Name: RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: למד את פרוטוקול RIBO-seq לחיידקים לריצוף NGS, הכולל איסוף דגימות והכנת ספריות. שיטה זו ממפה מיקומי ריבוזומים על mRNA ומספקת נתונים מקיפים לניתוח ביואינפורמטי בתוך שבעה ימים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ALS רוצה להכיר בתמיכה הכספית של EMBO התקנה מענקים IG 3914, ו POIR. 04.04.00-00-3E9C/17-00 שבוצע במסגרת תוכנית TEAM הראשונה של הקרן למדע פולני במימון משותף של האיחוד האירופי תחת הקרן האירופית לפיתוח אזורי.

1. אוסף לדוגמה
<ol><li>הכינו תרבות חיידקים. אנו ממליצים על נפח תרבות של 100 מ"ל לכל מדגם.</li>
	<li>הכן ציוד ריאגנטים לאיסוף מדגם: שתי כפות מדידה לדגימה, סטרילי 0.45 מיקרומטר מעורב אסטרים תאית ממברנה (MCE) מסננים, 50 מ"ל צינורות סטריליים, חנקן נוזלי, 50 מ"ג / מ"ל כלוראמפניקול ב 70% (vol / vol) אתנול (אופציונלי). לנקב את המכסה של צינורות 50 מ"ל כדי לאפשר אידוי חנקן נוזלי ולמנוע פיצוץ של צינורות סגורים. מרוקנים כפות מדידה עם חומר ניקוי במעבדה ו-70% אתנול.</li>
	<li>מחממים מראש את ציוד הסינון ואת אחת הסקופולות לטמפרטורת הגדילה של תרבות החיידקים. הערה: אנו ממליצים על מנגנון סינון זכוכית עם משפך, בסיס פריט, בקבוקון משותף טחון ומהדק קפיץ Ø 47 מ"מ.</li>
	<li>לפני קציר מדגם, להוסיף chloramphenicol לתוך תרבות החיידקים לריכוז הסופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל דגירה 1 דקה (אופציונלי).</li>
	<li>יוצקים חנקן נוזלי לתוך צינור סטרילי 50 מ"ל ומניחים את הסקופולה השנייה בתוך הצינור כדי להתקרר. זהירות! חנקן נוזלי יכול לגרום מיכלים סגורים להתפוצץ עקב שינוי הלחץ על אידוי. כדי למנוע זאת, יש צורך ליצור כמה חורים במכסה של צינורות 50 מ"ל כדי לאפשר אידוי חנקן נוזלי.</li>
	<li>לאסוף תאים על ידי סינון. הפסק לסנן כאשר המדיום עבר דרך הממברנה, אך אל תאפשר למסנן להתייבש לחלוטין.</li>
	<li>לאסוף כדורי חיידקים על ידי גירוד מהיר את התאים של דיסק המסנן באמצעות scoopula מראש. מיד למקם את הסקופולה כולה עם התאים שנקטפו בצינור 50 מ"ל מלא חנקן נוזלי. גלולה שנקטפו צריך להיות מכוסה לחלוטין חנקן נוזלי.</li>
	<li>תן גלולה להקפיא ביסודיות לעקור תאים קפואים באמצעות scoopula השני מקורר בעבר. סגור את המכסה המנוקב והעבר את הצינור ל- -80°C. נקודת עצירה הערה: יש לחטא כפות מדידה לאחר כל דגימת קציר.</li>
</ol>2. תמוגה תאית
<ol><li>הכן 0.1 M GMP-PNP ב 10 mM Tris pH 8, DNase I ו 1.5 צינורות תגובה מ"ל עבור lysates ולשמור אותם על הקרח. מצננים את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הכן מאגר תמוגה (20 mM TRIS pH 7.6, 10 mM MgAcet, 150 mM KAcet, 0.4% טריטון X-100, 6 מ"מ β-מרקפתנול, 5 מ"מ CaCl2 ו- 1 מ"מ כלוראמפניקול אופציונלי). Aliquot 500 μL של מאגר תמוגה לכל מדגם לתוך צינורות תגובה 1.5 מ"ל ומניחים אותם על קרח.</li>
	<li>לסלק מרגמות ועלי עם חומר ניקוי במעבדה ו-70% אתנול, ולייבש אותם. מצננים מרגמה ועלי על ידי שפיכת חנקן נוזלי לתוך המרגמה.</li>
	<li>מעבירים גלולה קפואה למרגמה המצוננת מראש וטוחנים אותה לאבקה. עם מרית, מוסיפים כ 1 נפח של תחמוצת אלומיניום ולהמשיך שחיקה. שמור על מרגמה, עלה ותאים להתקרר על ידי שפיכת חנקן נוזלי בעת הצורך, לא נותנים את התוכן של מרגמה להפשיר.</li>
	<li>רגע לפני השימוש במאגר תמוגה, להוסיף GMP-PNP ו DNase אני לתוך aliquot מאגר תמוגה לריכוז הסופי של 2 mM ו 100 U /mL בהתאמה. מעבירים את הפתרון למרגמה עם תאים ותחמוצת אלומיניום וממשיכים לטחון. תן את הפשרה lysate לאט תוך שחיקה ולהעביר את התערובת לתוך צינור תגובת 1.5 מ"ל מקורר מראש ומניחים מיד על קרח.</li>
	<li>צנטריפוגה lysates ב 20 000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. העבר supernatants לתוך חדש, מראש מקורר 1,5 מ"ל צינורות תגובה ולשמור אותם על הקרח.</li>
	<li>למדוד את ריכוז RNA בכל מדגם עם NanoDrop. השתמש 1:10 דילול של דגימות ו 1:10 דילול של מאגר תמוגה במים ללא גרעין כמו ריק. הערה: שים לב כי כלוראמפניקול מראה ספיגה משמעותית ב 260 ננומטר.</li>
	<li>מחלקים כל lysate לשתי מנות: אחד עבור RIBO-seq (0.5 - 1 מ"ג של RNA) והשני עבור RNA-seq (השאר).</li>
	<li>נקה את הדגימות עבור RNA-seq באמצעות ערכת ניקוי RNA זמינה מסחרית על פי פרוטוקול היצרן. הערה: אנו ממליצים להשתמש בערכת Zymo RNA נקייה וריכוז -25 (ראה טבלת חומרים). כמו כן, אנו ממליצים להוסיף 4.5 כמויות של אתנול (בהשוואה לנפח המדגם) לתערובת של מדגם ומאגר כריכה עבור עקבות ריבוזומליות ו- mRNA מקוטע, על מנת להגביר את יעילות הטיהור של שברי RNA קצרים.</li>
	<li>אחסן את הדגימות המיועדות ל- RNA-seq ב- -80 °C (60 °F). ההליך עבור RNA-seq ימשיך משלב 5.</li>
</ol>3. MNase עיכול של דגימות עבור RIBO-seq
<ol><li>כדי 1 מ"ג של RNA להוסיף 3.8 μL של 187.5 U / μL MNase ב 10 מ"מ Tris pH 8 ומעלה אותו עם מאגר תמוגה לנפח הכולל של 500 μL.</li>
	<li>דגירה ב 25 °C (60 °F), 300 סל"ד, במשך 45 דקות תרמומיקסר.</li>
	<li>נקה את הדגימות באמצעות ערכת ניקוי RNA זמינה מסחרית (כמו בשלב 2.9).</li>
	<li>אחסן את הדגימות עבור RIBO-seq ב- -80 °C (נקודת עצירה) או המשך לבחירת גודל.</li>
</ol>4. אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילמיד (PAGE) ומבחר גודל של דגימות עבור RIBO-seq
<ol><li>הכינו ג'ל פוליאקרילמיד-TBE 15% עם 8 M אוריאה והניחו אותו במיכל עם חיץ TBE. הפעלה מוקדמת למשך 10 דקות לפחות במתח קבוע של 200 וולט.</li>
