פיתוח רקמת לב אנושית מאורגנת תלת מימדית בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית

מחלות לב וכלי דם נשאר הגורם מספר אחת למוות ברחבי העולם. מודלים מסורתיים במבחנה מסתמכים על תרבות המונולאייר. עם זאת, הלב, במיוחד שריר הלב או שריר הלב, הוא מורכב anisotropy 3D שלה הרכב הסלולר.

לכן, זה קריטי כדי לשפר את המורכבות של הרכב הרקמה בתוך מודלים במבחנה כדי לחקות טוב יותר הן את המרכיבים הסלולר ואת המבנה של שריר הלב. כאן בעבודה זו, אנו מדגימים פרוטוקול לפיתוח רקמת לב אנושית בוגרת תלת מימדית שמקורה בתאי גזע בתוך מכשיר מיקרופלואידי חדשני. מכשיר זה משלב ערוץ רקמה ראשי תלת-ממדי עם מיקרופוסטים אליפטיים מולדים הגורמים למידות גבוהות של יישור של תאי הלב הסובבים את ההידרוגל.

הערוץ הראשי מוקף בערוצי מדיה עם יציאות הזרקה המאפשרות דיפוזיה תזונתית בכל הרקמה. בשל הטיפול הנדרש בטיפול בהתקנים microfluidic, ייצוג חזותי של פרוטוקול זה מועיל כראוי להקים רקמת לב 3D בתוך מכשיר microfluidic עם microposts מוטבע עבור יישור רקמות משופרת. כדי לנתק את פיברובלסט הלב האנושי, ראשית להוציא את הבקבוק מן האינקובטור.

שים בתוך ארון biosafety ולהתחיל לשאוף את התקשורת בילה מן הבקבוק. ואז לקחת שלושה MLs של PBS 1X לשטוף את הבקבוק. סגור את המכסה וסובב את הבקבוק כך שהחלק התחתון מצופה כראוי ב- PBS.

לשאוף את PBS. קח שלושה MLs של 37 מעלות טריפסין ולהוסיף לבקבוק. ואז להטות את הבקבוק ואת מערבולת כך התחתון מצופה לחלוטין.

ואז לשים באינקובטור במשך ארבע עד שש דקות. לנטרל את טריפסין עם FGM3 על ידי לקיחת שלושה MLs והוספת כי לבקבוק. פיפט הפתרון למעלה ולמטה כדי לעקור את כל התאים שנותרו בחלק האחורי של הבקבוק.

לאסוף את השעיית התא בצינור פלקון 15 ML. קח 10 מיקרוליטרים של השעיית התא ולוותר על המוציטופ לספור את התאים עם מיקרוסקופ. צנטריפוגה השעיית התא ב250 G במשך ארבע דקות.

לאחר צנטריפוגה, לשאוף את supernatant נזהר לא להפריע גלולה התא. Resuspend גלולת התא עם FGM3 טרי כדי להפוך הרצוי 75 מיליון תאים לכל השעיה ML. לשים מחדש את התאים, ולאחר מכן להגדיר את הצינור למטה עם כובע מצויד באופן רופף.

כדי לנתק את הקרדיומיוציטים, הוציאו את הצלחת מהחממה ושאבו את התקשורת. קח שישה MLs של PBS ולשטוף את הבארות, כך שיש ML אחד של PBS בכל באר. לשאוף את PBS, נזהר לא להפריע לתאים המחוברים לצלחת.

הוסף שישה MLs של טריפל אקספרס מחומם, כך שיש ML אחד בכל באר של צלחת שש היטב. דגירה התאים עם טריפל במשך 10 דקות. לאחר 10 דקות, לנטרל את trypLE עם שישה MLs של RPMI בתוספת B27 בתוספת אינסולין, כך שאתה מוסיף ML אחד של RMPI לכל באר.

השתמש אחד פיפטה ML כדי לאסוף את הפתרון ולפוצץ אותו על הגב של בארות כדי להבטיח את כל התאים הם הרים. לאסוף את השעיית התא בצינור פלקון 15 ML. צנטריפוגה הצינור ב300 G במשך שלוש דקות.

לאחר צנטריפוגה, לשאוף את התקשורת ואת trypLE. שלב זה חשוב לשטוף את הקרדיומיוציטים הרגישים. שלב זה מבטיח כי כל טריפל נעלם היווצרות רקמת לב 3D.

Resuspend גלולת התא בחמישה MLs של RPMI בתוספת B27 בתוספת אינסולין. השתמש פיפטה ML אחד פיפטה הפתרון למעלה ולמטה כדי להבטיח השעיית תא הומוגני. קח 10 מיקרוליטרים של השעיית התא לספירה עם המוציטרומטר.

