שימוש באלקטרופורציה לאחר הלידה של In Vivo לחקר מורפולוגיה של נוירון גרגיר המוח הקטן והתפתחות סינפסה
9 ביוני 2021
כאן אנו מתארים שיטה לדמיין סינפטוגנזה של נוירונים גרגיריים במוח הקטן של העכבר במהלך הזמן של התפתחות המוח לאחר הלידה, כאשר תאים אלה משכללים את המבנים הסינפטיים שלהם ויוצרים סינפסות כדי לשלב את עצמם במעגל המוח הכולל.
הפרוטוקול חוקר נוירונים גרגיריים צרבלריים לאורך שלבי התפתחות שונים על מנת לדמיין צמיחה מורפולוגית מרכזית. יתרונות הטכניקה כוללים מיקוד ספציפי לתא, ביטוי מהיר של מבנים נגועים, ותיוג דליל של תאים המאפשר לחקור השפעות אוטונומיות של תאים. התחל בחיתוך קטע של 11.2 מ"מ מקצה פיפטת העמסה והנח את החלק החתוך מעל קצה מזרק המילטון כמרווח כדי להגביל את עומק ההזרקה ל -1.5 מילימטר.
אבטחו את הספייסר על קצה המזרק בעזרת דבק או פרפילם. כדי לחקור את המורפולוגיה של CGNs מחושמלים בודדים מחלקי מוח של גור הניסוי, צלמו תמונות מחסנית Z במהירות של 0.5 מיקרומטר לערימה במיקרוסקופ קונפוקלי. תמונה תא אחד לכל חלון תמונה כדי לאפשר ניתוח תמונה קל ושחזור תלת-ממדי.
נתח את אורך הנוירוט ואת היווצרות הטופר הדנדריטי באופן עיוור באמצעות נותב נוריט פשוט. העלה תמונות Z-stack חד-ערוציות של CGNs מחושמלים לפיג'י ולחץ על תוספים"סגמנטציה" ו- Simple Neurite Tracer"בחר צור מציג תלת מימד חדש"מהתפריט הנפתח. גלול לבסיס של דנדריט המתחבר לסומה התא והתחל נתיב על ידי לחיצה על הצומת.
עקוב ידנית אחר הנתיב על-ידי לחיצה בין המקטעים שבהם אות מילוי התא בהיר ביותר והקשה על Y כדי לשמור על המעקב. עקבו עד סוף הדנדריט ואשרו את הנתיב על ידי לחיצה על F.לחלופין, עקבו עד לבסיס הטופר. לאחר מכן, עקוב אחר הטופר מבסיס המבנה עד סוף הנוריץ הארוך ביותר.
עקבו אחר ענפים משניים ושלישוניים על-ידי לחיצה ממושכת על Control בחלונות או ALT ב-macOS ולחיצה על הנתיב. אשר את הנתיב על-ידי הקשה על F.שים לב שהמדידות עבור העקבות גלויות בחלון נפרד. הוסף את כל הגדלים של ענפי הטופר כדי לקבל את האורך הכולל של כל טופר.
בניתוח המייצג, תמונות הקרנה של CGNs מחושמלים בין 3 ל -14 ימים לאחר ההזרקה הראו ירידה הדרגתית במספר הדנדריטים. CGNs עברו שלב של צמיחה דנדריטית ואחריה עידון מ 3 DPI ל 7 DPI שהביא לגיזום של יותר מ -50% של דנדריטים עודפים. אירוע זה עולה בקנה אחד עם התארכות הדרגתית של הסוכות הנותרות בהיווצרות מבנים דמויי טפרים בקצה כל דנדריט, דבר המצביע על כך שתהליכים התפתחותיים אלה מתרחשים במקביל.
על ידי 7 DPI, טפרים נמצאו על בערך 75% של דנדריטים. כל CGN שכותרתו שוחזר ב-NMRS כדי לכמת את שטח הפנים והנפח הסומטו-דנדריטי הכולל. לא נצפה הבדל משמעותי בגודל ה-CGN לאורך הפיתוח.