	<li>מערבבים דגימות עם מאגר מדגם TBE-Urea, denature ב 95 מעלות צלזיוס במשך דקה אחת ומניחים אותם מיד על קרח.</li>
	<li>לשטוף את אוריאה על ידי הזרקת חיץ TBE לתוך בארות ג'ל באמצעות מזרק. לטעון את הדגימות משאיר רווח אחד היטב ביניהם להפריד כל מדגם ולמנוע זיהום צולב. השתמש 29 nt אוליגונוקלאוטידים ותערובת של 26 nt ו 32 nt אוליגונוקלאוטידים כסמנים. הפעל אלקטרופורזה במתח קבוע של 180 V.</li>
	<li>הכן חיץ סטרילי עבור דגירה לילה (5 מ"מ EDTA, 10 מ"מ NaOAc pH 5).</li>
	<li>לאחר אלקטרופורזה, הכתימו את הג'ל באמבט זהב SYBR במשך כ-2-3 דקות ושטוף את הג'ל במים נטולי גרעין.</li>
	<li>בלו שברי ג'ל בין 26 ל 32 nt עם מחטים סטריליות או סכיני גילוח ומניחים את שברי הג'ל בצינורות נפרדים 1.5 מ"ל עבור כל מדגם. לשנות את המחט או את סכין הגילוח בין הדגימות.</li>
	<li>הוסף 200 μL של מאגר הדגירה לילה לכל צינור תגובה.</li>
	<li>דגירה הדגימות ב 10 °C (60 °F), 1000 סל"ד לילה תרמומיקסר.</li>
	<li>למחרת, לנקות את הדגימות כמו בשלב 2.9. תטביע את העקבות ב-80 μL של מים נטולי גרעין.</li>
	<li>אחסן את הדגימות ב- -80 °C (60 °F). ההליך עבור RIBO-seq יימשך משלב 7.</li>
</ol>5. טיהור של mRNA חיידקי על ידי דלדול rRNA מדגימות עבור RNA-seq
<ol><li>הסר rRNA מדגימות עם ערכת טיהור mRNA חיידקי (למשל, Invitrogen MICROBExpress). פעל בהתאם לפרוטוקול היצרן.</li>
	<li>נקה את הדגימות כמו בשלב 2.9. ללטף את mRNA ב 50 μL של מים ללא גרעין.</li>
	<li>אחסן את הדגימות עבור RNA-seq ב -80 °C (נקודת עצירה) או להמשיך פיצול אלקליין.</li>
</ol>6. פיצול אלקליין של דגימות עבור RNA-seq
<ol><li>הכן מאגר הידרוליזה אלקליין (לערבב 220 μL של 0.1 M NaHCO3, 30 μL של 0.1 MNa 2CO3 ו μL של 0.5 M EDTA). מערבבים 1 נפח (50 μL) של מאגר אלקליין עם 1 נפח (50 μL) של המדגם דגירה ב 95 °C (70 °F) במשך 25 דקות.</li>
	<li>הוסף 5 μL של 3 M NaOAc pH 5.5 כדי לעצור את התגובה.</li>
	<li>לנקות את הדגימות כמו בשלב 2.9 ו elute את הדגימות ב 80 μL של מים ללא גרעין.</li>
	<li>נקודת עצירה אפשרית: לאחסן דגימות RNA-seq ב -80 °C (69 °F). עם זאת, אנו ממליצים ללכת ישירות לשלב 7 על מנת למנוע הקפאה והפשרה מיותרים.</li>
</ol>7. דפוספורילציה וזרחון של דגימות הן עבור RNA והן עבור RIBO-seq
<ol><li>הוסף 10 μL של 10x מאגר תגובה PNK ו 5 μL T4 PNK לכל מדגם. דגירה ב 37 °C (60 °F) במשך 1.5 שעה על מנת dephosphorylate את קצוות 3 '.</li>
	<li>הוסף 3 μL של 1 מ"מ ATP ודגר ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1 שעה על מנת לזרח את הקצוות 5 '.</li>
	<li>לנקות את הדגימות כמו בשלב 2.9, elute ב 30 μL מים ללא גרעין.</li>
	<li>אחסן את הדגימות ב- -80 °C (60 °F).</li>
</ol>8. הכנת ספריה באמצעות NEBNext מולטיפלקס קטן ספריית RNA הכנה להגדיר עבור Illumina
<ol><li>הכינו 100-1000 ng של RNA קלט (שברי mRNA שהושגו וטביעות רגל ריבוזומליות) ב 6 μL של מים ללא גרעין ולהוסיף 1 μL של 3 ' מתאם SR. דגירה בהתאם לפרוטוקול היצרן.</li>
	<li>הוסף 10 μL של 3' חיץ תגובת קשירה (2X) ו 3 μL של 3' אנזים קשירה לערבב דגירה ב 37 °C (69 °F) במשך 2.5 שעה, במקום 1 שעה ב 25 °C (69 °F) כפי שפרוטוקול היצרן מציין.</li>
	<li>הכלא את פריימר שעתוק הפוך על פי פרוטוקול היצרן עם תוכנית שונה: 5 דקות ב 75 °C (75 °F), 30 דקות ב 37 °C (69 °F) ולהחזיק ב 4 °C (69 °F).</li>
	<li>ליגייט מתאם 5 'SR. בצע את פרוטוקול היצרן עם שינוי אחד: לבצע את הדגירה ב 37 °C (69 °F) במשך 2.5 שעות, במקום 1 שעה ב 25 °C (69 °F).</li>
	<li>בצע תמלול הפוך בהתאם לפרוטוקול היצרן.</li>
	<li>נקודת עצירה אפשרית: דגירה הדגימות המכילות cDNAs מסונתז ב 70 °C (70 °F) במשך 15 דקות כדי להשבית את התמלול ההפוך ולאחסן אותם ב -80 °C (69 °F). עם זאת, אנו ממליצים להמשיך ישירות לשלבים הבאים כדי למנוע הקפאה והפשרה מיותרת של הדגימות.</li>
	<li>אחסן מחצית מכל ספריית cDNA ב- -80 °C (60 °F) כגיבוי.</li>
	<li>בצע הגברה PCR בהתאם לפרוטוקול היצרן. השתמש במחצית מתערובת התגובה. אחסן את הספריות שהושגו ב- -80 °C (60 °F).</li>
</ol>9. בחירת גודל של ספריות cDNA באמצעות PAGE
<ol><li>הכינו 6% ג'ל פוליאקרילמיד-TBE והניחו אותו במיכל עם חיץ TBE. הפעלה מוקדמת למשך 10 דקות לפחות במתח קבוע של 200 וולט.</li>
	<li>מערבבים את הדגימות עם צבע טעינת ג'ל, כחול (6X) וטוען אותם על הג'ל. השתמש בטעינה מהירה pBR322 DNA-MspI Digest כסולם. בהתחלה, להפעיל אלקטרופורזה במתח קבוע של 120 V כדי לאפשר DNA להיכנס הג'ל ולאחר מכן לשנות את המתח ל 180 V.</li>
	<li>כאשר האלקטרופורזה מסתיימת, הכתימו את הג'ל באמבט זהב SYBR במשך כ-2-3 דקות ושטוף את הג'ל במים נטולי גרעין.</li>
	<li>Excise שברי ג'ל המכילים את הספריות. עבור דגימות RNA-seq בלו בין 135-180 nt ועבור RIBO-seq בין 135-170 nt. השתמשו במחט סטרילית או בסכין גילוח והניחו את שברי הג'ל שנכרתו בצינורות תגובה נפרדים של 1.5 מ"ל. זכור לשנות את המחט או סכין הגילוח בין הדגימות. הערה: המתאמים וברקוד מ NEBNext מולטיפלקס קטן ספריית RNA ערכת הכנה עבור Illumina יש 119 nt בסך הכל אשר קובע את חתך כריתה התחתונה.</li>
	<li>הוסיפו 100 μL של מים נטולי גרעין לכל שבר ג'ל שנכרת.</li>
	<li>דגירה שברי ג'ל ב 10 °C (60 °F), 450 סל"ד לילה תרמומיקסר.</li>
	<li>לנקות ולרכז את ספריות cDNA עם ערכת ניקוי DNA מסחרית על פי פרוטוקול היצרן. הערה: אנו ממליצים להשתמש בערכת Zymo DNA נקייה וריכוז -5 (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>אחסן ספריות cDNA מטוהרות ב- -80 °C (60 °F).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

