Name: זיהוי חלבוני חסינות אנטיבקטריאליים ב- Escherichia coli באמצעות MALDI-TOF-TOF-MS/MS וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: למדו שיטה מהירה לזיהוי חלבוני חסינות אנטיבקטריאליים ב-Escherichia coli באמצעות MALDI-TOF-TOF-MS/MS וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה. הפרוטוקול משלב אינדוקציה אנטיביוטית ותוכנה ייעודית לזיהוי מדויק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

תוכנת מחפש סמן ביולוגי חלבון זמינה באופן חופשי (ללא עלות) על ידי יצירת קשר עם קליפטון ק. פג'רקוויסט בשעה clifton.fagerquist@usda.gov. אנו רוצים להכיר בתמיכה במחקר זה על ידי ARS, USDA, מענק CRIS: 2030-42000-051-00-D.

1. הכנת דגימה מיקרוביולוגית
<ol><li>לחסן 25 מ"ל של מרק לוריא (LB) בצינור חרוט 50 מ"ל עם E. coli O113:H21 זן RM7788 (או זן חיידקי אחר) ממלאי גליצל באמצעות לולאת μL סטרילית. מכסים את הצינור ואת טרום התרבות ב 37 °C (37 °F) עם רועד (200 סל"ד) עבור 4 שעות.</li>
	<li>Aliquot 100 μL של מרק מתורבת מראש להתפשט על צלחת אגר LB בתוספת 400 או 800 ng/mL של mitomycin-C. צלחות אגר תרבות סטטיות לילה באינקובטור ב 37 °C (50 °F). זהירות: זני STEC הם מיקרואורגניזמים פתוגניים. בצע את כל המניפולציות המיקרוביולוגיות, מעבר לכת, בארון בטיחות ביולוגית BSL-2.</li>
	<li>קציר תאים חיידקיים ממושבות גלויות בודדות באמצעות לולאת μL סטרילית של 1 μL ועבר לצינור מיקרוצנטריפוגה מצופה טבעת O בגודל 2.0 מ"ל המכיל 300 μL של מים באיכות HPLC. כיפה הצינור, מערבולת בקצרה, וצנטריפוגה ב 11,337 x g במשך 2 דקות כדי כדורי התאים.</li>
</ol>2. ספקטרומטריית מסה
<ol><li>ספוט 0.75 μL aliquot של supernatant מדגם על היעד MALDI נירוסטה ולאפשר לו להתייבש. לכסות את נקודת המדגם המיובש עם a0.75 μL aliquot של פתרון רווי של חומצה סינפינית ב 33% acetonitrile, 67% מים, 0.2% חומצה טריפלואורסטית. אפשר למקום להתייבש.</li>
	<li>לנתח את כתמי המדגם היבש באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-TOF-TOF.<ol>
<li>לאחר טעינת יעד MALDI לספקטרומטר המסה, לחץ על הלחצן עבור רכישת מצב ליניארי של MS בתוכנת הרכישה. הזן את טווח m/z שיש לנתח על-ידי הזנת m/z של הגבול התחתון והעליון (למשל, 2 kDa עד 20 kDa) לשדות המתאימים שלהם בתוכנת שיטת הרכישה.</li>
		<li>לחץ על הנקודה לדוגמה כדי להיות מנותח על תבנית היעד MALDI בתוכנה. לאחר מכן, הלחצו על לחצן העכבר השמאלי וגררו את סמן העכבר מעל הנקודה לדוגמה כדי לציין את האזור המלבני שיש לדגום עבור אבלציה/יינון בלייזר. שחרר את לחצן העכבר והרכישה תתחיל. לאסוף 1,000 יריות לייזר עבור כל מקום מדגם. הערה: רכישת נתונים מוצגת בזמן אמת בחלון רכישת התוכנה.</li>
		<li>אם לא מזוהים יונים, הגדל את עוצמת הלייזר על-ידי התאמת סרגל סולם הזזה תחת עוצמת לייזר בתוכנה עד לזיהוי אות החלבון יון. זה נקרא סף. הערה: לפני ניתוח נקודת המדגם, כייל חיצונית את המכשיר במצב ליניארי MS עם כיול חלבון אשר m / z משתרע על פני הטווח מנותח, למשל, +1 ו + 2 מטען מצבים של כיול חלבון: cytochrome-C, ליזוזים, ומיוגלובין לכסות טווח מסה של 2 kDa עד 20 kDa. מסת ביניים בטווח המסה שצוין משמשת כמסה ממוקדת, למשל, 9 kDa. מסת המיקוד היא היון שמ"ק שלו ממוקד באופן אופטימלי לזיהוי על ידי גלאי המצב הליניארי.</li>
		<li>לאחר השלמת רכישת המצב הליניארי של MS, לחץ על הלחצן עבור רכישת מצב רפלקטורון MS/MS בתוכנת הרכישה. הזן את מסת המבשר שיש לנתח בשדה מסה מבשר. לאחר מכן, הזן רוחב בידוד (ב- Da) לתוך חלון המסה של הקדמה עבור הצד המסה הנמוכה והגבוהה של המסה המבשרת, למשל, ±100 Da.</li>
		<li>לחץ על כפתור כיבוי CID. לחץ על לחצן מדכא Metastable ON. התאם את עוצמת הלייזר ל-90% לפחות מערכה המרבי על-ידי התאמת סרגל קנה המידה של ההזזה מתחת לעוצמת הלייזר בתוכנה.</li>
		<li>לחץ על הנקודה לדוגמה כדי להיות מנותח על תבנית היעד MALDI בתוכנה. לאחר מכן הלחצו את לחצן העכבר השמאלי וגררו את סמן העכבר מעל הנקודה לדוגמה כדי לציין את האזור המלבני שיש לדגום עבור אבלציה/יינון בלייזר. שחרר את לחצן העכבר והרכישה תתחיל. לאסוף 10,000 יריות לייזר עבור כל מקום מדגם. הערה: לפני ניתוח נקודת המדגם, המכשיר צריך להיות מכויל חיצונית במצב MS / MS-רפלקטורון באמצעות יונים קטע מריקבון לאחר המקור (PSD) של מצב הטעינה +1 של thioredoxin אלקילסין35.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אל תעבד נתוני MS גולמיים. עבד נתונים גולמיים MS/MS-PSD באמצעות רצף השלבים הבא בסדר שצוין: תיקון בסיסי מתקדם (32, 0.5, 0.0) ואחריו הסרת רעש (שתי סטיות תקן) ואחריו החלקה גאוסית (31 נקודות).</li>
	<li>בדוק באופן ידני נתוני MS/MS-PSD לנוכחות של יונים בולטים שנוצרו על-ידי PBC19,20.</li>
	<li>להעריך נתוני MS/MS ביחס לשפע המוחלט והיחסי של יונים מקוטעים והאות לרעש שלהם (S/N). השתמש רק ביונים השופעים ביותר לזיהוי חלבונים, במיוחד אם נתוני MS/MS-PSD רועשים.</li>
</ol>3. בבניית מסד נתונים של חלבון סיליקו
