הכנת רקמות אנושיות משובצות בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית לניתוח ספקטרומטריית מסה

OCT הוא סוכן שימור קריו שאינו עולה בקנה אחד עם ניתוח ספקטרומטריית מסות. באמצעות פרוטוקול זה, חוקרים יכולים להסיר OCT מרקמות ולכמת ספינגוליפידים באמצעות ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית טנדם. הכנת פתילות לייבוש רקמות, שטיפת רקמות ושקילת רקמות תודגם על ידי אפריל בויד מאוניברסיטת וירג'יניה, ומיצוי השומנים יודגם על ידי ד"ר ג'רמי אלגוד, מנהל ליבת המטבולומיקה והליפידומיקה של חבר העמים של וירג'יניה.

כדי להתחיל, לנקות מספריים כירורגיים על ידי טבילתם במתנול במשך חמש דקות, ולאחר מכן ניגוב אותם עם רקמה מעבדה נקייה כיתה. באמצעות כפפות נטולות אבקה, סובבו את הקצה של רקמה ברמת מעבדה כדי ליצור פתיל מחודד דק באורך 30 עד 40 מילימטרים. לאחר מכן באמצעות מספריים מנוקים מתנול, לחתוך את הפתיל בקצה עבה ומניחים אותו בקופסת קרטון נקייה.

לאחר מכן, באמצעות מספריים מנוקים מתנול, לחתוך ארבעה עד חמישה מילימטרים מקצה של קצה פיפטה מיליליטר אחד ולהניח את הקצה בחזרה במחזיק הקצה. כדי לשטוף את ה-OCT מהרקמות, הוסיפו 10 מיליליטר של מים דה-יוניים קרים כקרח לכל צינור המכיל רקמת ריאה אנושית וכסו אותם בחוזקה. אפשר את הצינורות לדגור במשך 10 דקות.

מערבלת במרץ כל צינור עד שכל הרקמה שהופקדה על קירות הצינור או גלולת הרקמה מתחדשת לחלוטין. לאחר מכן צנטריפוגה את הצינורות בצנטריפוגת דלי מתנדנדת מקוררת מראש ב 4, 000 עד 5, 000 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השלמת הצנטריפוגה, פתחו את הצינורות על הקרח.

בזהירות לשאוף את תמיסת לשטוף, משאיר כ 0.5 מיליליטר של supernatant בצינור, ולאחר מכן לסכם את הצינור. לאחר הסרת supernatant מכל הצינורות, לשטוף את הרקמות פעמיים נוספות באותו אופן. לאחר שלוש השטיפות להסרת OCT, השתמש בקצה הפיפטה המקוצר המוכן כדי להוסיף 500 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח לצינור.

באמצעות אותו קצה, יש להשעות בעדינות את הכדור ולהעביר את כל הרקמה שעברה החייאה לתוך צינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר מסומן מראש ומשוקל מראש. שמור את הצינור על הקרח עד שכל דגימות הרקמה מועברות. גלולו את הרקמות על ידי צנטריפוגה של הצינורות בצנטריפוגה מקוררת מראש, ואז שאפו בזהירות כמה שיותר מה-PBS מבלי להפריע לכדור והניחו את הצינורות בחזרה על קרח.

באמצעות פתילות ייבוש הרקמות שהוכנו קודם לכן, הסר בעדינות את כל תמיסת הכביסה שנותרה, ולאחר מכן סגור את הצינור והנח אותו על קרח. כדי לשקול את הצינורות, הנח צינור אחד בכל פעם באיזון אנליטי מכויל לאחרונה ואפס וסגור את דלת התא. לאחר שהמשקל התייצב, רשום אותו בגיליון אלקטרוני אלקטרוני.

לאחר השקילה, החזירו את הצינור לקרח והוסיפו 300 מיקרוליטרים של PBS קר כקרח. באמצעות קצה פיפטה מקוצר, העבירו בזהירות את כל הרקמה לשני מיליליטר של מתנול קר כקרח בצינור זכוכית עליון עם הברגה עם תווית מראש. לפני מיצוי השומנים, אפשרו לרקמות ולתקני השומנים הפנימיים של ספקטרומטריית המסות להתאזן לטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, ולאחר מכן מערבלים וטובלים את התמיסות הסטנדרטיות הפנימיות באמבט מים על-קולי עד לפירוק מלא של תקני השומנים.