האתגר הטכני העיקרי של פרופיל הריבוזום הוא הצורך לעכב במהירות את התרגום על מנת ללכוד תמונת מצב של ריבוזומים על mRNAs במצב פיזיולוגי מסוים של עניין. כדי להשיג זאת, מעכבי תרגום, קציר מהיר והקפאת פלאש בחנקן נוזלי משמשים בדרך כלל. החלת אנטיביוטיקה היא אופציונלית שכן הם יכולים לגרום חפצים. כלוראמפניקול הוא סם נפוץ לעצור ריבוזומים מאריכים ב RIBO-seq חיידקי. עם זאת, זה לא מונע חניכה, וכתוצאה מכך הצטברות של ריבוזומים על שישה codons במורד הזרם של אתר ייזום תרגום14. יתר על כן, היכולת שלה לעכב את תגובת peptid...

טכניקת פרופיל הריבוזום (RIBO-seq) פותחה במעבדתו של ג'ונתן וייסמן באוניברסיטת קליפורניה בסן פרנסיסקו1. בהשוואה לשיטות אחרות המשמשות לחקר ביטוי גנים ברמה התרגומית, RIBO-seq מתמקד בכל מחייב ריבוזום ל- mRNA ומספק מידע על מיקומו ועל המספר היחסי של ריבוזומים בתעתיק. זה מאפשר ניטור התהליך של סינתזת חלבון vivo והוא יכול לספק רזולוציה קודון יחיד ודיוק המאפשר מדידה של צפיפות ריבוזום על שניהם, mRNA הפרט לאורך התמלול כולו בתא. בבסיס טכניקת RIBO-seq טמונה העובדה כי במהלך התרגום הריבוזום קושר את מולקולת mRNA ובכך מגן על החלק הקבור של התמליל מעיכול ריבונוקלאאז. עם תוספת של ribonuclease, mRNA לא מוגן מתעכל ואת שברים מוקף ריבוזומים - בדרך כלל של ~ 28-30 nt ארוך - להישאר שלם. שברים אלה, הנקראים עקבות ריבוזומליות (RF), יכולים להיות מבודדים, רציפים וממופים לתעתיק שמקורו בזיהוי המיקום המדויק של הריבוזומים. למעשה, היכולת הריבוזום להגן על שברי mRNA שימש מאז 1960 ללמוד אתרי ייזום מחייב ותרגום ריבוזומלי (TIS)2,3,4. עם זאת, עם ההתקדמות בטכנולוגיית רצף עמוק, RIBO-seq הפך תקן זהב לניטור תרגום5 אשר, באמצעות מעורבות ריבוזום, יכול לספק מידע גנומי רחב על סינתזת חלבונים6. פרופיל ריבוזום מילא את הפער הטכנולוגי שהיה קיים בין כימות התמלול לבין פרוטאום6.
כדי לנהל פרופיל ריבוזום אנחנו צריכים להשיג ליזאט התא של האורגניזם שגדל בתנאים שנחקרו. שיבוש תנאים אלה במהלך איסוף תאים ותמוגה עשוי לספק נתונים לא אמינים. כדי למנוע זאת, מעכבי תרגום, קציר מהיר והקפאת פלאש בחנקן נוזלי משמשים בדרך כלל. תאים יכולים להיות lysed על ידי שחיקה קריוגנית homogenizer מכני כמו טחנת מערבל7,8 או מקצף חרוזים9, ועל ידי טריטורציה באמצעות פיפטה10 או עם מחט11. מאגר התמוגה ניתן להוסיף רק לפני או זמן קצר לאחר ריסוק של התאים. בפרוטוקול שלנו אנו משתמשים חנקן נוזלי כדי מרגמה precool ועלי, כמו גם תחמוצת אלומיניום כגישה עדינה יותר להפרעה של דופן התא החיידקי, אשר מונע גזירה RNA לעתים קרובות נתקל כאשר שיטות כגון sonification מוחלים. לאחר ריסוק, אנו מוסיפים חיץ תמוגה קר כקרח לתכולת המרגמה מקוררת. בחירה של מאגר תמוגה מתאים חשוב להשגת הרזולוציה הטובה ביותר של עקבות ריבוזומליות. מאז חוזק יוני משפיע הן על גודל RF ואת דיוק מסגרת הקריאה, מומלץ כיום להשתמש מאגרי תמוגה עם חוזק יוני נמוך קיבולת חיץ, גם אם נראה כי הרכב המאגר אינו משפיע על תפוסה ריבוזואלית על mRNAs11,12. מרכיבים חשובים של מאגר התמוגה הם יוני מגנזיום, שנוכחותם מונעת ניתוק של יחידות המשנה הריבוזומליות ומעכבת שינויים קונפורמיים ספונטניים בריבוזומים החיידקיים11,13. יוני סידן גם לשחק תפקיד משמעותי והם חיוניים לפעילות של גרעין מיקרוקוקאלי (MNase) המשמש בשיטת פרופיל ריבוזום חיידקי14. תוספת של גואנוסין 5′-[β,γ-imido]טריפוספט (GMP-PNP), אנלוגי שאינו הידרוליזה של GTP, יחד עם כלוראמפניקול מעכב תרגום במהלך תמוגה15.
כאשר מתקבל הליסנט, מובהר על ידי צנטריפוגה ומחולק לשני חלקים, כל אחד עבור RIBO-seq ורצף mRNA כולל בעל תפוקה גבוהה (RNA-seq) שכן הם מבוצעים בו זמנית (איור 1). RNA-seq מספק נקודת התייחסות המאפשרת השוואה של נתונים הן RIBO-seq והן RNA-seq במהלך ניתוח נתונים. התרגום שנחקר מוגדר על ידי נורמליזציה של עקבות ריבוזומליות לשפע mRNA16. נתונים מ-RNA-seq יכולים גם לסייע בזיהוי שיבוט או רצף של חפצים17.
<img alt="דיאגרמת פרופיל ריבוזום: עיכול חומצות גרעין, טיהור RNA, שלבי בידוד mRNA." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1. שרטוטים של הכנת דגימת mRNA עבור ריבו-seq ו- RNA-seq. להכנת ספריית RIBO-seq, RNA מתעכל עם MNase (A), ואחריו מבחר הגודל של RF של ~ 28-30 nt אורך (B); עבור RNA-seq RNA מבודד (C), מדולדל של rRNA (D), ואת mRNA וכתוצאה מכך הוא מקוטע באופן אקראי לרסיסים באורכים משתנים (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
השלבים הראשוניים של הליך ההכנה לדוגמה עבור RIBO-seq ו- RNA-seq שונים במקצת (איור 1). עבור פרופיל ריבוזומלי, lysate צריך להיות מתעכל על ידי אנדונוקלאאז מסוים כדי להשפיל את מולקולות mRNA לא מוגן על ידי ריבוזומים. בפרוטוקולים סטנדרטיים, מונוזומים המתקבלים הם התאוששו על ידי אולטרה צנטריפוגציה כרית סוכרוז או אולטרה צנטריפוגציה שיפוע סוכרוז8,14. במאמר זה, אנו מראים כי שלב זה אינו הכרחי כדי לבודד RF הנדרש עבור RIBO-seq בחיידקים, כמו כן עבור תאים אוקריוטיים18, וכי מבחר גודל של שברי mRNA אורך המתאים מן ג'ל polyacrylamide מספיק.
