מבחר ננו-בודיות מעכבות ממוקדות טרנספורטר על-ידי אלקטרופיזיולוגיה מבוססת ממברנה מוצקה (SSM)

הפרוטוקול המוצג משמש לבדיקה וזיהוי של ננו-בודיות מעכבות ולא מעכבות המתמקדות במשגרים אלקטרוגניים המשוחזרים בפרוטוליפוזומים או נמצאים בשלפוחיות ממברנה. עיצוב עבירות יכול להיות קשה במקרים מרובים, במיוחד אם מצעים מסומנים אינם זמינים. אם אותה אלקטרופיזיולוגיה מאפשרת לחקור את ההשפעה של ננו-בודיות על ההובלה עבור כמעט כל משגר אלקטרוגני, מכיוון שאלקטרופיזיולוגיה של SSM אינה דורשת מצעים מסומנים.

ננו-בונים נחקרו על השימוש בהם ביישומים רפואיים. טכניקה זו יכולה לעזור לסנן מעכבים פוטנציאליים מיקוד מובילים אלקטרוגניים ספציפיים של בני אדם או פתוגנים אנושיים. כדי להתחיל, לקחת 10 צינורות נקיים ולהעביר 10 מיליליטר של קרום מוצק הנתמך ללא הפעלה, או SSM, חוצץ לתוך כל צינור.

כדי להכין את מאגרי SSM הפעלת, להוסיף את המצע לתוך הצינורות באמצעות סדרה של ריכוזים סביב הריכוז המקסימלי חצי הצפוי. הפעל את תוכנת ה- SSM ותן למחשב לאתחל באופן אוטומטי. הגדר את נתיב השמירה עבור נתונים.

אשר על-ידי לחיצה על לחצן אישור. בחר את פרוטוקול הניקוי ההתחלתי הרגיל באפשרויות זרימת העבודה ולחץ על הפעל. לאחר מכן, הר את השבב מצופה פרוטאוליפום על השקע.

תזיז את הזרוע כדי לנעול את השבב. הקף את השבב הרכוב עם המכסה. בחר את התוכנית CapCom בזרימת העבודה, ותן לה לפעול כדי לקבוע את המוליכות והקיבות.

אשר כי המוליכות היא מתחת לחמישה ננומינים ואת הקיבול הוא בין 15 ל 35 nanofarad לפני השימוש בו למדידה. העבר את פתרונות ההפעלה לבקבוקונים ומיקם את המאגרים בסמפלר הבדיקה. מעבירים את המאגר הלא-הפעלה למאגר ומניחים אותו ליד מחזיק השבב בעמדת המאגר מימין.

צור פרוטוקול עבור זרימת העבודה באמצעות רצף של רצף פתרונות לא מופעל, הפעלה ולא מופעל, או רצף BAB, בלולאה המבצעת שלוש מדידות ועוברת למאגר ההפעלה הבא עבור כל 10 המאגרים. השתמש בקצב הזרימה המוגדר כברירת מחדל של 200 מיקרוליטרים לשניה עם שנייה אחת, שנייה אחת, שנייה אחת פעמים זרימה עבור רצף ה- BAB ולחץ על הפעל כדי להתחיל את המדידה. שמור את הפרוטוקול ותן לזרימת העבודה לפעול על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה.

לאחר מכן בצעו את אותו ניסוי באמצעות ליפוזומים נטולי חלבונים. השתמש בכל תוכנה מועדפת לניתוח נתונים כדי להתוות את הזרם הנמדד לעומת הזמן ולהשתמש בפונקציה להערכת גובה שיא בטווח התוספת של המאגר המפעיל. התווה את זרם השיא נגד ריכוז המצע כדי לקבוע את ההשפעה המקסימלית למחצה של ריכוז, או EC50, של המצע באמצעות רגרסיה לא ליניארית.

העבר 50 מיליליטר של חוצץ SSM לאפעיל לתוך צינור נקי. הוסף את כולין המצע לריכוז הסופי של חמישה מילימולר ולהשתמש בו למדידת שליטה חיובית. העבר 10 מיליליטר של חוצץ SSM שאינו מפעיל לתוך צינור נקי.

