זריקות של וקטורים AAV לאופטוגנטיקה במוח פרימטים מורדם וער המתנהג באופן לא אנושי
4 באוגוסט 2021
כפי שמיושם כיום, אופטוגנטיקה בפרימטים שאינם אנושיים דורשת הזרקה של וקטורים נגיפיים למוח. שיטת הזרקה אופטימלית צריכה להיות אמינה, ועבור יישומים רבים, מסוגלת להתמקד באתרים בודדים בעלי עומק שרירותי המזוהים בקלות ובאופן חד משמעי בהיסטולוגיה שלאחר המוות. שיטת הזרקה עם תכונות אלה מוצגת.
מחקרים טיפוליים גנטיים ומדעי המוח רבים כוללים זריקות של וקטורים של AAV למוחות של פרימטים שאינם אנושיים. כדי שמחקרים אלה יצליחו, טכניקת ההזרקה חייבת להיות אמינה. טכניקת ההזרקה שלנו היא מיידית ומדויקת.
הליך זה עובד היטב להזרקה בבעלי חיים מורדמים או ערים. הצינורית הביתית שלנו קלה לטיפול ובעלות נמוכה. מי שידגים את ההליך יהיה קווין מאי, טכנאי הנדסה מהמעבדה שלי.
כדי להתחיל, קהה 30 מד 13 מ"מ מחט היפודרמית עם מטחנת דיסק. לאחר מכן, חתכו חתיכת צינורות נירוסטה לאורך בהתאם לעומק אזור מוח המטרה. בעזרת משחזת דיסקים, משופעים בקצה אחד של צינור החיתוך ומחליקים את השני.
מנטרלים את החלק הפנימי של הצינור עם סיכה. לאחר מכן, חתכו חתיכת צינורות PTFE לאורך המתאים לטעינת נפח הפתרון הווקטורי. התלקחות שני הקצוות של הצינור על ידי החדרת מחט היפודרמית קהה.
הכנס את המחט ההיפודרמית הקהה כחמישה מילימטרים לקצה אחד של צינור ה- PTFE. לאחר מכן הכנס את הקצה הלא משופע של צינורות הנירוסטה כחמישה מילימטרים לקצה השני. בדוק את הצינורית על ידי הזרקת מים מסוננים דרך רכזת המחט ההיפודרמית.
ודא שהמים יוצאים מקצה צינורות הנירוסטה המשופעים בצורה חלקה ושהמים אינם דולפים מאף אחד מהצמתים. לאחר בדיקת הצינורית, מניחים אותה בשקית אוטוקלאב ומעקרים אותה על ידי אוטוקלב. העבר בעדינות את הפתרון הווקטורי לצינור PCR מעוקר עם פיפטר P-20, תוך הימנעות מהיווצרות בועות.
לאחר מכן, חברו את הצינורית כשהקצה המשופע פונה כלפי מטה למחזיק סטריאוטקסי בעל אוריינטציה אנכית. לאחר מכן חברו מזרק מנעול לואר של מיליליטר אחד לרכזת המחט ההיפודרמית של הצינורית. השקע את הקצה המשופע בפתרון הווקטורי.
לאחר מכן, הפעל לחץ שלילי עדין עם מזרק של מיליליטר אחד כדי לטעון את התמיסה לתוך הצינורית תוך מעקב חזותי אחר המניסקוס בין התמיסה לאוויר. לאחר טעינת התמיסה הווקטורית, המשיכו בלחץ השלילי העדין עד שהתמיסה תגיע לרכזת המחט. לאחר מכן, הסר את המזרק של מיליליטר אחד והזריק באיטיות שמן מינרלי צבעוני לאורך הקיר הפנימי של רכזת המחט ההיפודרמית, תוך הקפדה להימנע מבועות אוויר.
חבר את רכזת המחט ההיפודרמית לאחת משתי היציאות הפתוחות של פקק נעילה תלת-כיווני. לאחר מכן, סגור את היציאה. מלאו מזרק של מיליליטר אחד באוויר וחברו אותו לאחת משתי היציאות האחרות.
לבסוף, סגור את היציאה הנותרת של stopcock כדי לחבר את המזרק לצינורית. הצמדת המזרק מכניסה את האוויר לתוך הפקק, והסטת האוויר ליציאה הפנויה מונעת ממנו לדחוף את התמיסה הווקטורית בחזרה במורד הצינורית. דחפו באיטיות את האוויר מהמזרק לתוך הצינורית.