עבור RNA-seq, mRNA מתקבל על ידי דלדול של rRNA מן RNA הכולל - מולקולות rRNA הכלאה לבדיקות אוליגונוקלאוטיד biotinylated אשר נקשרים חרוזים מגנטיים מצופים סטרפטבידין. קומפלקסים rRNA-oligonucleotide-חרוזים מוסרים לאחר מכן מן המדגם עם מגנט וכתוצאה מכך מדגם מדולדל rRNA19,20. מולקולות mRNA מטוהרים לאחר מכן מפוצלים באופן אקראי על ידי הידרוליזה אלקליין. שברי ה-mRNA המתקבלים, כמו גם עקבות הריבוזומליות, מומרים לספריות cDNA ומוכנים לריצוף עמוק(איור 2). זה כרוך בתיקון מסתיים הדרוש לאחר הידרוליזה אלקליין (עבור mRNA) ועיכול אנזימטי (עבור RF): dephosphorylation של 3 ' קצוות ואחריו זרחון של קצוות 5 '. השלבים הבאים הם קשירת מתאמים ואת התמלול ההפוך כדי ליצור מוסיף cDNA ממוסגר על ידי רצפים הנדרשים עבור ריצוף הדור הבא (NGS) באמצעות פלטפורמת Illumina. השלב האחרון של הכנת הספרייה הוא תגובת PCR שבה המבנים מוגברים ומתויגים עם ברקודים ספציפיים לדוגמה כדי לאפשר multiplexing רצף דגימות שונות בערוץ אחד. לפני הרצף, האיכות והכמות של הספריות מוערכים על ידי אלקטרופורזה DNA רגישות גבוהה על השבב. לאחר מכן ניתן לאגד ולרצף ספריות cDNA עם פרמטרים מתאימים. ניתן לבצע רצף בפלטפורמות שונות של Illumina, כגון MiSeq, NextSeq או HighSeq, בהתאם למספר הספריות, אורך הקריאה הנדרש ועומק הרצף. לאחר הרצף מבוצע הניתוח הביואינפורמטי.
<img alt="תהליך בידוד טביעת רגל; תרשים ריצוף mRNA; פיצול mRNA, קשירת מתאם, PCR." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62544/62544fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2. הכנת ספרייה. הכנת הספרייה כוללת את תיקון הקצוות, קשירת מתאמים, שעתוק הפוך והגברה עם ברקודינג. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62544/62544fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
פרופיל הריבוזום הוא שיטה אוניברסלית אשר ניתן לשנות ולהתאים בקלות על פי השאלה המדעית. במקור הוא שימש שמרים1, אבל זמן קצר לאחר מכן הוחל על תאים חיידקיים21, כמו גם אורגניזמים מודל אוקריוטי כולל עכבר10, זברה דג22, זבוב פירות23 ו Arabidopsis thaliana24. הוא שימש גם לחקר סוגים שונים של ריבוזומים: ציטופלסמי, מיטוכונדריאלי25,26 וכלורופלסט27,28. באיקריוטים RIBO-seq מותאם ומעודן בדרך כלל כדי לחקור היבטים ספציפיים של התרגום, כולל חניכה10,11,29,30,31,32, התארכות 1,10,11,31,33, ריבוזום השתהות33 ושינוי קונפורמציה33. רוב השינויים כרוכים בשימוש במעכבי תרגום שונים. בחיידקים עם זאת, מחקרים מקבילים היו קשים לביצוע בגלל מחסור במעכבים עם מנגנון הפעולה הנדרש34. מעכב התרגום הנפוץ ביותר בחיידקים הוא כלוראמפניקול (CAM) הנקשר למרכז הפפטידיל טרנספראז (PTC) ומונע מיקום נכון של האמינואציל-tRNA באתר A. כתוצאה מכך, CAM מונע היווצרות של קשר פפטיד אשר מוביל למעצר ריבוזומים מוארכים35. דוגמאות אחרות של מעכבי תרגום בחיידקים הם טטרציקלין (TET)36, retapamulin (RET)34 ו Onc11237 אשר שימשו כדי לחקור אתרי ייזום תרגום. TET, אשר מונע משלוח tRNA לריבוזום על ידי חפיפה ישירה עם לולאת גזע אנטיקודון של tRNA באתר A, הוחל במקור כדי לאמת את התוצאות שהתקבלו מטיפול CAM שכן שניהם אנטיביוטיקה מעכבת התארכות תרגום38. TET נמצא לזהות TIS ראשי, עם זאת לא הצליח לחשוף פנימי TIS36. RET נקשר PTC של ריבוזום חיידקי, ומונע היווצרות של הקשר פפטיד הראשון על ידי הפרעה עם aminoacyl-tRNA מוארך באתר. החלת תוצאות RET במעצר ריבוזומים הן ראשי, כמו גם פנימי TISS34. Onc112, פפטיד אנטי מיקרוביאלי עשיר בפרולין, נקשר במנהרת היציאה וחוסם את כריכת aminoacyl-tRNA באתר ריבוזומלי A. כתוצאה מכך, Onc112 מונע ממתחמי חניכה להיכנס לשלב התארכות37.
המידע העיקרי פרופיל ריבוזום מספק הוא צפיפות ריבוזומים ואת מיקומם על mRNA. זה יושם בהצלחה לחקור ביטוי גנים דיפרנציאליים ברמת התרגום בתנאי צמיחה שונים1,6, למדוד יעילות תרגום1,38,39 ולזהות אירועי ויסות תרגום כגון השהייה ריבוזומלית10. RIBO-seq מאפשר גם לחשוף את התרגום של ncRNA ביאורים, פסאודוגנים ומסגרות קריאה פתוחות קטנות ללא ביאורים (ORF) המוביל לזיהוי של גנים קידוד חלבון הרומן ו / או קצר מאוד10,12,22,30,37. במקרים כאלה, RIBO-seq יכול לכוונן ולשפר ביאור הגנום. עם הרגישות הגבוהה שלה לזיהוי של ORFs מתורגם ואופיו הכמותי, פרופיל ריבוזום יכול לשמש גם פרוקסי לקביעת פרוטאום או בסיוע מחקרים פרוטאומיקים31,34,39. על ידי מיפוי TIS, פרופיל ריבוזום חושף N-סופני מורחב וקצץ isoforms של חלבונים ידועים10,32. RIBO-seq הותאם גם ללמוד קיפול תרגום משותף של חלבונים14,21,24. שיטה זו מאפשרת מדידה של שיעורי התארכות1,10,39 או מהירויות פענוח של קודונים בודדים6 ומסייעת בפיתוח מודלים כמותיים של תרגום17. שיטת פרופיל ריבוזום הוא גם מסוגל לספק תובנות מכניות לתוך הריבוזום השהיה בחיידקים7,15,17, frameshifting40, עצור קודון readthrough21, סיום / מיחזור פגמים41,42 ו שינויים קונפורמציה ריבוזומלית33 באיקריוטים. RIBO-seq הותאם גם כדי לבחון את ההשפעה של גורמים טרנס-משחקים ספציפיים על תרגום כגון miRNAs6 וחלבונים מחייבי RNA באיקריוטים16,43. עם זאת, חשוב להכיר בכך שהתכנון הניסיוני והרזולוציה המתקבלת של RIBO-seq קובעים את כמות המידע שניתן לחלץ מנתוני הרצףהמתקבלים 12.