<ol><li>צור קובץ טקסט המכיל רצפי חלבון סיליקו של זן החיידקים, אשר יסרק על ידי תוכנת מחפש סמן ביולוגי חלבון לזיהוי החלבון. רצפי חלבונים נגזרים ריצוף גנום שלם (WGS) של הזן המנותח (או זן קשור קשר הדוק).</li>
	<li>גש לאתר NCBI/PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/) כדי להוריד כ-5,000 רצפי חלבונים של זן החיידקים הספציפי (למשל, Escherichia coli O113:H21 זן RM7788) מנותח. גודל ההורדה המרבי הוא 200 רצפים.<ol>
<li>כתוצאה מכך, העתק והדבק את 25 ההורדות בקובץ טקסט יחיד. בחר בתבנית FASTA (טקסט) עבור כל הורדה.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הפעלת תוכנה למחפש סמנים ביולוגיים של חלבון
<ol><li>לחץ פעמיים על קובץ ההפעלה של מחפש הסמן הביולוגי של חלבון. חלון ממשק משתמש גרפי (GUI) יופיע(איור 1, החלונית העליונה).</li>
	<li>הזן את המסה של הסמן הביולוגי של החלבון (כפי שהוא נמדד במצב MS-ליניארי) לשדה מסת חלבון בוגרת. לאחר מכן, הזן את שגיאת מדידת המסה בשדה 'רגישות למסה'. שגיאת מדידת המסה הסטנדרטית היא ±10 Da עבור חלבון 10,000 Da.</li>
	<li>לחלופין, לחץ על לחצן מחשבון מסת חלבון יון משלים b/y כדי לחשב את מסת החלבון מזוג יונים משלים של שברים (CFIP או b/y). חלון מוקפץ, כלי מחשבון מסת חלבון, יופיע(איור 1, החלונית התחתונה).<ol>
<li>הזן את m/z של CFIP putative ולחץ על לחצן הוסף זוג. מסת החלבון המחושבת תופיע.</li>
		<li>העתק והדבק מספר זה בשדה 'מסת חלבון בוגרת' וסגור את החלון 'הכלי מחשבון מסת חלבון'.</li>
	</ol></li>
	<li>בחר אורך פפטיד של אות N-מסוף על-ידי לחיצה על התיבה הגדר הגבלת שאריות. יופיע חלון מוקפץ עם קנה מידה וסמן הזזה. הזז את הסמן לאורך פפטיד האות הרצוי (מקסימום 50). אם לא נבחר אורך פפטיד של אותות, התוכנה תבצע רצף בלתי מוגבל.</li>
	<li>תחת מצב Ion שבר ב- GUI, בחר שאריות עבור מחשוף עמוד השדרה הפוליפפטיד (PBC). לחץ על הקופסאות של שאריות אחת או יותר: D, E, N ו/או P.<ol>
<li>לחץ על לחצן הזן יונים של קטעים (+1) לחיפוש. יופיע עמוד קטעים מוקפץ. לאחר מכן, לחץ על לחצן הוסף קטע יון, התואם למספר יונים מקטעים שיש להזין, כלומר, לחיצה אחת עבור כל יון קטע. יופיע שדה נפתח עבור הזנת כל יון קטע.</li>
		<li>הזן את m/z של יונים שבר ואת הסבילות m/z הקשורים שלהם. לאחר השלמת, לחץ על לחצן שמור וסגור. הערה: סובלנות סבירה m / z היא ±1.5.</li>
		<li>בחר את המספר המינימלי של יונים מקוטעים שיש להתאים לזיהוי על-ידי גלילה למספר הרצוי בתיבה שמימין למספר Ions קטעים שיש להתאים. הערה: שלושה משחקים צריכים להיות מספיקים.</li>
		<li>בחר שאריות ציסטאין להיות במצבם החמוץ על ידי לחיצה על המעגל המתאים. אם לא נמצאו זיהויי חלבון לאחר החיפוש, חזור על החיפוש עם cysteines במצבם המופחת. אם לא נמצאו זיהויים לאחר החיפוש, הרחב את הסבילות ליונים של הקטע ל- ±3 וחזור על החיפוש.</li>
	</ol></li>
	<li>תחת הגדרת הקובץ, לחץ על לחצן בחר קובץ FASTA כדי לעיין ולבחור את הקובץ FASTA (טקסט) המכיל את רצפי חלבון סיליקו של זן החיידקים שנבנה בעבר בשלבי פרוטוקול 3.1 עד 3.2. לאחר מכן בחר תיקיית פלט וצור שם קובץ פלט.</li>
	<li>לחץ על לחצן הפעל חיפוש בערכי קבצים. יופיע חלון מוקפץ שכותרתו אישור פרמטרי חיפוש (איור 1, החלונית התחתונה), המציג את פרמטרי החיפוש לפני תחילת החיפוש.</li>
	<li>אם פרמטרי החיפוש נכונים, לחץ על לחצן התחל חיפוש. אם פרמטרי החיפוש אינם נכונים, לחץ על לחצן ביטול והזן מחדש את הפרמטרים הנכונים. לאחר תחילת החיפוש, חלון הפרמטר נסגר ומופיע חלון מוקפץ חדש עם מד התקדמות(איור 1, החלונית התחתונה) המציג את התקדמות החיפוש וספירה רצה של מספר הזיהויים שנמצאו.</li>
	<li>עם השלמת החיפוש (מספר שניות), מד ההתקדמות נסגר באופן אוטומטי וסיכום החיפוש מוצג בשדה יומן הרישום של ה- GUI (איור 2, החלונית העליונה). בנוסף, יופיע גם חלון מוקפץ חדש המציג את זיהוי החלבון אם בכלל (איור 2, החלונית התחתונה). הערה: ברצפי חלבון סיליקו בעלי שאריות לא מזוהות, למשל, U או X, מדלגים באופן אוטומטי מהניתוח ורצפים אלה מדווחים לאחר מכן עם חלון מוקפץ נפרד כדי להתריע בפני המפעיל על אילו רצפים (אם בכלל) דילגו עם השלמת החיפוש.</li>
</ol>5. אישור לאחר החיפוש של רצף החלבון
<ol><li>אשר את הנכונות של רצף מועמדים על ידי ניתוח ידני. הערה: מטרת התוכנה מחפש סמן ביולוגי חלבון היא לזהות רצף חלבון עם דיוק גבוה על ידי ביטול רצפי חלבון שגויים רבים מן השיקול ושילוב רצף גיזום כ- PTM אפשרי בחלבון הבוגר. מכיוון שמספר רצפי המועמדים האפשריים המוחזרים הוא מעט, ניתן לניהול באישור ידני.</li>
	<li>צור טבלה של m/z הממוצע של ions קטע מסוג b ו- y של רצף המועמדים באמצעות כל ספקטרומטריית מסה או תוכנה פרוטאומית בעלת פונקציונליות כזו. השווה את m/z הממוצע של יונים שבר סיליקו בצד C-מסוף של D-, E-, ו- N-שאריות (ועל צד N-מסוף של שאריות P) כדי m /z של יונים שבר בולטים מנתוני MS / MS-PSD. הערה: יש להתאים בקלות את יוני הרסיסים הבולטים ביותר של MS/MS-PSD ל- D-, E-ו- N המשויכים ליונים של שבר סיליקו. עם זאת, מנגנון פיצול אפקט חומצה אספרטית הוא פחות יעיל ליד N- או C-termini של רצף חלבון36.</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי אינטרסים.