באמצעות פיפטה חוזרת, הוסף 250 פיקומולים של תקני ספקטרומטריית המסות הפנימית לכל צינור וסכם קלות את הצינורות. כדי להקל על הומוגניזציה, להתאים את נפח המתנול לשני מיליליטר, ולאחר מכן triturate את הרקמה באמצעות homogenizer על ידי הזזת קצה הומוגנייזר בתנועה מעגלית שנלחץ בעדינות על דופן הצינור. כאשר גושים אינם נראים עוד, יש לסכם את הצינור.

לטבול את הצינור בזווית של 45 מעלות באמבט מים קולי למשך 5 עד 10 שניות. לאחר מכן, מתחת למכסה אדים, הוסיפו כלורופורם ומתנול לכל צינור כדי להשיג יחס מתנול לכלורופורם למים של שניים לאחד ל-0.1. אטמו את הצינורות בחוזקה והשאירו אותם על הספסל עד סוף היום.

לפני היציאה באותו ערב, הניחו את הצינורות הסגורים היטב באמבט מים של 48 מעלות צלזיוס לדגירת לילה. ביום שלמחרת, גלולה כל ממס ופסולת מסיסה על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, במכסה אדים, הדקיטו בזהירות את הסופר-נאטנט לתוך מבחנות זכוכית בורוסיליקטיות מסומנות מראש בגודל 13 עד 100 מילימטר המוטות בזווית של 30 עד 45 מעלות כדי להקל על ההדחה.

לאחר ניתוק הסופר-נטנט מכל הצינורות, השתמש ברכז ואקום בוואקום מקסימלי עם שלב חימום ראשוני של שעה אחת בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס כדי לאדות את כל הממס, ולאחר מכן הוסף 500 מיקרוליטר של מתנול לכל צינור. כדי להשעות את תמציות השומנים המיובשים, מערבלים את הצינור למשך 5 עד 10 שניות, ולאחר מכן לטבול את הצינור באמבט מים קולי בזווית של 45 מעלות עם סיבוב במשך שתי דקות. מערבלים מחדש את הצינור במשך חמש שניות וטבולים מחדש באמבט המים הקוליים למשך דקה נוספת.

הסר כל פסולת בלתי מסיסה על ידי צנטריפוגה, ולאחר מכן דקר את הסופרנטנט לתוך בקבוקון autoinjector מסומן מראש מוטה בזווית של 30 עד 45 מעלות כדי להקל על decanting. מכסים את הבקבוקונים היטב לפני אחסונם במינוס 80 מעלות צלזיוס עד לניתוח. כרומטוגרפיה נוזלית אלקטרוספריי יינון טנדם ניתוח ספקטרומטריית מסה לאחר הסרת OCT מאשר כי מינים שונים באורך שרשרת של סרמידים ומונוהקסוזיל-סרמידים גבוהים באופן משמעותי בגידולי אדנוקרצינומה של ריאה אנושית בהשוואה לרקמות לא מעורבות סמוכות רגילות.

תקני ספינגוליפיד מתחמקים ברצף בסדר הבא:d17:1 ספינגוזין, d17:1 ספינגוזין-1-פוספט, C12 לקטוזיל-סרמיד, C12 מונוהקסוזיל-סרמיד, C12 ספינגומיאלין וסרמיד C12. עבור כל אחד ממיני הספינגוליפידים האלה, באמצעות הגדרות השיפוע והמכשור בטקסט, יש תזוזה חיובית משוערת של 0.15 דקות בזמן השמירה עבור כל עלייה של שני פחמנים באורך השרשרת. עם זאת, ליפידים ארוכים יותר באורך השרשרת כגון C24 ו- C26 עשויים להיות בעלי משמרות זמן שימור גדולות יותר.

יתר על כן, קשר כפול בחומצת השומן גורם לעתים קרובות לשינוי שלילי של 0.15 דקות בזמן השמירה. לפיכך, C18:1 סרמיד יהיה זמן שמירה דומה C16 סרמיד. במקום להסתמך כמעט אך ורק על רקמות טריות שנאספו, פרוטוקול זה מרחיב את מקורות הרקמה שיכולים לשמש לניתוח ספקטרומטריית מסה כך שיכללו את אלה המאוחסנים באופן קריוגני בביו-ריפוזיטורים.