. הערכה מחדש לסימני כאב כל 12 שעות וקטופרפן צריך להיחשב כל 24 שעות במשך 1-3 ימים. הערה: שכוויות נטל משפיעות על הפרשת אינסולין בתגובה גלוקוז9. הבחירה והתזמון של שך נטל חייב להיות אינדיבידואלי למטרה הניסיונית.</li>
	<li>להתארח את העכבר בכלוב עם מצעים מספיקים כדי למנוע את המגע של החלון לכלוב. הימנע דיור הבית עם העכברים ללא ניתוח החלון.</li>
</ol>3. הדמיה תוך-ויאלית
<ol><li>הפעל את המיקרוסקופ התוך-וינטלי כולל כוח הלייזר.</li>
	<li>הפעל את כרית החימום והגדר את הרגולציה ההומיאותרמית ל -37 מעלות צלזיוס. הערה: לחלופין, השתמש כרית חימום פסיבית או מנורה עם שליטה תכופה אם אין רגולציה הומיאותרמית.</li>
	<li>בצע הרדמה תוך שרירית עם תערובת של טילטמין/זולאזפאם (30 מ"ג/ק"ג) קסילאצין (10 מ"ג/ק"ג). הערה: מומלץ להשתמש בטילטמין/זולאזפאם במקום בקטמין בגלל השפעתו השלילית של היפרגליקמיה. הרדמה אופטימלית יש לבחור לצורך הניסויים9,27.</li>
	<li>הכנס קטטר וסקולרי להזרקה.<ol>
<li>החל לחץ על הצד הפרוקסימלי של הזנב עם האינדקס והאצבע השלישית כחלופה ליישום חוסם עורקים. מחממים את הזנב עם מנורה במידת הצורך.</li>
		<li>לחטא את וריד הזנב עם תרסיס אתנול 70%.</li>
		<li>הכנס קטטר 30 גרם לתוך הווריד זנב לרוחב. התחדשות של דם תהיה דמיונית בצינור PE10.</li>
		<li>החל סרט משי על הקטטר כדי לייצב אותו.</li>
		<li>הזרקת FITC / TMR dextran או בדיקות פלואורסצנטיות אחרות (25 מיקרוגרם של אנטי CD31 מצומד עם Alexa 647), לפי הצורך, על פי השילוב של בדיקות פלואורסצנטיות18. הערה: עבור בדיקות נוגדנים מצומדות פלואורסצנטיות, הזריקו 2 שעות לפני מפגש ההדמיה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>העבר את העכבר מהפלטפורמה הכירורגית לשלב ההדמיה.</li>
	<li>הכנס בדיקה רקטלית כדי לשלוט באופן אוטומטי בטמפרטורת הגוף באמצעות מערכת כרית חימום הומיאותרמית.</li>
	<li>הכנס את חלון הדמיית הלבלב למחזיק החלון שהוכן במהלך ההתקנה של מיקרוסקופיה תוך-ויאלית(איור 2). עבור מיקרוסקופ הפוך, ייתכן שלא יידרש מחזיק חלון.</li>
	<li>בצע הדמיה תוך-ויאלית.<ol>
<li>להדמיית הלבלב, התחילו בעדשה אובייקטיבית להגדלה נמוכה (למשל, פי 4) לסריקת כל הנוף של הלבלב בחלון הדמיית הלבלב (שדה ראייה מומלץ: 2500 x 2500 מיקרומטר).</li>
		<li>לאחר קביעת אזור העניין, עבור לעדשת יעד הגדלה גבוהה יותר (20x או 40x) כדי לבצע את ההדמיה ברמה התאית (שדה ראייה מומלץ: 500 x 500 מיקרומטר או 250 x 250 מיקרומטר). בניסוי זה, הרזולוציה לרוחב ולקסיאלי הייתה כ-0.5 מיקרומטר ו-3 מיקרומטר, בהתאמה.</li>
		<li>בצע הדמיה של z-stack או זמן-לשגות כדי לבחון את המבנה התלת-ממדי או את הדינמיקה ברמה התאית, כגון העברת תאים. הערה: להדמיית חלבון פלואורסצנטי המבטא תאים של בעלי חיים מהונדסים (MIP-GFP), 30 s של חשיפה לייזר לסירוגין 488 ננומטר עם כוח עד 0.43 mW היה נסבל ללא בליבנה פוטו או נזק לרקמות מורגש. להדמיית החלבונים הפלואורסצנטיים המסומנים באלקסה 647, כוח הלייזר של 640 ננומטר עד 0.17 מ"ו היה נסבל ללא בליבנה או נזק לרקמות. חשיפה ממושכת בלייזר עם כוח מעל הגדרה זו עלולה להוביל להלבנה פוטו או לנזק לרקמות על ידי פוטוטוקסיה. התאם את הרווח והעוצמה המתאימים כדי לדמות כראוי את אזור העניין. הגדרה מפורטת של פרמטרים במיקרוסקופיה תוך-ויאלית חייבת להיות אינדיבידואלית עבור כל מיקרוסקופיה תוך-ויאלית שהוכנה במכון.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Dimastromatteo, J., Brentnall, T., Kelly, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+in+pancreatic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Gastroenterology+%26+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Imaging in pancreatic disease.</a> Nature Reviews. Gastroenterology & Hepatology. 14 (2), 97-109 (2017).</li>
<li>Cote, G. A., Smith, J., Sherman, S., Kelly, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+for+imaging+the+normal+and+diseased+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Technologies for imaging the normal and diseased pancreas.</a> Gastroenterology. 144 (6), 1262-1271 (2013).</li>
<li>Yachida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+occurs+late+during+the+genetic+evolution+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1114-1117 (2010).</li>
<li>Hardt, P. D., Brendel, M. D., Kloer, H. U., Bretzel, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+pancreatic+diabetes+%28type+3c+diabetes%29+underdiagnosed+and+misdiagnosed%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Is pancreatic diabetes (type 3c diabetes) underdiagnosed and misdiagnosed.</a> Diabetes Care. 31, Suppl 2 165-169 (2008).</li>
<li>Baetens, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+islet+cell+populations+in+spontaneously+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Alteration of islet cell populations in spontaneously diabetic mice.</a> Diabetes. 27 (1), 1-7 (1978).</li>
<li>Holmberg, D., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+the+pancreas%3A+from+ex+vivo+to+non-invasive+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology.</a> Diabetologia. 51 (12), 2148-2154 (2008).</li>
<li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li>
<li>Ravier, M. A., Rutter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+mouse+pancreatic+islets+for+ex+vivo+imaging+studies+with+trappable+or+recombinant+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of mouse pancreatic islets for ex vivo imaging studies with trappable or recombinant fluorescent probes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 171-184 (2010).</li>
<li>Frikke-Schmidt, H., Arvan, P., Seeley, R. J., Cras-Meneur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+in+vivo+imaging+method+for+individual+islets+across+the+mouse+pancreas+reveals+a+heterogeneous+insulin+secretion+response+to+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Improved in vivo imaging method for individual islets across the mouse pancreas reveals a heterogeneous insulin secretion response to glucose.</a> Science Reports. 11 (1), 603(2021).</li>
<li>Lee, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+resveratrol+treatment+on+graft+revascularization+after+islet+transplantation+in+streptozotocin-induced+diabetic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Effect of resveratrol treatment on graft revascularization after islet transplantation in streptozotocin-induced diabetic mice.</a> Islets. 10 (1), 25-39 (2018).</li>
<li>Evgenov, N. V., Medarova, Z., Dai, G., Bonner-Weir, S., Moore, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of islet transplantation.</a> Nature Medicine. 12 (1), 144-148 (2006).</li>
<li>Mojibian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implanted+islets+in+the+anterior+chamber+of+the+eye+are+prone+to+autoimmune+attack+in+a+mouse+model+of+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Implanted islets in the anterior chamber of the eye are prone to autoimmune attack in a mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 56 (10), 2213-2221 (2013).</li>
<li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging.</a> Cell. 147 (5), 983-991 (2011).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+implantation+of+an+abdominal+imaging+window+for+intravital+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy.</a> Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+microscopy+through+an+abdominal+imaging+window+reveals+a+pre-micrometastasis+stage+during+liver+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis.</a> Science Translational Medicine. 4 (158), (2012).</li>
<li>Ritsma, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+crypt+homeostasis+revealed+at+single-stem-cell+level+by+in+vivo+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intestinal crypt homeostasis revealed at single-stem-cell level by in vivo live imaging.</a> Nature. 507 (7492), 362-365 (2014).</li>