צנטריפוגה התאים ב300 G במשך שלוש דקות. לשאוף את התקשורת לאחר צנטריפוגה בפעם השנייה. הוסף את הכמות המתאימה של RPMI בתוספת B27 בתוספת אינסולין כדי להשיג 75 מיליון תאים לכל השעיה ML, ולאחר מכן resuspend.

כדי להכין את פתרון הקולגן לאנקפסולציה, יש את כל ריאגנטים על קופסת קרח במכסה המנוע. ואז לקחת 75 מיקרוליטרים של קולגן המניות. הקולגן הוא צמיג מאוד, כל כך לאט ספיגה עם פיפטה, ואז לוותר על צינור microcentrifuge על קרח.

קח 13.85 מיקרוליטרים של RPMI ולהוסיף קולגן בצינור פלקון. ואז לקחת 10 microliters של פנול אדום ולהוסיף לתערובת על קרח resuspend. לבסוף, לקחת 1.15 microliters של NaOH נורמלי אחד ולהוסיף את ההשעיה כדי לנטרל.

ואז לקחת טיפ פיפטה 200 microliter ו resuspend ההשעיה. השלב הבא הוא אנקפסולציה של התאים בתוך metrogel קולגן. ואז לקחת aliquot של שמונה מיקרוליטרים של CMs ולהוסיף צינור פלקון טרי על קרח.

ואז לקחת שני microliters של CS ולהוסיף לתערובת תאים. תחדש את השעיית התא ותתפוס 5.6 מיקרוליטרים של השעיית התא ותכניס צינור פלקון טרי. ואז לתפוס את הקולגן שהכנת זה עתה, לקחת ארבעה מיקרוליטרים של הקולגן, ואז לקחת 2.4 מיקרוליטרים של metrogel.

פיפטה התערובת למעלה ולמטה כדי להבטיח הפצה הומוגנית של המתלה הידרוג'ל התא. לאחר הזרקת הג'ל מוכן, אתה יכול להכניס למכשירים. קח טיפ חדש ותתחדש.

קח את צלחת פטרי של התקנים, להכניס את הקצה ביציאת ההזרקה, לאט ובהתמדה להזריק. אתה תראה כמו ערוץ המכשיר מתמלא עם המתלה הידרוג'ל התא. לאחר מילוי היציאה השנייה, להפסיק את ההזרקה ולהסיר את הקצה.

לאחר ההזרקה, הופכים את המכשירים בפינצטה ומניחים בתוך צלחת הפטרי הגדולה יותר עם מים באינקובטור במשך תשע דקות. לאחר תשע דקות, מוציאים את המכשירים מהחממה והופכים זקוף, ואז מחזירים לאינקובטור לתשע דקות נוספות להשלמת פולמור הידרוג'ל. עכשיו הגיע הזמן להוסיף את המדיה.

לכן, קח RMPI פלוס B27 והכנס את הקצה ליציאת המדיה והתחל לדחוף באיטיות. לאחר מכן עשה זאת ביציאת המדיה הנגדית. ייתכן שתגלה שהמדיה אינה מזריקה, כך שתוכל לשים טיפת מדיה על גבי היציאה ולאחר מכן לקחת את פיפטה ולהשתמש בלחץ שלילי כדי למשוך את המדיה דרך מהצד השני.

אז אתה תראה כשהתקשורת תתחיל להימשך דרך הערוץ. לאחר הוספת המדיה לכל ערוצי התקשורת, המכשירים יוחזרו לחממה ב-37 מעלות. המכשיר המיקרופלואידי מוצג בפינה השמאלית העליונה.

ימים 1, 7 ו-14 של תרבות מוצגים בתמונה זו. לאחר 14 ימים של תרבות, התאים צריכים להתעבות לתוך מבנים מיושר מאוד היוצרים סביב microposts. עקבות של היום 14 מוצגים כאן ב C של התכווצות ספונטנית, כמו גם תמונות immunofluorescent של רקמות מוכתמות actin סמן לב מוכתם.

מה שצריך לראות הוא סיבי actin מיושר מאוד היוצרים לאחר 14 ימים בתרבות, כמו גם סרקומרים בוגרים מפוספסים מקבילים וצמתים פער מקומי. במהלך הליך זה, זה קריטי כדי לשמור על כל החומרים בטמפרטורות נמוכות על קרח במהלך הזרקת הידרוג'ל התא כדי למנוע פולמור מוקדם. המכשירים המיקרופלואידיים צריכים להיות מטופלים בזהירות, הן במהלך ייצור, הזרקה, ותרבות רקמות מורחבת.

זריקות התא צריך להיות תהליך קבוע כדי להבטיח את הערוץ כולו מילא תוך ביצוע מהיר כדי למנוע פולמור מוקדם או הידרוג'ל מתייבש לפני תוספת מדיה.