שיקולי פרוטוקול החוזקות העיקריות של הפרוטוקול הנוכחי הן המהירות, הפשטות של הכנת המדגם, ושימוש במכשיר קל יחסית לתפעול, להיות מאומן ולתחזק. למרות שניתוח פרוטאומי מלמטה למעלה ולמעלה למטה על ידי כרומטוגרפיה נוזלית-ESI-HR-MS נמצאים בכל מקום ועליונות בהרבה במובנים רבים מלמעלה למטה על ידי MALDI-TOF-TOF, הם דורשים יותר זמן, עבודה ומומחיות. מורכבות מכשירים יכולה לעתים קרובות להשפיע אם פלטפורמות מכשירים מסוימות צפויות להיות מאומצות על ידי מדענים שאינם מאומנים באופן רשמי בספקטרומטריית מסה. הגישה מלמעלה למטה עם M...

ניתוח וזיהוי של חלבונים לא מעוכאים על ידי ספקטרומטריית מסה מכונה ניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה1,2,3,4. זוהי כעת טכניקה מבוססת המשתמשת יינון אלקטרו-ספריי (ESI)5 ומנתחי מסה ברזולוציה גבוהה6, וטכניקות דיסוציאציה מתוחכמות, למשל, דיסוציאציה להעברת אלקטרונים (ETD), דיסוציאציה לכידת אלקטרונים (ECD)7, דיסוציאציה פוטו-דיסוציאציה אולטרה סגולה (UV-PD)8,וכו '.
טכניקת היוניזציה הרכה האחרת היא desorption/ יינון לייזר בסיוע מטריצה (MALDI)9,10,11 כי כבר פחות נרחב בשימוש לניתוח מלמעלה למטה, בין היתר משום שהוא מצמיד בעיקר מנתחי מסה זמן טיסה (TOF), אשר יש רזולוציה מוגבלת לעומת מנתחי מסה אחרים. למרות מגבלות אלה, מכשירי MALDI-TOF ו- MALDI-TOF-TOF נוצלו לניתוח מהיר מלמעלה למטה של חלבונים טהורים ותערובות מופרדות ולא מופות של חלבונים. לזיהוי חלבונים טהורים, ריקבון במקור (ISD) היא טכניקה שימושית במיוחד מכיוון שהיא מאפשרת ניתוח ספקטרומטריית מסה (MS) של יונים של שברי ISD, כמו גם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית (MS/MS) של שברי יון חלבון המספקים שבר ספציפי לרצף לעתים קרובות מה- N- ו- C-termini של חלבון היעד, בדומה לרצף אדמן12,13 . החיסרון בגישת ISD הוא, כמו ברצף אדמן, המדגם חייב להכיל רק חלבון אחד. דרישת החלבון האחת נובעת מהצורך בייחוס חד משמעי של יונים מקובעים ליון מקדים. אם שני חלבונים או יותר נמצאים במדגם, ייתכן שיהיה קשה להקצות אילו יונים מקדים שייכים לאיזה יונים קודמים.
ניתן לטפל בייחוס יון יון/מבשר באמצעות MALDI-TOF-TOF-MS/MS. כמו בכל ניסוי קלאסי של MS/MS, יונים קודמים נבחרים/מבודדים במסה לפני הפיצול, וניתן לייחס את יונים השברים שזוהו ליון מקדים ספציפי. עם זאת, טכניקות הניתוק הזמינות לגישה זו מוגבלות בעיקר לניתוק המושרה בהתנגשות אנרגיה גבוהה (HE-CID)14 או ריקבון לאחר המקור (PSD)15,16. HE-CID ו PSD הם היעילים ביותר בפיצול פפטידים וחלבונים קטנים, ואת כיסוי הרצף יכול, במקרים מסוימים, להיות מוגבל. בנוסף, PSD תוצאות מחשוף עמוד השדרה פוליפפטיד (PBC) בעיקר בצד C-מסוף של שאריות חומצה אספרטית וגלוטמית על ידי תופעה הנקראת אפקט חומצה אספרטית17,18,19,20.
MALDI-TOF-MS מצא גם יישום נישה בזיהוי טקסונומי של מיקרואורגניזמים: חיידקים21, פטריות22, ווירוסים23. לדוגמה, ספקטרום MS משמש לזיהוי חיידקים לא ידועים בהשוואה לספריית ייחוס של ספקטרום MS של חיידקים ידועים באמצעות אלגוריתמים לזיהוי דפוסים לשם השוואה. גישה זו הוכיחה את עצמה כמוצלחת מאוד בגלל המהירות והפשטות שלה, אם כי דורשת פולחן בן לילה של הבידוד. יונים חלבון שזוהו על ידי גישה זו (בדרך כלל תחת 20 kDa) מורכב טביעת אצבע MS המאפשר רזולוציה טקסונומית ברמת הסוג והמינים ובמקרים מסוימים בתת מינים24 ורמתזן 25,26. עם זאת, עדיין יש צורך לא רק לסווג טקסונומית מיקרואורגניזמים פתוגניים, אלא גם לזהות גורמי וירוליציה ספציפיים, רעלים, וגורמי התנגדות מיקרוביאלית (AMR). כדי להשיג זאת, המסה של פפטידים, חלבונים, או מולקולות קטנות נמדדים על ידי MS ולאחר מכן מבודדים ומפוצלים על ידי MS / MS.
חיידקים פתוגניים נושאים לעתים קרובות חתיכות עגולות של DNA הנקראות פלסמידים. פלסמידים, יחד עם פרופג'ים, הם וקטור מרכזי של העברת גנים אופקית בין חיידקים ואחראים להתפשטות המהירה של עמידות מיקרוביאלית וגורמי אלימות אחרים על פני חיידקים. פלסמידים עשויים גם לשאת גנים אנטיבקטריאליים (AB), למשל, קוליצין ובקטריוצין. כאשר גנים אלה באים לידי ביטוי והחלבונים מופרשים, הם פועלים כדי להשבית את מכונות תרגום החלבון של חיידקים שכנים הכובשים את אותה נישה סביבתית27. עם זאת, אנזימים חיידקיים אלה יכולים גם להוות סיכון לפונדקאי שייצר אותם. כתוצאה מכך, גן מתבטא במשותף על ידי המארח המעכב באופן ספציפי את תפקודו של אנזים AB ומכונה חלבון החסינות שלו (Im).
אנטיביוטיקה מזיקה לדנ"א כגון mitomycin-C וציפרופלוקסצין משמשות לעתים קרובות כדי לגרום לתגובת SOS ב- E. coli המייצר רעלן Shiga (STEC) שהגן שלו רעלן שיגה(STX) נמצא בתוך גנום פרופג 'הנמצא בגנום החיידקי28. השתמשנו באינדוקציה אנטיביוטית, MALDI-TOF-TOF-MS/MS, וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה בעבר כדי לזהות ולזהות סוגי Stx וסוגי משנה המיוצרים על ידי זני STEC29,30,31,32. בעבודה הקודמת, STEC O113:H21 זן RM7788 היה תרבותי בן לילה על תקשורת אגר בתוספת mitomycin-C. עם זאת, במקום לזהות את B-subunit הצפוי של Stx2a ב m / z ~7816, יון חלבון שונה זוהה ב m / z ~ 7839 וזוהה כחלבון היפותטי מקודד פלסמיד של פונקציה לא ידועה33. בעבודה הנוכחית, זיהינו שני חלבוני AB-Im מקודדים פלסמיד המיוצרים על ידי זן זה באמצעות אינדוקציה אנטיביוטית, MALDI-TOF-TOF-MS/ MS, וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה באמצעות תוכנה עצמאית שפותחה לעיבוד וסריקה ברצפי חלבון סיליקו המופקים מרצף גנום שלם (WGS). בנוסף, האפשרות של שינויים לאחר התרגום (PTM) מעורבים truncation רצף שולבו בתוכנה. חלבוני החסינות זוהו באמצעות תוכנה זו מהמסה הנמדדת של יון החלבון הבוגר ויוני שבר ספציפיים לרצף מ- PBC שנגרמו על ידי אפקט החומצה אספרטית וזוהו על ידי MS/ MS-PSD. לבסוף, מקדם זוהה במעלה הזרם של הגנים AB / Im בגנום plasmid שעשוי להסביר את הביטוי של גנים אלה כאשר זן זה נחשף לאנטיביוטיקה מזיקה ל- DNA. חלקים מעבודה זו הוצגו בכנס הווירטואלי של האגודה האמריקנית הלאומית לכימיה בסתיו 2020 (17-20 באוגוסט 2020)34.