<li>Dolensek, J., Rupnik, M. S., Stozer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+similarities+and+differences+between+the+human+and+the+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Structural similarities and differences between the human and the mouse pancreas.</a> Islets. 7 (1), 1024405(2015).</li>
<li>Park, I., Hong, S., Hwang, Y., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+pancreatic+imaging+window+for+stabilized+longitudinal+in+vivo+observation+of+pancreatic+islets+in+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+%26+Metabolism+Journal%22%5BJournal%5D)">A Novel pancreatic imaging window for stabilized longitudinal in vivo observation of pancreatic islets in murine model.</a> Diabetes & Metabolism Journal. 44 (1), 193-198 (2020).</li>
<li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+disturb+pulmonary+microcirculation+in+sepsis-induced+acute+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">Neutrophils disturb pulmonary microcirculation in sepsis-induced acute lung injury.</a> The European Respiratory Journal. 53 (3), 1800786(2019).</li>
<li>Park, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+a+pulmonary+endothelial+surface+layer+in+a+murine+sepsis+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of a pulmonary endothelial surface layer in a murine sepsis model.</a> Biomedical Optics Express. 9 (5), 2383-2393 (2018).</li>
<li>Seo, H., Hwang, Y., Choe, K., Kim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+quantitation+of+injected+circulating+tumor+cells+from+great+saphenous+vein+based+on+video-rate+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo quantitation of injected circulating tumor cells from great saphenous vein based on video-rate confocal microscopy.</a> Biomedical Optics Express. 6 (6), 2158-2167 (2015).</li>
<li>Moon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+longitudinal+imaging+of+hepatic+lipid+droplet+accumulation+in+a+murine+model+for+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Intravital longitudinal imaging of hepatic lipid droplet accumulation in a murine model for nonalcoholic fatty liver disease.</a> Biomedical Optics Express. 11 (9), 5132-5146 (2020).</li>
<li>Hwang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cellular-level+real-time+pharmacokinetic+imaging+of+free-form+and+liposomal+indocyanine+green+in+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">In vivo cellular-level real-time pharmacokinetic imaging of free-form and liposomal indocyanine green in liver.</a> Biomedical Optics Express. 8 (10), 4706-4716 (2017).</li>
<li>Hara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mice+with+green+fluorescent+protein-labeled+pancreatic+beta+-cells%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%2C+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Transgenic mice with green fluorescent protein-labeled pancreatic beta -cells.</a> American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 284 (1), 177-183 (2003).</li>
<li>Lieber, M., Mazzetta, J., Nelson-Rees, W., Kaplan, M., Todaro, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+continuous+tumor-cell+line+%28panc-1%29+from+a+human+carcinoma+of+the+exocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment of a continuous tumor-cell line (panc-1) from a human carcinoma of the exocrine pancreas.</a> International Journal of Cancer. 15 (5), 741-747 (1975).</li>
<li>National Institutes of Health. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals.+Committee+for+the+Update+of+the+Guide+for+the+Care+and+Use+of+Laboratory+Animals%5BTitle%5D)+AND+%22The+National+Academies+Collection%3A+Reports+funded+by+National+Institutes+of+Health%22%5BJournal%5D)">Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals.</a> The National Academies Collection: Reports funded by National Institutes of Health. , (2011).</li>
<li>Windelov, J. A., Pedersen, J., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+anesthesia+dramatically+alters+the+oral+glucose+tolerance+and+insulin+secretion+in+C57Bl%2F6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reports%22%5BJournal%5D)">Use of anesthesia dramatically alters the oral glucose tolerance and insulin secretion in C57Bl/6 mice.</a> Physiological Reports. 4 (11), 12824(2016).</li>
<li>Kim, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+orthotopic+and+heterotopic+human+pancreatic+cancer+xenografts+in+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of orthotopic and heterotopic human pancreatic cancer xenografts in immunodeficient mice.</a> Nature Protocols. 4 (11), 1670-1680 (2009).</li>
<li>Cichocki, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GSK3+inhibition+drives+maturation+of+NK+cells+and+enhances+their+antitumor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">GSK3 inhibition drives maturation of NK cells and enhances their antitumor activity.</a> Cancer Research. 77 (20), 5664-5675 (2017).</li>
<li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+C-peptide+storage+and+secretion+in+islet+beta-cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Monitoring C-peptide storage and secretion in islet beta-cells in vitro and in vivo.</a> Diabetes. 65 (3), 699-709 (2016).</li>
<li>Reissaus, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile%2C+portable+intravital+microscopy+platform+for+studying+beta-cell+biology+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">A versatile, portable intravital microscopy platform for studying beta-cell biology in vivo.</a> Science Reports. 9 (1), 8449(2019).</li>
<li>Kong, K., Guo, M., Liu, Y., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+animal+models+of+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Progress in animal models of pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Journal of Cancer. 11 (6), 1555-1567 (2020).</li>
<li>Bisht, S., Feldmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+modeling+pancreatic+cancer+and+novel+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+in+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Animal models for modeling pancreatic cancer and novel drug discovery.</a> Expert Opinion in Drug Discovery. 14 (2), 127-142 (2019).</li>
<li>Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mouse models of pancreatic cancer.</a> World Journal of Gastroenterology. 18 (12), 1286-1294 (2012).</li>
<li>Feig, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pancreas+cancer+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">The pancreas cancer microenvironment.</a> Clinical Cancer Research. 18 (16), 4266-4276 (2012).</li>
<li>Garcia, P. L., Miller, A. L., Yoon, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+xenograft+models+of+pancreatic+cancer%3A+overview+and+comparison+with+other+types+of+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Patient-derived xenograft models of pancreatic cancer: overview and comparison with other types of models.</a> Cancers (Basel). 12 (5), 1327(2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המתואר כאן מורכב מהדמיה תוך-וינטלית של הלבלב באמצעות חלון הדמיה תוך-וינטלי משולב בסיסי של הלבלב שונה מחלון הדמיה בבטן. בין הפרוטוקולים שתוארו לעיל, הצעד הקריטי הראשון הוא השתלת חלון הדמיית הלבלב התוך-וינטלי בעכבר. ליישום הדבק בחלון, חשוב להחיל את הדבק בין שולי החלון לבין זכוכית הכיסוי, אך לא על רקמת הלבלב, שכן הוא עשוי להפריע באופן משמעותי להדמיה תוך-וינטלית. לא רק הדבק עצמו בין הזכוכית לרקמה, אלא גם חלקיקי אבק מן החוץ עלול לגרום לפיזור אור במהלך ההדמיה אם הדבק מוחל ישירות על הרקמה. בנוסף, היישום של הדבק עשוי ל...