למרות שב-7 DPI, CGNs הציגו ירידה משמעותית של 20% בנפח בהשוואה ל-3, 5 ו-10 DPI. הדבר החשוב ביותר בהליך הוא לאתר במדויק את המוח הקטן לפני ההזרקה. השיטה יכולה להיות מותאמת למניפולציה גנטית של גנים in vivo כדי לחקור את תפקידם בהתפתחות נוירונים גרגיריים על ידי טרנספקציה של shRNAs, siRNAs, או Cre Recombinase.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לבחינת ההתפתחות המורפולוגית של נוירוני גרנולות במוחון (CGNs) במוחון של עכבר בשלבי התפתחות, באמצעות אלקטרופורציה in vivo. טכניקה זו מאפשרת סימון דליל ומניפולציה גנטית של CGNs, ובכך מאפשרת ניתוח מפורט של צמיחת דנדריטים, יצירת "טפרים" (claws) וסינפטוגנזה במהלך שלבי התפתחות מרכזיים. השיטה משלבת הזרקה מדויקת, דימיון קונפוקאלי וניתוח מורפומטרי כמותי למעקב אחר הבשלת ה-CGN לאורך זמן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה התפתחותית
- ביולוגיה של התא
רקע
- נוירונים עוברים שינויים מבניים ותפקודיים משמעותיים במהלך התפתחות המוח.
- המוח הקטן של מכרסמים מהווה מערכת מודל לחקר מורפוגנזה של תא בודד, ובמיוחד של CGNs.
- תאי CGNs יוצרים "טפרים" דנדריטיים ייחודיים החיוניים לקלט סינפטי.
- שיטות סימון מסורתיות לרוב אינן בעלות ספציפיות תאית או רזולוציה זמנית מספקת.
מטרת המחקר
- להדמיה וכמותית של ההתפתחות המורפולוגית של תאי CGNs בודדים in vivo.
- למעקב אחר צמיחת דנדריטים, גיזום ויצירת טפרים (claws) לאורך נקודות זמן התפתחותיות.
- לספק פלטפורמה למניפולציה גנטית תאית-אוטונומית של תאי CGNs.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- אלקטרפורציה in vivo של תאי פרוגניטור של נוירוני גרנולה בחרוך של עכבר בהתפתחות.
- סימון דליל של CGNs לצורך ניתוח מורפולוגי ברור.
- מיקרוסקופיה קונפוקלית עם דימות Z-stack לשחזור תלת-ממדי.
- מעקב ידני וכימות של אורך נויריטים ומבני טפרים דנדריטיים באמצעות Fiji ו-Simple Neurite Tracer.
תוצאות עיקריות
- תמונות השלכה מיום 3 עד 14 לאחר ההזרקה (DPI) חשפו ירידה הדרגתית במספר הדנדריטים לכל CGN.
- בין 3 ל-7 DPI, ה-CGNs עברו גיזום דנדריטי, אשר הסיר למעלה מ-50% מהדנדריטים העודפים.
- מבנים דמויי טופר נוצרו בקצות הדנדריטים שנותרו, כאשר טופרים נצפו בכ-75% מהדנדריטים עד ליום 7 DPI.
- גודל ה-CGN נשאר עקבי במידה רבה, אם כי נצפתה ירידה משמעותית של 20% בנפח ביום 7 DPI בהשוואה לנקודות זמן אחרות.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר ניתוח מפורט וספציפי-לתאים של ההתפתחות המורפולוגית של תאי CGN in vivo.
- גיזום דנדריטי ויצירת טפרים (claw formation) הם תהליכים מקבילים במהלך הבשלת תאי CGN.