ברגע שהשמן הצבעוני מופיע בקצה המחט הבוטה בצינורות ה-PTFE, בדקו אם יש אוויר בין התמיסה לשמן הצבעוני. המשיכו להפעיל לחץ חיובי עד שתיראה טיפה של תמיסה וקטורית בקצה הצינורית המשופעת. לאחר מכן, סגרו את הפקק כדי למנוע מהווקטור לצאת מהצינורית על ידי כוח הכבידה.
לאחר טעינת הפתרון הווקטורי, הצמידו את הצינורית למניפולטור הסטריאוטקסי. לאחר מכן, כדי לחבר את ה-stopcock למשאבת האוויר החשמלית, קח את צינור המשאבה מהעוזר הלא סטרילי. אחזו במחבר מנעול הלואר דרך דופן שרוול סטרילי.
שחררו את צווארון השרוול, ואפשרו לו להתרחב לאורך הצינור בכוח הכבידה. לאחר מכן, הצמידו את הפקק והדביקו את השרוול בחוזקה סביב מחבר מנעול הלואר. לאחר מכן, בדוק את משאבת האוויר ואת הצינורית על ידי הגדרת משאבת האוויר ללחץ נמוך, לפני הפעלתה והגברת הלחץ עד שהשמן מתקדם דרך הצינורית וטיפה של תמיסה וקטורית נראית בקצה הצינורית.
הדבק סרגל פלסטיק לצינורות PTFE כדי למדוד את תנועת המניסקוס במהלך ההזרקה. לאחר מכן, להניע את הצינורית למטה עם מניפולטור סטריאוטקסי עד קצה מגיע לפני השטח ולהקליט את העומק. סעו בצינורית לאתר העמוק ביותר שיש להזריק לאורך המסלול.
המשטח יתנפח במגע. כדי למזער את המיקוד השגוי עקב דחיסת רקמות, יש להוריד את הצינורית ולצלם את אתר ההזרקה העמוק ביותר ב-500 מיקרומטר. לאחר מכן, נסוגו באיטיות.
חלופות אחרות הן הנעת הצינורית באיטיות או נהיגה מהירה והמתנה בתחתית במשך דקה עד חמש דקות. לאחר מיקום הצינורית במקום ההזרקה העמוק ביותר, השתמש במשאבת האוויר החשמלית כדי להזריק 0.5 מיקרוליטר של התמיסה הווקטורית במשך 10 עד 30 שניות. אשר את זרימת ההזרקה על ידי מעקב אחר המניסקוס בין השמן הצבעוני לתמיסה הווקטורית בצינור PTFE.
לאחר המתנה של דקה, החזירו את הצינורית למקום ההזרקה הבא לאורך המסלול. לאחר ההזרקה הסופית, השאירו את הצינורית במקומה למשך 10 דקות כדי למנוע שטף וקטורי. לאחר מכן, החזירו את הצינורית והשליכו אותה למיכל של ביוהאזרד שארפ.
הזרקה של וקטורים AAV הנושאים את טרנסגן התעלה רודופסין II בקוליקולוס העליון השמאלי, ולאחר מכן גירוי עם אור כחול רציף ב 40 מילי-וואט, יצרה סדרה של פוטנציאלי פעולה עוקבים. פולסי אור של אלפית שנייה אחת לא הצליחו לעורר פוטנציאל פעולה ב-40 מילי-וואט, אך עוררו אותם באופן אמין ב-160 מילי-וואט. גירוי אופטי של הקוליקולוס העליון המופעל על ידי סקאדות מונחות חזותית הפחית את רווח הסקאדה בהדרגה.
האיטיות של שינוי זה עולה בקנה אחד עם פלסטיות הנגרמת על ידי אופטיקה. העברת אור לייזר צהוב לוורמיס האוקולומוטור לאחר זריקות AAV בגרעין הרשתית tegmentae pontis דיכאה את פעילות סיבי הטחב, שהיא קלט למוח הקטן. דיכוי זה הפחית את פעילות תאי Purkinje, שהיא פלט של המוח הקטן.
במהלך דיכוי אופטוגנטי, קצב הירי ירד והשתנה לדפוס נקבוביות מתפוצצות, מה שמרמז על כך שקלט סיבי הטחב המעוכבים לתאי Purkinje משפיע על שלב ההאטה של הסקאדה על ידי הנעת ההתפרצות השנייה. רודופסין ערוץ התבטא אך ורק בתאי Purkinje של vermis oculomotor. אספקה של פולסים קצרים של אור הגבירה את פעילות הספייק הפשוטה של תא Purkinje מבודד.