הלבלב הוא איבר בטן עם תפקוד אקסוקריני במערכת העיכול ותפקוד אנדוקריני של הפרשת הורמונים למחזור הדם. הדמיה תאית ברזולוציה גבוהה של הלבלב יכולה לחשוף את הפתופיזיולוגיה של מחלות שונות הקשורות ללבלב, כולל דלקת הלבלב, סרטן הלבלב, סוכרת1. כלי הדמיה אבחוניים קונבנציונליים כגון טומוגרפיה ממוחשבת, הדמיה ברזולוציה מגנטית ואולטרה סאונוגרפיה זמינים באופן נרחב בתחום הקליני1,2. עם זאת, שיטות הדמיה אלה מוגבלות להדמיה של שינויים מבניים או אנטומיים בלבד, בעוד שלא ניתן לקבוע שינויים ברמה התאית או המולקולרית. בהתחשב בכך שינויים מולקולריים בסוכרת או בסרטן הלבלב בבני אדם יכולים ליזום יותר מ -10 שנים לפני האבחון3,4, גילוי מחלות לבלב מהמעבר המולקולרי שלהם במהלך התקופה הסמויה יש פוטנציאל לספק אבחנה מוקדמת והתערבות בזמן. לכן, הדמיה שתתגבר על מגבלות הרזולוציה ותספק תובנות חשובות על הפונקציה תזכה לתשומת לב להפליא על ידי מתן אבחון מוקדם של סרטן הלבלב או זיהוי מתקדם של שינוי האיים במהלך התקדמות הסוכרת5.
בפרט עם האיים, הדמיה גרעינית, הדמיית ביולומינציה וטומוגרפיה קוהרנטית אופטית הוצעו בטכניקות הדמיה לא פולשניות של האי6. עם זאת, הרזולוציה של שיטות אלה נמוכה באופן משמעותי, עם ערכים אופייניים הנעים בין כמה עשרות למאות מיקרומטרים, המציע יכולת מוגבלת לזהות שינויים ברמה התאית באיים. מצד שני, מחקרים קודמים ברזולוציה גבוהה של איים בוצעו תחת ex vivo7,8 (למשל, חיתוך או עיכול של הלבלב), לא פיזיולוגי9 (למשל, חיצוניות של הלבלב), ותנאים הטרוטופסיים10,11,12 (למשל, השתלה מתחת לקפסולת הכליה, בתוך הכבד, ובתא השמאלי של העין), אשר מגביל את הפרשנות שלהם ואת ההשלכות הקליניות. אם ניתן להקים במודלפיזיולוגי ואורתוטופי של הדמיה ברזולוציה גבוהה, זו תהיה פלטפורמה קריטית לחקירת איי הלבלב.
הדמיה תוך-וינטלית, החושפת את הפתופיזיולוגיה ברמת רזולוציה מיקרוסקופית בחיה חיה, קיבלה לאחרונה תשומת לב רבה13. מתוך שיטות ההדמיה in vivo, התפתחות של חלון הדמיהבטן 14, אשר משתיל חלון לתוך הבטן של עכבר, אפשר גילוי של ממצאים חדשניים (כלומר, שלב טרום micrometastasis של גרורות כבד מוקדם15 ומנגנון של תחזוקת תאי גזע אפיתל המעי16). למרות שחלון הדמיית הבטן מספק תוצאות חשובות, היישומים של חלון זה עבור הלבלב וכתוצאה מכך מחקר הדמיה תוך-ויאלית המבוסס על מחלות הקשורות ללבלב, לא נחקרו בהרחבה.
שלא כמו מאפייני האיבר המוצק המוגדרים היטב של הלבלב האנושי, הלבלב של עכבר הוא מבנה רקמות רכות מופץ בצורה מפוזרת17. לכן, הוא מושפע ללא הרף על ידי תנועות פיזיולוגיות כולל פרייסטליזה ונשימה. מחקר קודם על יישום חלון הדמיה בטן עבור הלבלב הראה כי נדודים התרחשו עקב תנועה-חפצים הנגרמים על ידי תנועות מעיים18. טשטוש חמור נצפה בתמונה הממוצעת המתקבלת, אשר עכב את ההדמיה והזיהוי של המבנים microscale.
להלן, אנו מתארים את השימוש בחלון הדמיה תוך-ויטלי משולב של הלבלב בשילוב עם מיקרוסקופיה תוך-ויאלית19,20 כדי לחקור את אירועי רמת התא האורך במחלות המערבות את הלבלב. בנוסף לתיאור מפורט של המתודולוגיה במחקר הקודם18, היישום המורחב של חלון הדמיית הלבלב למחלות שונות הקשורות ללבלב יטופל במאמר זה. בפרוטוקול זה, מערכת מיקרוסקופיה קונפוקלית לסרוק לייזר בקצב וידאו מותאם אישית שימשה כמערכת מיקרוסקופיה תוך-ויאלית. ארבעה מודולי לייזר (אורכי גל ב-405, 488, 561 ו-640 ננומטר) נוצלו כמקור עירור, וארבעה ערוצים של אותות פליטה זוהו על ידי צינורות פוטומולטיפלייר (PMT) באמצעות מסנני פסים (BPF1: FF01-442/46; BPF2: FF02-525/50; BPF3: FF01-600/37; BPF4: FF01-685/40). סריקת לייזר כללה מראה מצולעת מסתובבת (ציר X) ומראה סריקת גלבנומטר (ציר Y) שאפשרה את סריקת קצב הווידאו (30 פריימים לשנייה). מידע מפורט על מיקרוסקופיה תוך-וינטלית תואר במחקרים הקודמים10,18,19,20,21,22,23.