<table><tbody><tr><td>4000 סדרת Explorer תוכנה</td><td>AB Sciex</td><td>גרסה 3.5.3</td><td></td></tr><tr><td>4800 פלוס MALDI TOF / TOF מנתח</td><td>AB Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile Optima LC / MS כיתה</td><td>פישר כימי</td><td>A996-1</td><td></td></tr><tr><td>BSL-2 קבינט ביולוגי</td><td>חברת בייקר</td><td>SG403A-HE</td><td></td></tr><tr><td>ציטוכרום-C</td><td>סיגמא</td><td>C2867-10MG</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת סייר נתונים</td><td>AB Sciex</td><td>גרסה 4.9</td><td></td></tr><tr><td>ערכת הפחתת חלבון פוקוס - אלקילציה</td><td>G-Biosciences</td><td>786-231</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת GPMAW</td> נתוני <td>מגדלור</td><td>גרסה 10.0</td><td></td></tr><tr><td>חממה</td><td>VWR</td><td>9120973</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar</td><td>Invitrogen</td><td>22700-025</td><td></td></tr><tr><td>Luria Broth</td><td>Invitrogen</td><td>12795-027</td><td></td></tr> צינורות מיקרוצנטריפוגה <tr><td>Lysozyme</td><td>Sigma</td><td>L4919-1G</td><td></td></tr><tr><td>, 2 מ"ל, פקק בורג, טבעת O</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>02-681-343</td><td></td></tr><tr><td>MiniSpin Plus צנטריפוגה</td><td>אפנדורף</td><td>22620207</td><td></td></tr><tr><td>מיטומיצין-C (מסטרפטומיצס)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M0440-5MG</td><td></td></tr><tr><td>מיוגלובין</td><td>סיגמא</td><td>M5696-100MG</td><td></td></tr><tr><td>שייקר MaxQ 420HP דגם 420</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>דגם 420</td><td></td></tr><tr><td>חומצה סינאפית</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>1861580</td><td></td></tr><tr><td>סטרילי 1 uL לולאות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-363-595</td><td></td></tr><tr><td>תיורדוקסין (E. coli, רקומביננטי)</td> <td>Sigma</td><td>T0910-1MG</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריפלואורואצטית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>299537-100 גרם</td><td></td></tr><tr><td>מים אופטימה LC/MS כיתה</td><td>פישר כימיקל</td><td>W6-4</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי חלבוני חסינות אנטיבקטריאליים ב- escherichia coli באמצעות maldi-tof-tof-ms/ms וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

פרוטוקול זה מזהה את חלבוני החסינות של אנזימי החיידקים: קוליצין E3 ובקטריוצין, המיוצר על ידי זן Escherichia coli פתוגניים באמצעות אינדוקציה אנטיביוטית, וזוהה על ידי ספקטרומטריית מסה דו-מושבית MALDI-TOF-TOF וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה עם תוכנה שפותחה בתוך הבית. חלבון החסינות של קוליצין E3 (Im3) וחלבון החסינות של בקטריוצין (Im-Bac) זוהו מיונים בולטים מסוג b ו/או y שנוצרו על ידי מחשוף עמוד השדרה הפוליפפטיד (PBC) בצד ה- C-מסוף של חומצה אספרטית, חומצה גלוטמית ושאריות אספרגין על ידי מנגנון הפיצול של אפקט חומצה אספרטית. התוכנה סורקת במהירות רצפי חלבון סיליקו שמקורם ברצף הגנום כולו של זן החיידקים. התוכנה גם מסירה באופן איטרטיבי שאריות חומצת אמינו של רצף חלבון במקרה שרצף החלבון הבוגר נחתך. רצף חלבונים יחיד היה בעל מסה ורסיסים בקנה אחד עם אלה שזוהו עבור כל חלבון חסינות. לאחר מכן נבדק רצף המועמדים באופן ידני כדי לאשר שניתן להקצות את כל יונים הרסיסים שזוהו. המתיונין N-terminal של Im3 הוסר לאחר התרגום, ואילו לאים-באק היה את הרצף המלא. בנוסף, מצאנו כי רק שניים או שלושה יונים שבר לא משלימים שנוצרו על ידי PBC נחוצים כדי לזהות את רצף החלבון הנכון. לבסוף, מקדם (תיבת SOS) זוהה במעלה הזרם של הגנים האנטיבקטריאליים והחסינות בגנום פלסמיד של זן החיידקים.