<table><tbody><tr><td>10X TBE (אבקה)</td> <td>Invitrogen</td><td>AM9864</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol, 99%, טהור</td><td>Acros Organics</td><td>125472500</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין 5'-טריפוספט (ATP)</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>תחמוצת אלומיניום טהורה מסויידת p.a.</td><td>Chempur</td><td>114560600</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלוריד דיהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C3881-500G</td><td></td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>MP ביומדיקל</td><td>190321</td><td></td></tr><tr><td>DNA נקי & רכז -5</td><td>Zymo Research</td><td>D4004</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I רקומביננטי, נטול Rnase</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA מלח דיסודיום</td><td>Fisher Scientific</td><td>E/P140/48</td><td></td></tr><tr><td>אתיל אלכוהול אבסולוט 99,8%&nbsp; Pure-PA-Basic</td><td>POCH Avantor Performance Materials פולין SA</td><td>BA6480111</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר סינון</td><td>VWR Collection</td><td>511-0265</td><td>מכשיר סינון זכוכית מלאה, עם משפך, בסיס פריט, מכסה, 47 מ"מ &Oslash; מהדק קפיץ ובקבוק מפרק קרקע</td></tr><tr><td>ג'ל 40 (19:1)</td> <td>Rotiphorese</td><td>3030.1</td><td></td></tr><tr><td>צבע טעינת ג'ל, כחול, 6X</td><td>New England Biolabs</td><td>E6138G</td><td></td></tr><tr><td>גואנוזין 5&פריים;-[&בטא;,&גמא;-אימידו]טריפוספט טריסודיום מלח הידרט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G0635-25MG</td><td></td></tr><tr><td>labZAP</td><td>A& ביוטכנולוגיה</td><td>040-500</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום אצטט טטרהידראט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M5661-250G</td><td></td></tr><tr><td>MCE מתקן ממברנה</td><td>Alfatec Technology</td><td>M47MCE45GWS</td><td>גודל נקבוביות: 0.45um</td></tr><tr><td>MICROBExpress חיידקי mRNA טיהור</td><td>Invitrogen</td><td>AM1905</td><td></td></tr><tr><td>סט הכנה לספריית RNA קטנה מולטיפלקס עבור Illumina</td><td>New England Biolabs</td><td>E7300S</td><td></td></tr><tr><td>אמביון מים ללא נוקלאז</td><td></td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן אצטט נטול מים טהור P.A.</td><td>POCH Avantor Performance Materials Poland SA</td><td>744330113</td><td></td></tr><tr><td>טעינה מהירה pBR322 DNA-MspI Digest</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>E7323A</td><td></td></tr><tr><td>RNA נקי & רכז -25</td><td>Zymo Research</td><td>R1018</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S2889-250G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פחמתי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>223530-500 גרם</td><td></td></tr><tr><td>נתרן מימן פחמתי טהור p.a.</td><td>POCH Avantor Performance Materials Poland SA 810530115</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR כתם ג'ל חומצת גרעין זהב</td><td>Life Technologies</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>T4 פולינוקלאוטיד קינאז</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4 מאגר תגובת פולינוקלאוטיד קינאז</td><td>ניו אינגלנד Biolabs</td><td>B0201S</td><td></td></tr><tr><td>מאגר דגימת TBE-אוריאה (2x)</td> <td>Invitrogen</td><td>LC6876</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)amino-methane, אולטרה-טהור, 99.9%</td> <td>AlfaAesar</td><td>J65594</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100, 98%</td> <td>Acros Organics</td><td>327371000</td><td></td></tr><tr><td>Urea G.R.</td><td>לך:נר</td><td>40096-AP0</td><td></td></tr></tbody></table>

ribo-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף ngs

RIBO-seq in Bacteria: a Sample Collection and Library Preparation Protocol for NGS Sequencing