במחקר האי הקודם שלנו18, צילמנו בהצלחה ובייצוב את האיים בעכברים חיים באמצעות מודל עכבר מהונדס (MIP-GFP)24 שבו האיים תויגו עם GFP. השיטה אפשרה תצוגה חזותית ברזולוציה גבוהה של השינויים באיים על פני תקופה של שבוע אחד. זה גם הקל הדמיה של אותם איים עד 3 שבועות, אשר מציע את ההיתכנות של מחקרים ארוכי טווח של איי הלבלב עבור מעקב פונקציונלי או ניטור במהלך הפתוגנזה של סוכרת18. יתר על כן, פיתחנו מודל סרטן לבלב אורתופופי שבו תאים סרטניים לבלב פלואורסצנטי (PANC-1 NucLight אדום)25 הושתלו ישירות לתוך הלבלב של העכבר. עם היישום של חלון הדמיה תוך-וינטלית הלבלב, מודל זה יכול לשמש כפלטפורמה לחקירת הפתופיזיולוגיה התאית והמולקולרית במיקרו-סביבה הגידולית של סרטן הלבלב ולניטור טיפולי של מועמדים חדשים לתרופה.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 Succinimidyl Esters (אסטרי NHS)</td><td>Invitrogen</td><td>A20006</td><td>בדיקה פלואורסצנטית למצומד עם נוגדן</td></tr><tr><td>BALB/C עירום</td><td>OrientBio</td><td>BALB/C עירום</td><td></td></tr><tr><td>BD צינורות פוליאתילן תוך-רפואיים</td><td>BD Biosciences</td><td>427401</td><td>קטטר PE10 לחיבור עם מחט</td></tr><tr><td>C57BL/6N</td><td>OrientBio</td><td>C57BL/6N</td><td>C57BL/6N</td></tr><tr><td>משקפי כיסוי עגולים</td><td>Marienfeld</td><td>0111520</td><td>כיסוי זכוכית לחלון הדמיה של הלבלב</td></tr><tr><td>FITC Dextran 2MDa</td><td>Merck (לשעבר סיגמא אולדריץ')</td> <td>FD200S</td><td>לזיהוי כלי</td></tr><tr><td>דם IMARIS 8.1</td><td>Bitplane</td><td>IMARIS</td><td>עיבוד תמונה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופיה תוך-חיונית</td><td>IVIM טק</td><td>IVM-C</td><td>מיקרוסקופיה תוך-חיונית</td></tr><tr><td>IRIS מספריים</td><td>JEUNGDO ביוגרפיה & PLANT CO, LTD</td><td>S-1107-10</td><td>ניתן להחליף מוצר זה במוצר של חברה אחרת</td></tr><tr><td>Loctite 401</td><td>Henkel</td><td>401</td><td>N-butyl cyanoacrylate</td></tr><tr><td>glue מחזיק מיקרו מחט</td><td>JEUNGDO BIO & צמח ושות', בע"מ</td><td>H-1126-10</td><td>ניתן להחליף מוצר זה במוצר של חברה אחרת</td></tr><tr><td>מיקרו רקטור</td><td>JEUNGDO BIO & PLANT CO,</td><td>LTD 17004-03</td><td>ניתן להחליף מוצר זה במוצר של חברה אחרת</td></tr><tr><td>Microforceps</td><td>JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD</td><td>F-1034</td><td>ניתן להחליף מוצר זה במוצר של חברה אחרת</td></tr><tr><td>MIP-GFP</td><td>מעבדת ג'קסון</td><td>006864</td><td>B6. Cg-TG (Ins1-EGFP) 1Hara /</td></tr><tr><td>J ניילון 4-0</td><td>AILEE</td><td>NB434</td><td>תפר לא נספג</td></tr><tr><td>Omnican N 100 30G</td><td>B BRAUN</td> FT9172220S <td></td><td>לצנתר כלי דם, השתמש רק בחלק המחט</td></tr><tr><td>PANC-1 NucLightRed</td><td>בהתאמה אישית</td><td>מיוצר בהתאמה אישית במעבדה</td><td></td></tr><tr><td>חלון הדמיית לבלב</td><td>Geumto</td><td>Engineering הזמנה מותאמת אישית</td><td>חלון הדמיית לבלב - הזמנה מותאמת אישית</td></tr><tr><td>Physiosuite</td><td>Kent Scientific</td><td>PS-02</td><td>בקר טמפרטורה הומותרמי</td></tr><tr><td>מטוהר NA / LE חולדה נגד עכבר CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553708</td><td>נוגדן לתיוג כלי in vivo</td></tr><tr><td>מלקחיים טבעת</td><td>JEUNGDO BIO & PLANT CO, LTD</td><td>F-1090-3</td><td>ניתן להחליף מוצר זה במוצר של חברה אחרת</td></tr><tr><td>Rompun</td><td>Bayer</td><td>Rompun</td><td>חומר הרדמה</td></tr><tr><td>TMR Dextran 65-85kDa</td><td>Merck (לשעבר סיגמא אולדריץ')</td> <td>T1162</td><td>לזיהוי כלי</td></tr><tr><td>מחזיק חלון</td><td>Geumto Engineering</td><td>הזמנה מותאמת אישית</td><td>מחזיק חלון - הזמנה מותאמת אישית</td></tr><tr><td>Zoletil</td><td>Virbac</td><td>Zoletil 100</td><td>חומר הרדמה</td></tr></tbody></table>