איור 3 (פאנל עליון) מציג את MS של STEC O113:H21 זן RM7788 מתורבת בן לילה על LBA בתוספת 400 ng / mL mitomycin-C. פסגות ב m/ z 7276, 7337, ו 7841 זוהו בעבר כמו חלבון הלם קר C (CspC), חלבון הלם קר E (CspE), וחלבון נישא פלסמיד של פונקציה לא ידועה, בהתאמה33. יון החלבון ב-m/z 9780 [M+H]+ נותח על-ידי MS/MS-PSD כפי שמוצג באיור 3 (החלונית התחתונה). יון המבשר היה מבודד עם חלון בורר יונים מתוזמן (TIS) ±100 Da. ions קטעים מזוהים על-ידי m/z...

כאן אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי מהיר של חלבונים המיוצרים על ידי חיידקים פתוגניים ברצף גנומי באמצעות ספקטרומטריית מסה יחד MALDI-TOF-TOF וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה עם תוכנה שפותחה בתוך הבית. שבר יונים חלבון Metastable בגלל אפקט חומצה אספרטית וספציפיות זו מנוצל לזיהוי חלבון.

זיהוי חלבוני חסינות אנטיבקטריאליים ב- Escherichia coli באמצעות MALDI-TOF-TOF-MS/MS וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