פולס אור יחיד של 1.5 אלפיות השנייה עורר לעתים קרובות יותר מזינוקים פשוטים אחד. הפעלת ספייק פשוטה אופטוגנטית מתוזמנת להתרחש במהלך הסקאדה הגדילה את משרעת הסקאדה, ואישרה את התפקיד הדיסאינהיביטורי של תאי Purkinje על מחולל ההתפרצות האוקולומוטורית. בועות אוויר בצינורית יכולות לשבש את מניסקוס וקטור השמן, לסבך את קביעת נפחי ההזרקה ולמנוע שליטה עדינה בקצב הזרימה.
מסיבות אלה, טעינת הפתרונות הווקטוריים ללא בועות אוויר היא קריטית להליך זה. שישה עד שמונה שבועות לאחר ההזרקה, מניפולציות אופטוגנטיות ניתן לבצע ואת רקמת המוח ניתן לעבד לניתוח היסטולוגי. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לבחון וקטורים רבים בבעלי חיים מעטים, אשר, בתורו, מקל על פיתוח ואימות של וקטורים חדשים.
תחום עניין מסוים כיום הוא בפיתוח וקטורים שיתמקדו בסוגים עצביים ספציפיים.
סקירה כללית
מחקר זה מציג טכניקת הזרקה מהירה ואמינה להחדרת וקטורי AAV למוחם של פרימטים שאינם אדם, דבר המהווה חשיבות קריטית ליישומים אופטוגנטיים. השיטה מאפשרת התמקדמות באזורי מוח ספציפיים, כאשר גרייה מוצלחת של ה-superior colliculus הובילה לשינויים אלקטרופיזיולוגיים בולטים ולתובנות לגבי פלסטיות מוחית.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אופטוגנטיקה
- טיפול גנטי
רקע
- אופטוגנטיקה דורשת החדרה מדויקת ואמינה של וקטורים ויראליים.
- טכניקת ההזרקה חייבת לאפשר מיקוד וזיהוי מדויקים של אזורי מוח.
- שיטות קודמות עשויות להיות חסרות יעילות או דיוק, מה שמחייב פיתוח של טכניקות משופרות.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוצדורה אמינה להזרקת וקטורי AAV בפרסומיים (non-human primates).
- בחינת ההשפעות של גרייה אופטוגנטית על תגובות נוירונליות.
- ביסוס שיטה שניתן להחילה הן על נבדקים ערים והן על נבדקים תחת הרדמה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- במחקר נעשה שימוש בקנולה שהוכנה במעבדה להגשת תמיסות וקטוריות.
- לבניית הקנולה נעשה שימוש במחט היפודרמית במידה 30 ובצינורית פלדת אל-חלד.
- השיטה כללה שלבים מדוקדקים של הכנה, טעינה והזרקה של התמיסה.
- הזרקות של התמיסה הווקטורית בוצעו תחת בקרה מדויקת באמצעות משאבת אוויר חשמלית.
- תגובות אלקטרופיזיולוגיות נוטרו במהלך ההזרקות ולאחריהן.
תוצאות עיקריות
- הזרקת וקטורי AAV הובילה ליצירה משמעותית של פוטנציאל פעולה כמענה לגירוי אופטי.
- שינויים אלקטרופיזיולוגיים מרמזים על פלסטיות בהשראת אופטוגנטיקה בתגובות סקדיות.
- עירוי הווקטור גרם לדיכוי נצפה של הפלט מהמוח הקטן, המעיד על דפוסי פעילות נוירונלית משתנים.
מסקנות
- טכניקת ההזרקה המוצעת מאפשרת דיוק במיקוד עבור מחקרים אופטוגנטיים במודלים של פרימטים.
- הממצאים תורמים להבנת המנגנונים העצביים והפלסטיות הקשורה לעיבוד חזותי.