הדמיה מיוצבת של אורך ב-vivo ברמה התאית של הלבלב במודל מורין עם חלון הדמיה תוך-וינטלית של הלבלב

Stabilized Longitudinal In Vivo Cellular-Level Visualization of the Pancreas in a Murine Model with a Pancreatic Intravital Imaging Window

הדמיה ישירה ברזולוציה תאית של הלבלב במודל של בעלי חיים קטנים וחיים הייתה מאתגרת מבחינה טכנית. מחקר הדמיה תוך-וינטלי שנערך לאחרונה, עם חלון הדמיה בבטן, איפשר הדמיה של הדינמיקה התאית באיברי הבטן ב- vivo. עם זאת, בשל הארכיטקטורה הרכה דמוית גיליון של לבלב העכבר שיכול להיות מושפע בקלות על ידי תנועה פיזיולוגית (למשל, פריסטלזיס ונשימה), היה קשה לבצע אורך מיוצב בהדמיית vivo במשך מספר שבועות ברמה התאית כדי לזהות, לעקוב, לכמת איים או תאים סרטניים בלבלב העכבר. כאן, אנו מתארים שיטה להשתלת בסיס תומך חדשני, חלון הדמיה תוך-ויטלי משולב של הלבלב, שיכול להפריד את הלבלב מהמעי להדמיה תוך-וינטלית של הלבלב. הדמיית vivo אורך עם חלון ההדמיה מאפשרת הדמיה יציבה, המאפשר מעקב אחר איים על פני תקופה של 3 שבועות והדמיה תלת ממדית ברזולוציה גבוהה של המיקרו- מבנה, כפי שניתן לראות כאן במודל סרטן הלבלב האורתופופי. בשיטה שלנו, מחקרי הדמיה תוך-וינטליים נוספים יכולים לברוח את הפתופיזיולוגיה של מחלות שונות המערבות את הלבלב ברמה התאית.