טכניקת פרופיל הריבוזום (RIBO-seq) היא כיום הכלי היעיל ביותר לחקר תהליך סינתזת החלבון ב vivo. היתרון של שיטה זו, בהשוואה לגישות אחרות, הוא היכולת שלה לפקח על התרגום על ידי מיפוי מדויק של המיקום ומספר הריבוזומים בתעתיק mRNA.
במאמר זה אנו מתארים את השלבים העוקבים של איסוף והכנה לדוגמה לשיטת RIBO-seq בחיידקים, ומדגישים את הפרטים הרלוונטיים לתכנון וביצוע הניסוי.
מאז RIBO-seq מסתמך על ריבוזומים שלמים mRNAs הקשורים, הצעד העיקרי הוא עיכוב מהיר של תרגום התפוררות נאותה של תאים. לכן, אנו מציעים סינון והקפאת פלאש בחנקן נוזלי לקצירת תאים עם טיפול מקדים אופציונלי עם כלוראמפניקול כדי לעצור תרגום בחיידקים. להתפוררות, אנו מציעים שחיקה תאים קפואים עם מרגמה ועלי בנוכחות תחמוצת אלומיניום כדי לשבש מכנית את דופן התא. בפרוטוקול זה, כרית סוכרוז או שיפוע סוכרוז ultracentrifugation עבור טיהור מונוזום אינו נדרש. במקום זאת, הפרדת mRNA באמצעות אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילמיד (PAGE) ואחריו כריתת טביעת הרגל ריבוזומלית (28-30 nt הלהקה) מוחל ומספק תוצאות משביעות רצון. פעולה זו מפשטת במידה רבה את השיטה וכן מפחיתה את דרישות הזמן והציוד עבור ההליך. להכנת הספרייה, אנו ממליצים להשתמש בערכת RNA קטנה הזמינה מסחרית לריצוף Illumina מניו אינגלנד Biolabs, בהתאם להנחיות היצרן עם מידה מסוימת של אופטימיזציה.
ספריות ה- cDNA המתקבלות מציגות כמות ואיכות מתאימות הנדרשות לריצוף הדור הבא (NGS). רצף הספריות שהוכנו על פי תוצאות הפרוטוקול המתוארות ב 2 עד 10 mln קריאות ממופה באופן ייחודי לכל מדגם מתן נתונים מספיקים לניתוח ביואינפורמטי מקיף. הפרוטוקול שאנו מציגים מהיר וקל יחסית וניתן לבצעו באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי.

התוצאות המופתיות שהוצגו כאן התקבלו במחקר שבחן את ויסות התרגום בתאי הסאבטיליס של WT Bacillus. תרבויות לילה היו מדולל OD600 שווה 0.1 ב 100 מ"ל של בינוני עשיר דגירה ב 37 °C (600) עם רעידות נמרצות עד OD600 הגיע 0.5-0.6. המדיום העשיר הוחלף אז במדיום מינימלי כדי לגרום לתהליך ההצטברות והדגירה נמשכה עד ארבע שעות. תאים נקצרו כל שעה החל T0 - אינדוקציה sporulation - וכתוצאה מכך חמש נקודות זמן. דקה אחת לפני הקציר, התרבויות טופלו בכלוראמפניקול כמתואר בפרוטוקול לעיל. תאים נאספו על ידי סינון במערכת סינון ...

כאן אנו מתארים את שלבי איסוף המדגם והכנת RIBO-seq בחיידקים. רצף הספריות שהוכנו על פי הנחיות אלה מביא לנתונים מספיקים לניתוח ביואינפורמטי מקיף. הפרוטוקול שאנו מציגים הוא פשוט, משתמש בציוד מעבדה סטנדרטי ולוקח שבעה ימים מן התזה להשגת ספריות.

RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS

The ribosome profiling technique (RIBO-seq) is currently the most effective tool for studying the process of protein synthesis in vivo. The advantage of ...