הפרוטוקול מדגים שיטה מהירה לזיהוי חלבונים חיידקיים באמצעות אינדוקציה אנטיביוטית וספקטרומטריית מסה. היתרון העיקרי של הטכניקה הוא מהירות ופשטות. הכנת מדגם אינה מסובכת.הטכניקה יכולה להיות מורחבת לאפיון של כל חיידקים פתוגניים, כגון גורמי ארס או עמידות לאנטיביוטיקה כדי ליידע טוב יותר טיפול מתאים לזיהום חיידקי. כדי להתחיל, השתמש בלולאת מיקרוליטר סטרילית אחת כדי לקצור חיידקים ממושבות בודדות הגדלות על צלחת אגר LB. ולהעביר לצינור מיקרוצנטריפוגה עם 2 מיליליטר עם מכסה בורג המכיל 300 מיקרוליטרים של מים באיכות HPLC.לאחר מכן מערבולת לזמן קצר את הצינור ואת הכדור את התאים על ידי צנטריפוגה, ב 0.75 מיקרוליטר שריד מים של supernatant מדגם על יעד MALDI נירוסטה, ולאפשר לו להתייבש. לכסות את נקודת המדגם המיובשת עם 0.75 microliters של פתרון רווי של חומצה סינפינית מוכן 33%acetonitrile, 67%מים, ו 0.2% חומצה טריפלואורואצטית, ולאפשר את המקום להתייבש. ברגע שהנקודה מתייבשת, טען את המטרה בספקטרומטר המסה.פתח את תוכנת הרכישה ולחץ על רכישת מצב ליניארי של MS או על טווח טעינה המונית ונפח לטעינה המונית של הגבולות התחתונים והעליון לשדות המתאימים שלהם. לחץ על הנקודה לדוגמה כדי להיות מנותח על תבנית היעד MALDI. לאחר מכן הלחצו את לחצן העכבר השמאלי וגררו את הסמן מעל הנקודה לדוגמה כדי לציין את האזור המלבני שיש לדגום עבור אבלציה או יינון בלייזר.שחרר את לחצן העכבר כדי ליזום את הרכישה ולאסוף 1000 צילומי לייזר עבור כל נקודה לדוגמה. אם יונים אינם מזוהים להגדיל את עוצמת הלייזר על ידי התאמת סרגל סולם הזזה תחת עוצמת לייזר עד אות יון חלבון מזוהה. לאחר השלמת רכישת מצב ליניארי של MS, לחץ על רכישת מצב רפלקטורון MS/MS.הזן את מסת המבשר שיש לנתח בשדה מסה מבשר. לאחר מכן, הזן רוחב בידוד בדלטון בחלון המסה של הקדמה עבור הצד המסה הנמוכה והגבוהה של המסה המבשרת. לחץ על לחצן כיבוי CID.לאחר מכן לחץ על לחצן מדכא Metastable בהפעלה. התאם את עוצמת הלייזר ל-90% לפחות מהערך המרבי שלו על-ידי התאמת סרגל קנה המידה של ההזזה כפי שהודגם. לחץ על הנקודה לדוגמה שיש לנתח בתבנית היעד של MALDI, ולאחר מכן לחץ על לחצן העכבר השמאלי וגרור את הסמן מעל הנקודה לדוגמה כדי לציין את האזור המלבני שיש לדגום עבור אבלציה או יינון בלייזר, שחרר את לחצן העכבר כדי ליזום את הרכישה ולאסוף 10, 000 צילומי לייזר עבור כל נקודה לדוגמה כפי שהודגם.לחץ פעמיים על קובץ ההפעלה של מחפש הסמן הביולוגי של חלבון, וחלון ממשק המשתמש הגרפי יופיע. הזן את המסה של הסמן הביולוגי של החלבון בשדה מסת חלבון בוגר, ואת שגיאת מדידת המסה בשדה סובלנות המונית. לחלופין, לחצו על כפתור מחשבון מסת חלבון החלבון המשלים b/y כדי לחשב את מסת החלבון מזוג יונים של שברים משלימים, והחלון הנפתח של כלי מחשבון מסת החלבון יופיע.הזינו את יחס המסה לטעינה של זוג היונים של שברים משלימים, לחצו על הכפתור 'הוסף זוג' ומסת חלבון מחשבון תופיע. העתק הדבק ערך זה בשדה מסת חלבון בוגרת וסגור את חלון הכלי מחשבון מסת חלבון. לחץ על התיבה הגדר הגבלת שאריות.בחר את אורך הפפטיד של אות מסוף הסיום, והחלון המוקפץ עם קנה מידה הזזה והסמן יופיע ויזיז את הסמן לאורך הפפטיד הרצוי. אם אורך הפפטיד של האות לא נבחר, תבוצע רצף בלתי מוגבל על-ידי התוכנה. תחת מצב יון קטע, בחר את שאריות עבור מחשוף עמוד השדרה של פוליפפטיד על-ידי לחיצה על התיבות של שאריות אחת או יותר, D-E-N ו/או P.