מיקרוסקופיה תוך-וינטלית בשילוב עם חלון ההדמיה התוך-ויטלי המשולב בבסיס הלבלב מאפשר הדמיה של רמת התא האורך של הלבלב בעכבר. פרוטוקול זה עם חלון ההדמיה התוך-וינטלי של הלבלב מספק יציבות רקמות לטווח ארוך המאפשרת רכישת הדמיה ברזולוציה גבוהה כדי לעקוב אחר איים בודדים עד 3 שבועות. כתוצאה מכך, ניתן להשיג הדמיית פסיפס לשדה ראייה מורחב, שחזור תלת מימדי (תלת-ממדי) של הדמיית z-stack ומעקב אורך של אותה תנוחה. בנוסף, המיקרוסקופיה התוך-וינטלית שלנו מספקת ארבעה ערוצים (405, 488, 561 ו- 647 ננומטר) של רכישה, המאפשרת הדמיה בו זמנית של תאים ...

In vivo הדמיה ברזולוציה גבוהה של הלבלב היה קל עם חלון הדמיה תוך וינטלית הלבלב.

הדמיה מיוצבת של אורך ב-Vivo ברמה התאית של הלבלב במודל מורין עם חלון הדמיה תוך-וינטלית של הלבלב

Direct in vivo cellular-resolution imaging of the pancreas in a live small animal model has been technically challenging. A recent intravital imaging ...