טכניקת פרופיל הריבוזום, הנקראת גם RIBO-seq, היא כיום הכלי היעיל ביותר לחקר תהליך סינתזת החלבון ב- vivo. היתרון של שיטה זו הוא היכולת שלה לפקח על התרגום על ידי מיפוי מדויק של המיקום ומספר הריבוזומים. RIBO-seq מבוסס על העובדה כי הריבוזום, על ידי קשירה למולקולת mRNA, מגן על השבר הקבור של התמליל על עיכול ריבונוקלאאז.ניתן לרצף את השברים שהושגו, הנקראים עקבות ריבוזומליות, על גבי התמליל שממנו הגיעו, וכתוצאה מכך לקבוע את המיקום המדויק של הריבוזומים. במקביל ל- RIBO-seq, רצף mRNA כולל בעל תפוקה גבוהה מבוצע כדי לספק נקודת התייחסות ולאפשר השוואת נתונים הן מ- RIBO-seq והן מ- RNA-seq במהלך ניתוח נתונים. לפני קצירת תאים, אתה יכול אופציונלי להוסיף כלוראמפניקול לתרבות החיידקים, לריכוז הסופי של 100 מיקרוגרם למיליליטר, כדי לעכב את התרגום.דגירה את התרבות עם אנטיביוטיקה במשך דקה אחת. שלב זה חשוב אם הקציר לוקח יותר זמן מהרגיל, כמו עיכוב תרגום מאפשר להאריך את זמן איסוף מדגם. לאסוף את הדגימות עם מערכת סינון מחומם מראש.אתה יכול להציג רעידות על מנת לחקות את תנאי הצמיחה. הפסק לסנן כאשר כל המדיה עברה דרך הממברנה, אך אל תאפשר למסנן להתייבש לחלוטין. לאסוף כדורי חיידקים על ידי גירוד מהיר את התאים של דיסק המסנן באמצעות מראש מחומם, חיטוי scoopula.מיד למקם את הסקופולה כולה עם התאים שנקטפו בצינור 50 מיליליטר מלא חנקן נוזלי. גלולה שנקטפו צריך להיות מכוסה לחלוטין חנקן נוזלי. תן גלולה להקפיא ביסודיות, ולעקור תאים קפואים באמצעות scoopula מקורר בעבר.סגור את המכסה, וודא שהוא מנוקב. זה חשוב, כמו חנקן נוזלי יכול לגרום מיכלים סגורים להתפוצץ עקב שינוי הלחץ על אידוי. הכינו GMPP, ספוגית דנ"א וצינורות אפנדורף טריים המוקדשים לליסאז.הכן מאגר תמוגה עם תוספת של כלוראמפניקול במידת הצורך. להקצות 500 מיקרוליטרים של מאגר תמוגה לכל מדגם לתוך צינורות Eppendorf נפרדים, ומניחים אותם על קרח. נטרף מרגמה ועלי עם חיטוי מעבדה ו-70% אתנול.מצננים מרגמה ועלי על ידי שפיכת חנקן נוזלי לתוך המרגמה. מעבירים את גלולת החיידקים הקפואים למרגמה צוננת מראש וטוחנים אותה לאבקה. מוסיפים כנפח אחד של תחמוצת אלומיניום וממשיכים לטחון.שמור מרגמה, עלה, ואת התאים להתקרר על ידי שפיכת חנקן נוזלי בעת הצורך, לא לתת את התוכן של מרגמה להפשיר. ממש לפני השימוש, להוסיף GMPPNP ו DNA ספוגית לתוך aliquot מאגר תמוגה. מעבירים את הפתרון למרגמה וממשיכים לטחון.תן לליסאז להפשיר לאט תוך כדי שחיקה. כאשר הליסאז מפשיר לחלוטין, מעבירים את התערובת לצינור אפנדורף המצונן מראש וחוזרים לקרח. צנטריפוגה lysase ב 20, 0000 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.מעבירים את הסופרנטנטים לצינורות אפנדורף טריים ומצוננים מראש ומניחים אותם על קרח. למדוד את ריכוז RNA בכל מדגם מדולל עם NanoDrop. מחלקים כל lysate לשתי מנות, 0.5 עד 1 מיליגרם של RNA עבור RIBO-seq, והשאר עבור RNA-seq.למיליגרם אחד של ה-RNA, הוסיפו 3.8 מיקרוליטרים של MNase ב-Tris pH 8, ומעליו מאגר תמוגה לנפח הכולל של 500 מיקרוליטרים. דגירה ב 25 מעלות צלזיוס, 300 סיבובים לדקה, במשך 45 דקות. כאשר הדגירה מסתיימת, לנקות את הדגימות עם ערכת ניקוי RNA זמין מסחרית.הכינו 15% ג'ל TBE פוליאקרילמיד עם שמונה אוריאה טוחנת, והניחו אותו במיכל עם חיץ TBE. לרוץ מראש במשך מינימום של 10 דקות במתח קבוע של 200 וולט. מערבבים את הדגימות עם מאגר מדגם TBE-Urea.דנאטורה ב 95 מעלות צלזיוס לדקה אחת ומניחים אותם מיד על קרח. לשטוף את אוריאה על ידי הזרקת חיץ TBE לתוך בארות ג'ל באמצעות מזרק. לטעון את הדגימות, משאיר רווח באר אחד ביניהם כדי להפריד כל מדגם ולמנוע זיהום צולב.השתמשו באוליגו באורך 29 נוקלאוטידים, ובתערובת של אוליגו באורך 26 ו-32 נוקלאוטידים כסמנים. הפעל את האלקטרופורזה במתח קבוע של 180 וולט. הכינו חיץ סטרילי להדגרת לילה.לאחר שהאלקטרופורזה מסתיימת, הכתימו את הג'ל בזהב SYBR. בלו שברים של הג'ל בין 26 ל 32 נוקלאוטידים עם מחט סטרילית או סכין גילוח, ומניחים את שברי הג'ל בצינורות Eppendorf נפרדים. לשנות את המחט או סכין הגילוח בין הדגימות.הוסף 200 מיקרוליטרים של מאגר דגירה לילה לכל Eppendorf ולהדגיר את הדגימות ב 10 מעלות צלזיוס, 1000 סיבובים לדקה, לילה. למחרת, לנקות את הדגימות עם ערכת ניקוי RNA, ו elute אותם 18 microliters של מים ללא גרעינים. העקבות הריבוזומליות המתקבלות מוכנות להכנת הספרייה.בצע דלדול RNA ריבוזומלי עבור דגימות עבור RNA-seq באמצעות ערכה זמינה מסחרית. לאחר מכן, לנקות את הדגימות עם ערכת ניקוי RNA. בצע הידרוליזה אלקליין כדלקמן;להכין את מאגר הידרוליזה אלקליין, להוסיף נפח אחד של המאגר לנפח אחד של המדגם, ולהדגיר ב 95 מעלות צלזיוס במשך 25 דקות.הוסף חמישה microliters של 3 Molar נתרן אצטט pH 5.5 לכל מדגם על מנת לעצור את התגובה. נקו את הדגימות בערכת ניקוי רנ"א, ושחררו אותן ב-18 מיקרוליטרים של מים נטולי גרעין. RNA מקוטע באופן אקראי המתקבל מוכן להכנת הספרייה.הוסף 10 מיקרוליטרים של חיץ תגובה 10x וחמישה microliters של קינאז פולינוקלאוטידים T4 לכל מדגם. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה וחצי. לאחר מכן, להוסיף שלושה microliters של ATP מילימולאר אחד דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לאחר מכן, לנקות את הדגימות עם ערכת ניקוי RNA. בצע את הכנת הספרייה באמצעות הערכה המסחרית הזמינה, בהתאם לפרוטוקול המפורט כאן. בצע PAGE באמצעות ג'ל פוליאקרילמיד 6%."הכתים את הג'ל בזהב SYBR. Excise שברי ג'ל המכילים את הספריות. עבור דגימות RNA-seq, הספרייה היא בין 135 ל 180 נוקלאוטידים, ועבור RIBO-seq, בין 135 ל 170 נוקלאוטידים.השתמש מחטים סטריליות או סכיני גילוח ומניחים את שברי ג'ל מגורש בצינורות Eppendorf נפרדים. זכור לשנות את המחט או סכין הגילוח בין הדגימות. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מים נטולי גרעין לכל שבר ג'ל שנכרת.ותדגיר אותם ב-10 מעלות צלזיוס, 450 כדורים לדקה, בן לילה. למחרת, לנקות את הדגימות עם ערכת ניקוי DNA. הספריות המתקבלות מוכנות לבקרת איכות וכמות ברגישות גבוהה, אלקטרופורזה על שבב DNA, ולאחר מכן לריצוף הדור הבא.ספריות cDNA וכתוצאה מכך להציג כמות ואיכות מתאימים הנדרשים עבור רצף הדור הבא, כפי שאומת על ידי רגישות גבוהה, DNA על שבב אלקטרופורזה. הרצועות והפסגות המייצגות את ספריות RIBO-seq צרות ומוגדרות טוב יותר, בהשוואה לספריות RNA-seq. על פי האלקטרופורזה על השבב, לספריות יש את העדשה הצפויה.הפסגות הנוספות הקרובות יותר ל-200 זוגות בסיסים הנמצאים בספריות RIBO-seq עשויות להצביע על ריבוזומים של שנת חורף, לא על עקבות ריבוזומליות מתעכלות לחלוטין, או על ממצאים, לדוגמה, rRNA, וניתן למחוק אותם במהלך ניתוח ביואינפורמטי כאשר הנתונים המתקבלים מריסוק נחתכים ו- rRNA מסונן. הכמות הממוצעת של cDNA שנוצר בהכנת הספרייה היא 32 ננוגרם, מתן כמות מספקת של חומר הנדרש עבור רצף הדור הבא. לאחר בקרת איכות על ידי אלקטרופורזה על השבב, ספריות נמשכו לריצוף יחיד ו -50 זוגות בסיסים בפלטפורמת NextSeq 500 של אילומינה.קיצוץ המתאמים ורצפים באיכות ירודה הביא 25 עד 47 מיליון קריאות לכל מדגם עבור דגימות RNA-seq, ו 25 עד 50 מיליון קריאות לכל מדגם עבור דגימות RIBO-seq. הנתונים שהושגו היו בקרת איכות נבדקה עם FastQC. שתי דגימות RNA-seq ו RIBO-seq הציגו איכות טובה מאוד.מיפוי הספריות שהוכנו על פי הפרוטוקול המתואר הניב 2.4 עד 9.6 מיליון קריאות ממופה באופן ייחודי לכל מדגם לדגימות RNA-seq, ו-2.3 עד 10.4 מיליון קריאות ממופה באופן ייחודי עבור דגימות RIBO-seq. נתוני RIBO-seq מציגים מחזוריות משולשת ופסגה גבוהה וצרה, המתאימה לריבוזומים היוזמים ומאפיינים את עקבות הריבוזומה, שאינה נצפית בנתוני ה- RNA-seq. יתר על כן, העלילה המציגה את הפרופילים של כיסוי ממוצע של עקבות ריבוזומליות ושברי mRNA ברצפי הקידוד חושפת את השיעור הגבוה יותר של קריאות הממופות לתקליטורים בערכת הנתונים RIBO-seq, כצפוי.ההדמיה של עקבות הריבוזומליות הממופות הראתה דפוסים דומים מאוד בהשוואה לתוצאות שהתקבלו מאותו ניסוי שבוצע בהתאם להליך RIBO-seq הסטנדרטי, הכולל התאוששות מונוזום על ידי שיפוע סוכרוז אולטרה-צנטריפוגציה. הפרוטוקול שלנו שימש לבדיקת ויסות תרגום בתנאי צמיחה שונים, אך ניתן ליישמו כדי ללמוד היבטים אחרים של תרגום, כמו זיהוי אתרי ייזום תרגום וגנים חדשניים של קידוד חלבונים. רצף הספריות שהוכנו על פי ההנחיות שלנו מביא לנתונים מספיקים לניתוח ביואינפורמטי מקיף.הפרוטוקול שאנו מציגים כאן הוא מהיר, קל וחסכוני, וניתן לבצעו באמצעות ציוד מעבדה סטנדרטי.