ולאחר מכן לחץ על לחצן הזן יונים מקטעים פלוס אחד לחיפוש, ודף הקטע המוקפץ יופיע.לחיצה נוספת על לחצן הוסף יון קטע, ושדה נפתח יופיע עבור כל יון קטעים להזנה. הזן את המסה לפי יחסי טעינה של יונים שבר והמסה המשויכת שלהם על ידי עמידות מטען. לאחר מכן לחץ על לחצן שמור וסגור.בתיבה השמאלית של כמה שברים יונים צריך להיות תואם, גלול כדי לבחור את המספר המינימלי של יונים שבר שיש להתאים לזיהוי, ובחר את שאריות ציסטאין במצבם החמומצן. אם החלבונים אינם מזוהים לאחר החיפוש, חזור על החיפוש עם cysteines במצבם המופחת. תחת הגדרת הקובץ, לחץ על סמל קובץ SELECT FASTA כדי לעיין ולבחור את קובץ FASTA המכיל את רצפי חלבון סיליקו של זן החיידקים שנבנה בעבר.לאחר מכן בחר תיקיית פלט וצור שם קובץ פלט. לחץ על הסמל הפעל חיפוש בערכי קבצים. יופיע חלון מוקפץ שכותרתו אישור פרמטרי חיפוש המציגים את פרמטרי החיפוש לפני תחילת החיפוש.ואם פרמטרי החיפוש נכונים, לחץ על התחל חיפוש. אם הפרמטרים שגויים, לחץ על ביטול והזן מחדש את הפרמטרים הנכונים. לאחר תחילת החיפוש, חלון הפרמטר ייסגר ויופיע חלון מוקפץ חדש עם מד התקדמות, המציג את התקדמות החיפוש וספירה רצה של מספר הזיהויים שנמצאו.עם השלמת החיפוש, מד ההתקדמות ייסגר באופן אוטומטי, וסיכום החיפוש יוצג בשדה יומן הרישום של ממשק המשתמש הגרפי יחד עם חלון מוקפץ חדש המציג את זיהויי החלבון שנמצאו. במחקר הנוכחי, תרביות חיידקים גדלו LB עם שני ריכוזים שונים של mytomycin-C. הספקטרום ההמוני של תרבית החיידקים גדל עם ריכוז מיטומיצין-C.חלבון הלם קר C, חלבון הלם קר E, וחלבון נישא פלסמיד של תפקוד לא ידוע זוהו. יון החלבון הלא ידוע ב-9780 נותח על ידי טרשת נפוצה, והיון המבשר היה מבודד עם חלון בורר יונים של כ-100 דלטון. יון השבר במסה לטעון 9675.9 הוא שפיכה מן הניתוק של יון חלבון metastable ב 9655.הרצף של חלבון החסינות עבור קולצין E3 מכיל שאריות בסיסיות אתרים אפשריים של יינון. יונים שבר זוהה מ מחשוף עמוד השדרה הפוליפפטיד, כאשר הצורה המופחתת של ציסטאין שימשה במהלך החיפוש. מת'ionine N-מסוף מוסר כשינוי תרגום לאחר.כאשר התרבות החיידקית גדלה בריכוז מיטומיצין-C גבוה, זוהה חלבון החסינות של הבקטריוצין. השיא הלא ידוע ב-9651 נותח על ידי MS/MS, והיון הקדמון היה מבודד עם חלון TIS צר יותר ואסימטרי של מינוס 75 ועוד 60 דלטון. רצף חלבון החסינות של בקטריוצין מכיל שאריות בסיסיות אתרים אפשריים של יינון.יונים שבר זוהה מ מחשוף עמוד השדרה הפוליפפטיד, כאשר הצורה המופחתת של ציסטאין שימשה במהלך החיפוש. עם הריכוזים השונים של אנטיביוטיקה, שפע חלבון יחסי עשוי להשתנות. ואלה נותחו באמצעות ספקטרומטריית מסה.בעת קצירת תאים חיידקיים, התבונן במורפולוגיה של המושבה ובצמיחה חיידקית ביחס לאנטיביוטיקה וריכוז. לולאת מיקרוליטר אחת של תאים נחוצה כדי לזהות חלבונים.

identification-antibacterial-immunity-proteins-escherichia-coli-using

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

תרכובות לכידת הם מולקולות קטנות trifunctional כדי להפחית את המורכבות של proteome על ידי תפקודית אינטראקציה הפיך מולקולות חלבון קטן ואחריו crosslinking-צילום טיהור. כאן אנו משתמשים מתחם לכידת...