פרוטוקול זה מתאר רמה תאית מייצבת וחוזרת על הנשימה בהדמיית ויוו של הלבלב עם חלון הדמיה תוך-וינטלית חדשנית בלבלב. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לבצע הדמיה תלת ממדית ללא תנועה עם רזולוציה עד לרמה התאית במשך שלושה שבועות בלבלב של עכבר חי. התחל על ידי הכנת הפלטפורמה הכירורגית וחיטוי המשטחים עם 70%אתנול.לאחר נשימה, השתמש בבדיקה רקטלית עם כרית חימום הנשלטת על ידי הומיאותרמיה כדי לפקח על טמפרטורת הגוף. הסר שיער מהאגף השמאלי של העכבר ולהחיל אלכוהול ויוד לחלופין, מסתובב מאתר החתכים אל המשטח החיצוני, לעולם לא חוזר לאתר החתירה, ומסתיים ביוד. לאחר מכן, לעשות 1.5 ס"מ חתכוך על האגף השמאלי של העכבר, לנתח את העור ואת השריר.השתמש בתבל שחור או ניילון 4-0 כדי לבצע תיל מחרוזת ארנק בשולי החתיכה. משוך את הטחול בזהירות עם מלקחיים טבעת ולזהות את הלבלב. הצבת החלון על אגף העכבר, להעביר את הטחול ואת הלבלב דרך המרחב הפתוח של החלון.לאחר מכן, הניחו בעדינות את הלבלב על צלחת חלון ההדמיה תוך הנחת הטחול על המרחב הפתוח של החלון. הזריקו פאנק-1 נוקליט אדום ישירות לתוך הלבלב. השתמש מחט קטטר 31-מד כדי להחיל טיפות של דבק ציאנואקרילט n-Butyl לשולי חלון ההדמיה, הבטחת כמות מינימלית של דבק מוחל.יש למרוח בעדינות זכוכית כיסוי עגולה 12 מ"מ על שולי חלון ההדמיה. לאחר מכן, החזק את לולאת התפר כך שתתאים לחריץ לרוחב של החלון וקשור אותו שלוש פעמים. לבסוף, כדי למנוע את ההפרעה של תפרים הדוקים אלה כאשר העכברים ערים, לחתוך את האתר הפרוקסימלי המרבי של העניבה.התחל על ידי הפעלת המיקרוסקופ התוך-וינטלי, כולל כוח הלייזר. כדי להכניס קטטר וסקולרי, להפעיל לחץ על הצד הפרוקסימלי של הזנב עם האינדקס והאצבע השלישית. במידת הצורך לחמם את הזנב עם מנורה.לחטא את וריד הזנב עם תרסיס אתנול 70%, ולאחר מכן להכניס קטטר 30-מד לתוך הווריד זנב לרוחב לדמיין את regurgitation של דם בצינור PE-10. יש למרוח סרט משי על הקטטר כדי לייצב אותו. הזרקת FITC dextran ו- TMR dextran, או בדיקות פלואורסצנטיות אחרות בהתאם לצורך, על פי השילוב של בדיקות פלואורסצנטיות.הכנס בדיקה רקטלית כדי לשלוט באופן אוטומטי בטמפרטורת הגוף באמצעות מערכת כרית חימום הומיאותרמית. לאחר מכן, הכנס את חלון הדמיית הלבלב שהוכן במהלך ההתקנה של מיקרוסקופיה תוך-וינטלית למחזיק החלון. העבר את העכבר מהפלטפורמה הכירורגית לשלב ההדמיה.כדי לבצע הדמיה תוך-ויאלית, התחל בהדמיית הלבלב בהגדלה נמוכה, כגון ארבע פעמים, כדי לסרוק את כל התצוגה של הלבלב בחלון הדמיית הלבלב. לאחר קביעת אזור העניין, עבור לעדשת יעד הגדלה גבוהה יותר, כמו 20 פעמים או 40 פעמים, כדי לבצע הדמיה ברמה התאית ברזולוציה רוחבית וצירית כ-0.5 מיקרומטר ו-3 מיקרומטרים בהתאמה. בצע הדמיה של Z-stack או זמן-לשגות כדי לבחון את המבנה התלת-ממדי או את הדינמיקה ברמה התאית, כגון העברת תאים.מיקרוסקופיה תוך-וינטלית בשילוב עם חלון ההדמיה התוך-וינטלי של הלבלב מספקת יציבות רקמות לטווח ארוך המאפשרת רכישת הדמיה ברזולוציה גבוהה למעקב אחר איים בודדים למשך עד שלושה שבועות. החלון מושתל בעכבר C57 שחור 6 N עם נוגדן נגד CD31 מוזרק תוך ורידי, מצומד עם פלואורופור Alexa 647, הקל על הדמיה רחבת היקף והדמיה תלת-ממדית מוגדלת של הלבלב. תאי Acinar זוהו בתמונות הממוצעות של רקמת הלבלב בכלי vasculature הסמוך, הדמו באמצעות autofluorescence ו נוגדן אנטי CD31 בהתאמה.באמצעות שיטת הדמיית הפסיפס, המשלבת תצוגה רחבת שדה עם הדמיה ברזולוציה גבוהה, כ-40 עד 50 איונים עם כלי ההשמדה הסמוך הוצגו באופן חזותי בעכבר MIP-GFP. מחקר קודם הראה כי איונים ניתן לעקוב עד שלושה שבועות באמצעות שיטת הדמיה יציבה זו. כדי לדמיין תאים סרטניים, תאים אדומים נוקליט PANC-1 הושתלו ישירות לתוך לבלב העכבר במהלך הניתוח וכלי הדם הסמוכים היו מוכתמים עם אנטי CD31 מצומד עם Alexa 647.באמצעות פרוטוקול זה, נוצרו תמונות רחבות של סרטן הלבלב. זה עזר לשייט את השוליים של הגידול, כמו גם להשיג תמונות 3D ברזולוציה גבוהה ברמת התא הבודד. השלב הקריטי ביותר בשיטה זו הוא ההשתלה המיומנת של חלון הדמיית הלבלב בעכבר.באמצעות שילובים אחרים של תאי עכבר פלואורסצנטיים, ובדיקות נוגדנים, ניתן לזהות אינטראקציה דינמית של תאים סמוכים עם איונים או תאים לבטל. שיטה זו יכולה להיות מיושמת באופן נרחב על ידי אלה החוקרים את השינוי של האי בתנאים פתופיזיולוגיים שונים וסביבות מיקרו של סרטן הלבלב במקום.

stabilized-longitudinal-vivo-cellular-level-visualization-pancreas

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

כאן, אנו מתארים שיטה לבידוד, תרבות ומניפולציה של לבלב העוברי של עכבר. זה מייצג...