- דיוק משופר בהזרקה הוא בעל השלכות משמעותיות עבור יישומים עתידיים של טיפול גנטי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות לתעשייה עבור מנהלים
החדרה אמינה ומדויקת מרחבית של וקטורי AAV במוחות של פרימטים שאינם אדם (NHP) היא גורם מאפשר קריטי לפיתוח אופטוגנטיקה תרגומית ולטיפולים גנטיים נוירולוגיים. שיטה זו נותנת מענה לאתגר של הזרקה הדירה של וקטורים ב-NHPs, ובכך תומכת בתיקוף יעדים חסון ובצמצום סיכונים מכניסטיים לפני מעבר לשלב הקליני. יכולתה להקל על בדיקה של וקטורים מרובים (multiplexed) בקוהורטות מוגבלות של בעלי חיים משפיעה ישירות על יעילות הפורטפוליו ועל הביטחון החזוי בקווי הפיתוח של טיפולים למערכת העצבים המרכזית (CNS).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיקה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה קפדנית של מבנים אופטוגנטיים וטרופיזם של וקטורים במערכת NHP הרלוונטית למחלה.
- תומך בתיקוף תפקודי של יעדים נוירונליים באמצעות מודולציה אופטית מבוקרת ותוצרי קריאה אלקטרופיזיולוגיים.
- מסייע בהסרת סיכונים מכניסטיים על ידי מתן אפשרות להגשה מרחבית ונפחית מדויקת של וקטורים מועמדים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין אזורי מוח מאומתים של NHP עבור בדיקות אופטוגנטיות ואלקטרופיזיולוגיות המשך.
- מנרמל את נפחי וקצבי ההזרקה, ובכך משפר את השחזוריות בין הרצות ניסויים שונות.
- מאפשר הערכה כמותית של ביטוי הווקטור ותוצאות תפקודיות לצורך סריקת ווקטורים מועמדים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתיישב עם אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים באמצעות מידול של מעגלים עצביים רלוונטיים לבני אדם ב-NHPs.
- מספק רציפות משלב גילוי הווקטור ועד לאישוש פרה-קליני במערכת בעלת נאמנות גבוהה.
- מפחית סיכון ביולוגי על ידי מתן אפשרות להעברה וביטוי חסונים של מבנים טיפוליים, הניתנים לאימות היסטולוגי.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
טכניקת הזרקה זו משתלבת בממשק שבין שלבי הגילוי המוקדמים, תיקוף המטרה ופיתוח מודלים פרה-קליניים עבור תוכניות של אופטוגנטיקה וטיפול גנטי במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות ובבירור מסלולים על ידי מתן אפשרות למניפולציה מדויקת של מעגלים עצביים ב-NHPs.
- סריקה: מספק מתן וקטורים כמותי וניתן לשחזור לצורך הערכה השוואית של מבני מועמדים (constructs).
- אנליטיקה: מספק פלטיים מדידים כגון נפח הזרקה, קצב ואישור היסטולוגי לאחר המוות.
- מחקר תרגומי: מגשר בין שלב הגילוי לאימות פרה-קליני על ידי מידול של תגובות עצביות דמויות-אנוש ב-NHPs.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקול סטנדרטי וניתן להרחבה שניתן להתאימו לשילובים שונים של וקטורים ומטרות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות, הסטנדרטיזציה והתפוקה לבדיקת וקטורים בפרימטים לא אנושיים (NHPs).
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך התהליך (go/no-go) ואת הקצאת ההון על ידי אפשור ייצור נתונים פרה-קליניים חסונים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים ובקידום נכסי גן-טיפולים למערכת העצבים המרכזית (CNS).
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בניתוחים סטריאוקסטיים ובנוירו-אנטומיה של פרימטים שאינם אדם (NHP) להשגה מדויקת של היעד.
- נדרשת גישה לתשתיות ייעודיות לייצור קנולות, מכשור להזרקה וניתוח היסטולוגי.
- נדרש תקינה קפדנית בין צוותים כדי להבטיח הדירות והשוואתיות של הנתונים.
- ניתן להתאים את הפרוטוקול לאזורי מוח שונים ולסוגי וקטורים שונים באמצעות ביצוע שינויים במידת הצורך.
- הסרה קפדנית של בועות אוויר היא קריטית לשמירה על דיוק ההזרקה ולמניעת הפרעות בזרימה.
שאלות נפוצות בביו-פרמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:51
Making a Cannula
2:09
Loading the Vector Solution for Injection
4:14
Cannula Insertion into the Target Brain Area and Injection
6:33
Results: Optogenetic Manipulations by Adeno-Associated Viral (AAV) Vector Injections in Awake Monkeys
8:39
Conclusion