- השיטה ניתנת להתאמה למניפולציה גנטית במטרה לחקור תפקוד של גנים בהתפתחות תאי CGN.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ניתוח כמותי in vivo של מורפולוגיית נוירוני גרנול של המוחדבב (CGN) ושל התפתחות סינפסתית נותן מענה לצורך קריטי בוודאות חיזוית לצורך תיקוף של מטרות נוירו-התפתחותיות. יכולות של סימון דליל ומניפולציה גנטית מאפשרות הפחתת סיכונים מכניסטית בשלבים המוקדמים ביותר של גילוי בתחום ה-CNS. גישה זו תומכת ברציפות תרגומית על ידי קישור מורפוגנזה תאית לאינטגרציה סינפטית, ובכך מספקת מידע לקבלת החלטות לגבי פורטפוליו במו"פ הממוקד בנוירוביולוגיה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של תפקוד גנים במורפוגנזה ובסינפטוגנזה של CGN.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בידוד השפעות אוטונומיות של תאים in vivo.
- מספק מדדים כמותיים לתיקוף מטרות המונחה-השערה.
- מסייע במיון מטרות של התפתחות עצבית על בסיס פנוטיפים מורפולוגיים וסינפטיים.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מכונן זרימות עבודה מאושרות וניתנות לשחזור עבור דימוי ואנליזה של מורפולוגיה נוירונלית.
- מספק מדדים כמותיים כגון מספר הדנדריטים, היווצרות "טפרים" (claw formation) ואורך הנויריטים לצורך סריקות המשך.
- מאפשר סטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות אנליזה מורפומטרית עיוורת בסיוע תוכנה.
- מכין מערכות ביולוגיות עמידות לסריקת תרכובות או סריקה גנטית בנתיבי עבודה של מערכת העצבים המרכזית (CNS).
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר בין פנוטיפים מורפולוגיים לבין התפתחות סינפטית רלוונטית למחלה במודלים של מכרסמים.
- תומך ברצף מהשלב המוקדם של הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של התערבויות נוירו-התפתחותיות.
- מספק פלטפורמה להערכת ביומרקרים תרגומיים של הבשלה סינפטית.
- מפחית סיכונים בשלב הקידום על ידי קישור שינויים תאיים לתוצאות סינפטיות תפקודיות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו משלבת שלבים החל מגילוי ראשוני ועד לזיהוי מולקולת מובילה במחקר של מערכת העצבים המרכזית (CNS), ובכך מאפשרת בדיקה חוזרת של השערות ואפיון פנוטיפי כמותי של התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערת האפס עבור תפקוד גנים במורפוגנזה נוירונלית וביצירת סינפסים.
- סריקה: מספק תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לניתוח מבנה דנדריטי וסינפטי.
- אנליטיקה: מספק מדידה מסוייגת (blinded) בעזרת תוכנה של אורך נוריטים, טפרים דנדריטיים ונפח תא.
- מחקר תרגומי: מקשר בין פנוטיפים תאיים להתפתחות סינפטית רלוונטית למחלה in vivo.
- שימוש חוזר ארגוני: ניתן להתאמה למניפולציות גנטיות מגוונות ומערכות מודל של CNS בתוכניות גילוי שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי בתיקוף מטרות נוירו-התפתחותיות ובצמצום סיכונים מכניסטיים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של דימיון in vivo וניתוח מורפומטרי לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go על ידי קישור הפרעה גנטית לפנוטיפים נוירונליים מדידים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) מותאם סיכון, בהסתמך על נתוני in vivo מהימנים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בנורו-אנטומיה של מכרסמים ובטכניקות מדויקות של הזרקה סטריאוטקטיות.
- דורש גישה למיקרוסקופיה קונפוקלית ולתוכנות מתקדמות לניתוח תמונות (למשל, Fiji, Simple Neurite Tracer).
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לצורך ניתוח עיוור ופרשנות של נתונים.
- ניתן להתאמה למבנים גנטיים שונים (shRNA, siRNA, Cre Recombinase) למחקרים תאיים-אוטונומיים.
- דיוק ההזרקה ויעילות סימון התאים קריטיים לקבלת תוצאות הניתנות לשחזור.
שאלות נפוצות על ביו-פרמה
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:39
Preparing the Injection Syringe for Electroporation
2:34
Results: Analysis of Granule Neuron Morphology and Size During Cerebellar Development
3:45
Conclusion
1:00
Morphological Analyses of Cerebellar Granule Neurons (CGNs): 3D Reconstruction