מערכת ל<em&gt; Vivo לשעבר</em&gt; Culturing של לבלב עוברי

סרטון זה מדגים את ההליך להשתלת חלון הדמיה של הלבלב כדי להפריד את הלבלב מהמעיים לצורך הדמיה אורכית ברזולוציה גבוהה של מיקרו-מבנה הלבלב.

התקנת חלון הדמיה תוך-חיוני של הלבלב במודל עכבר: חלון הדמיה משולב של הלבלב לקיטוע זמן ב-Vivo Imaging של מיקרו-מבנה לבלב מורין

בסרטון זה, אנו מתארים הדמיה תוך-חיונית של לבלב עכבר דרך חלון מיוצב להדמיה ארוכת טווח של דינמיקה תאית.

הדמיה תוך-חיונית: שיטה לתצפית ברמה התאית על לבלב העכבר דרך חלון הדמיה מיוצב

מטרת הפרוטוקול היא לעקוב באופן רציף אחר הדינמיקה של תהליך הלבלב האנושי ועל הפונדקאי התורם לעומת תאי התורם. זה מושגת על ידי השתלת איונים אנושיים לתוך התא הקדמי של העין (ACE) של NOD. (Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4-Rag2-/-נמען העכבר ואחריו הדמיה חוזרת של 2 פוטין.

אורכי בהדמיית Vivo וכמת של השתלת אי הלבלב האנושי ותורם תאים מארחים בתא העין הקדמית

כאן מוצגת גישה להדמיה תוך-ורידית ארוכת טווח באמצעות חלונות סיליקון שקופים אופטית, הניתנים להדבקה ישירות לרקמה/איבר המעניין ולעור. חלונות אלה זולים ורב-תכליתיים יותר מאחרים הנהוגים כיום בשטח, וההחדרה הכירורגית גורמת לדלקת מוגבלת ולמצוקה לבעלי החיים.

הדמיה תוך-ורידית אורכית דרך חלונות סיליקון שקופים

אנו מציגים פרוטוקול להשתלה כירורגית של חלון אופטי מיוצב להדמיה ברזולוציה תת-תאית של הלבלב המורין, המאפשר מחקרים סדרתיים ואורכיים של הלבלב הבריא והחולה.

חלון מיוצב להדמיה תוך חיונית של הלבלב המוריני

על ידי שילוב של-גולגולת דקה מלוטשת ומחוזקת (יציאות) גולגולתי חלון והזרקת גליובלסטומה (GBM) תא, אנו יכולים לצפות בייזום וצמיחה מתאים מוזרקים GBM במוח של עכבר חי longitudinally גליומה.

הדמית Glioma ייזום<em&gt; In Vivo</em&gt; דרך חלון גולגולתי מלוטש ומחוזק-גולגולת דקה

מודל של השתלת תומכן בעורק התרדמה עכבר מתואר. בהשוואה לשיטות אחרות דומות, הליך זה הוא מהיר מאוד, פשוט ונגיש, ומציע את האפשרות ללמוד בדרך נוחה תגובת קיר כלי דם לסטנטים משחררי תרופות שונים והמנגנונים המולקולריים של restenosis.

דגם Murine של השתלת תומכן בעורק הראשי לחקר restenosis

כאן, אנו מתארים גישת מיקרוסקופיה אופטית חצי פולשנית לאינדוקציה של קריש פוטו-טרומבוטי של רוז בנגל בקליפת המוח הסומטוסנסורית של עכבר in vivo.  ההיבטים הטכניים של הליך ההדמיה מתוארים מאינדוקציה של אירוע פוטוטרומבוטי ועד ליישום ואיסוף נתונים.

רוז בנגל Photothrombosis ידי דימות אופטי Confocal<em&gt; In vivo</em&gt;: דגם של שבץ כלי אחד

כתב יד זה מתאר הליך לעקוב אחר השיפוץ של cerebrovasculature במהלך הצטברות פלאק עמילואיד in vivo באמצעות שני פוטונים במיקרוסקופ אורך. הכנה הגולגולת דליל מאפשר הדמיה של צבעי ניאון כדי להעריך את התקדמות הנזק כלי דם במוח במודל של עכברים של מחלת אלצהיימר.

אֹרכִּי<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של Cerebrovasculature: רלוונטיות למחלות של מערכת העצבים המרכזית

למד הדמיה תוך-ויטלית יציבה של הלבלב ברמה התאית בעכברים באמצעות חלון הדמיה תוך-וינטלי חדשני. שיטה זו מאפשרת מעקב אחר איי לנגרהנס ותאי סרטן לאורך שלושה שבועות.

הדמיה מיוצבת של אורך ב-Vivo ברמה התאית של הלבלב במודל מורין עם חלון הדמיה תוך-וינטלית של הלבלב

גלה סרטונים נוספים