ribo-seq-bacteria-sample-collection-library-preparation-protocol-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול ריבוזומלי רנ"א (rRNA) דלדול פותח כדי להעשיר RNA שליח (mRNA) לRNA-seq של metatranscriptome בטן היתוש. בדיקות דגימה ספציפיות rRNA, ששמשו להסרת rRNA דרך חיסור, נוצרו מהיתושים וחיידקי המעיים שלה. ביצועים של הפרוטוקול יכולים להוביל להסרה של כ 90-99% מrRNA.

דלדול של רנ&quot;א ריבוזומלי לMetagenomic גוט יתוש RNA-seq

אפיון הקהילה המיקרוביאלית היה מטרה ארוכת שנים במיקרוביולוגיה סביבתית. שיטות ריצוף מהדור הבא מאפשרות כעת אפיון של קהילות מיקרוביאליות בעומק חסר תקדים עם עלות ועבודה מינימליות. אנו מפרטים כאן את הגישה שלנו לרצף גנים של RNA ריבוזומלי חיידקי 16S באמצעות רצף שולחני.

רצף של הדור הבא של 16S ריבוזומלי amplicons ג&#39;ין RNA

כתב יד זה מתאר גישה אוטומטית לבחירת גודל ג'ל לטיהור מקטעי DNA לריצוף הדור הבא. טכנולוגיית הריינג'ר מספקת אוטומציה מלאה של כל תהליך העמסת ג'ל אגרוז, ניתוח אלקטרופורטי ושחזור של שברי DNA ממוקדים המאפשרים ספריות ריצוף מהדור הבא בתפוקה גבוהה ובאיכות גבוהה.

בחירת גודל האוטומטי ג&#39;ל כדי לשפר את האיכות של ספריות רצף הדור הבא הוכן מדגימות סביבתיות מים

אנחנו מתארים שיטה יעילה, איתנה, וחסכונית לחילוץ חומצות גרעין מן מטליות לאפיון של קהילות חיידקי באמצעות רצף amplicon הגן 16S rRNA. השיטה מאפשרת גישה עיבוד משותף סוגי מדגם מרובים ויכול להכיל מספר תהליכים טיפוליים במורד הזרם.

הפקת חומצות גרעין יעיל 16S rRNA ג&#39;ין רצף עבור בקטריאלי קהילת אפיון

תקנה translational ממלא תפקיד חשוב בבקרה על שפע חלבונים. כאן, אנו מתארים שיטה תפוקה גבוהה לניתוח כמותי של תרגום שמרים ניצני האפייה.

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

ג'ל-seq מאפשר חוקרים להכין בו זמנית ספריות עבור שניהם הדנ א - ו RNA-seq זניח עלות נוספת החל מ- 100-1000 תאים באמצעות מכשיר הידרוג פשוטה. המאמר מציג גישה מפורטת על הזיוף של המכשיר, כמו גם את הפרוטוקול הביולוגי כדי ליצור ספריות לזווג.

ג'ל-seq: שיטת הכנת ספריה סימולטני רצף DNA ו- RNA באמצעות מטריצות הידרוג

אנו מציגים פרוטוקול RNA קטן מפורט של הספרייה רנ א עם פחות הטיה מאשר שיטות סטנדרטיות רגישות מוגברת עבור 2 '-O-מתיל RNAs. פרוטוקול זה יכול להיות בעקבות שימוש ריאגנטים תוצרת בית כדי לחסוך עלות או באמצעות ערכות לנוחות.

שיפור רנ א קטן-seq: פחות הטיה וזיהוי טוב יותר של 2 '-O-מתיל RNAs

פרוטוקול זה מפרט גישה מקיפה עבור כתות, רצף, ואת הרכב הגנום ההיברידי דה נובו של חיידקי השתן. הוא מספק הליך לשחזור ליצירת רצפי גנום מעגליים שלמים שימושיים בחקר יסודות גנטיים כרומוזומליים ואקסטרכרומוזומליים התורמים לקולוניזציה של שתן, פתוגנזה והפצת התנגדות מיקרוביאלית.

הרכבה הגנום ההיברידית דה נובו לייצור גנומים שלמים של חיידקי השתן באמצעות טכנולוגיות רצף קצרות וארוכות

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה קלה למעקב לביצוע טיהור RNA פולי(A), המרת ביסולפיט והכנת ספרייה באמצעות ציוד סטנדרטי לדגימה ביולוגית מעניינת.

העשרת ספריית mRNA וביסולפיט-mRNA הכנה לריצוף הדור הבא

אנו מתארים פרוטוקול כדי לזהות רנ א מחייב חלבונים ולמפות אזורים מחייב RNA שלהם ב תאים חיים באמצעות photocrosslinking בתיווך UV וספקטרומטר מסה.

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

למד את פרוטוקול RIBO-seq לחיידקים לריצוף NGS, הכולל איסוף דגימות והכנת ספריות. שיטה זו ממפה מיקומי ריבוזומים על mRNA ומספקת נתונים מקיפים לניתוח ביואינפורמטי בתוך שבעה ימים.

RIBO-seq בחיידקים: אוסף לדוגמה ופרוטוקול הכנת ספריה לריצוף NGS

גלה סרטונים נוספים