פרופיל של Methyltransferases ועל אחרים S-Adenosyl- L-הומוציסטאין מחייב חלבונים על ידי ספקטרומטריית מתחם המיסה לכידה (CCMS)

טיהור זיקה של חלבונים מתויגים בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (APMS) היא שיטה רבה עצמה למיפוי השיטתי של רשתות אינטראקצית חלבון ועל חקירת הבסיס המכאני של תהליכים ביולוגיים. כאן, אנו מתארים פפטיד הליך אופטימיזציה רציפת זיקה (SPA) APMS פתח...

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

היישום של desorption זמן בסיוע מטריקס לייזר / יינון של טיסה (MALDI-TOF) ספקטרומטריית מסה (MS) ישירות למרק תרבות דם מזרז את זיהוי של חיידקים. השיטה שהוצגה היא שיטה מהירה ואמינה לזיהוי של חיידקים גראם שליליים ישירות ממרק תרבות דם.

זיהוי מהיר של חיידקים גראם שליליים מהדם תרבות מרק שימוש MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

זמן ספיגה/יינון לייזר בסיוע מטריקס של ספקטרומטריית מסה של טיסה (MALDI-TOF MS) וטכניקות מולקולריות (ריצוף גנים 16S rRNA) מאפשרות זיהוי של פתוגנים חיידקיים נדירים באבחון שגרתי. מטרת פרוטוקול זה טמונה בשילוב של שתי הטכניקות מה שמוביל לנתונים מדויקים ואמינים יותר.

זיהוי של חיידקים פתוגנים נדירים לפי 16S rRNA ג&#39;ין סידור MALDI-TOF MS

Phyloproteomics Mass מבוסס ספקטרומטריית (MSPP) שמש להקליד אוסף של SSP jejuni קמפילובקטר. Doylei מבודד ברמת הזן בהשוואת הקלדת רצף multilocus (MLST).

תת-סוגים של<em&gt; Jejuni קמפילובקטר</em&gt; SSP.<em&gt; doylei</em&gt; המבודד באמצעות ספקטרומטריית מסה מבוססת PhyloProteomics (MSPP)

אנו מציגים פרוטוקול מדויק quantitate חלבונים עם תוויות isobaric, fractionation נרחב, ושפור צעדים בקרת איכות בשילוב עם כרומטוגרפיה נוזלית לממשק כדי בספקטרומטר ברזולוציה גבוהה.

פרוטאום עמוק פרופיל על ידי תיוג Isobaric, מקיף כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטר מסה תוכנה בסיוע כמת

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנטר את הרכבה ופירוק של הרעלן גחלת באמצעות biolayer אינטרפרומטריה (בלי). בעקבות הרכבה/פירוק על פני ביוסנסור, משתחררים את מתחמי חלבון גדולה מפני השטח עבור פריט חזותי וזיהוי של רכיבי מתחמי באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני ו ספקטרומטר מסה, בהתאמה.

ניתוח דינאמי חלבון מתחמי נאסף בנושא ושוחרר מן Biolayer אינטרפרומטריה ביוסנסור באמצעות ספקטרומטר מסה ואלקטרון

פרוטוקול מפורט מתואר את ההפרדה, זיהוי של אפיון proteoforms דגימות חלבון באמצעות נימי אזור אלקטרופורזה-ספקטרומטריית electrospray יינון-טנדם ספקטרומטר מסה (CZE-ESI-MS/MS). הפרוטוקול יכול לשמש עבור אפיון ברזולוציה גבוהה proteoforms דגימות חלבון וזיהוי בקנה מידה גדול של proteoforms בדגימות פרוטאום מורכבים.

בקנה מידה גדול פרוטאומיקס מלמעלה למטה באמצעות ספקטרומטר מסה של טנדם אלקטרופורזה של אזור נים

פרוטוקול זה מכסה ניתוח מפורט של הרכב פפטידוגליקן באמצעות ספקטרומטריית מסה של כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם מיצוי תכונות מתקדם ותוכנת ניתוח ביואינפורמטיקה.

ניתוח כמותי למחצה של פפטידוגליקן על ידי כרומטוגרפיה נוזלית, ספקטרומטריית מסה וביואינפורמטיקה

פרוטוקול זה מאפשר הערכה מהירה וחסכונית של הרכב החיידקים במוצרי חלב על ידי שילוב קולטורומיקה עם MALDI-TOF MS. הוא מספק תוצאות טקסונומיה דומות לריצוף 16S rRNA עם זמן אספקה קצר יותר משיטות תרבית מסורתיות.

הערכת בטיחות מיקרוביאלית של מחלבות באמצעות פרופיל פרוטאומי חיידקי באמצעות גישת MALDI

למדו שיטה מהירה לזיהוי חלבוני חסינות אנטיבקטריאליים ב-Escherichia coli באמצעות MALDI-TOF-TOF-MS/MS וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה. הפרוטוקול משלב אינדוקציה אנטיביוטית ותוכנה ייעודית לזיהוי מדויק.

זיהוי חלבוני חסינות אנטיבקטריאליים ב- Escherichia coli באמצעות MALDI-TOF-TOF-MS/MS וניתוח פרוטאומי מלמעלה למטה

גלה סרטונים נוספים