הוסף כולין מצע ל 5 מילימולר וננו-גוף לריכוז הסופי 500 ננומולר. חזור על השלב עבור כל ננו כדי להכין את פתרונות ההפעלה כפי שהודגם. הפעל את מכונת SSM ולמדוד את הקיבול והמוליכות של השבב מצופה פרוטאוליפום, כפי שהודגם קודם לכן.

העבר את פתרון ההפעלה ללא גוף ננו לתוך נביון ומניחים את המאגר בסמפלר הבדיקה. העבר את המאגר הלא-אקטיבי ללא גוף ננו למאגר ומיקם אותו בסמפלר הבדיקה. לאחר מכן חזור על תהליך זה עבור כל הפתרונות המכילים ננו-בומני עם פתרון הפעלה ולא הפעלה.

צור פרוטוקול עבור זרימת העבודה באמצעות רצף BAB. צור לולאה המבצעת שלוש מדידות של רצף BAB באמצעות מאגרים ללא ננו-בודיות, שתי מדידות של רצף ה- BAB עם מאגרים המכילים ננו-גוף, דגירה של זמן עיכוב של 120 שניות עם הננו-גוף, ושלוש מדידות של רצף ה- BAB עם מאגרים המכילים את הננו- גוף. שמור את זרימת העבודה ותן לה לפעול על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה.

לאחר מכן, צור פרוטוקול חדש עבור זרימת העבודה באמצעות רצף BAB ולולאה של חמש מדידות כדי לשטוף את גוף nano קשור באופן הפיך. שמור את זרימת העבודה ותן לה לפעול על-ידי לחיצה על לחצן ההפעלה. השווה את זרם השיא האחרון של המדידות למדידה הראשונית של המצע בלבד.

אם זרם השיא מגיע לערך ההתחלתי, הננו-גוף נשטף בהצלחה והתנאים ההתחלתיים נוצרו מחדש. אחרת, חזור על זרימת העבודה או שנה לשבב חדש. חזור על תהליך זה באמצעות שבבים בודדים עבור כל מסך nanobody, או חזור עם nanobodies מרובים באמצעות אותו שבב.

השתמש בכל תוכנה מועדפת לניתוח נתונים כדי להתוות את הזרם הנמדד לעומת הזמן. לאחר מכן התוכנה בוחרת באופן אוטומטי את הפונקציה להערכת גובה שיא בטווח של התוספת של מאגר ההפעלה. לנרמל את זרם השיא ואת נוכחותו של nanobody בהתבסס על המדידה מצע ההליך בלבד.

התווה את זרמי השיא בהיסטוגרמה והשווה את זרמי השיא של מדידות המצע בלבד לזרמי השיא הנמדדים בנוכחות ננו-בוז כדי לזהות ננו-בומניות מעכבות. העבר 50 מיליליטר של חוצץ SSM nonactivating לתוך צינור נקי ולהוסיף את כולין המצע לריכוז הסופי של חמישה מילימולרים, ולהשתמש בזה כפתרון ההפעלה לשליטה חיובית. הוסף חמישה מיליליטר של הפתרון הלא מעשי לשמונה צינורות נקיים, ולאחר מכן להוסיף כולין מצע ו nanobody מעכב לצינורות בריכוזים בטווח IC50 הצפוי.

הוסף 10 מיליליטר של הפתרון הלא מעשי לשמונה הצינורות והוסף ננו-גוף מעכב לכל צינור המתאים למאגר אי-הפעילות. התחל את הגדרת SSM ומדוד את הקיבול והמוליכות של השבב מצופה פרוטאוליפוזום. העבר את פתרון ההפעלה ללא גוף ננו לתוך נביון ומניחים אותו בסמפלר הבדיקה.

לאחר מכן העבר את המאגר הלא-הפעלה ללא גוף ננו למאגר והצב אותו בעמדת המאגר ליד מחזיק השבב מימין. העבר את פתרונות ההפעלה והלא-הפעלה המכילים ננו-בונים לבקבוקונים ומיקם את המאגרים בסמפלר הבדיקה. צור פרוטוקול עבור זרימת העבודה באמצעות רצף BAB.

כלול לולאה כדי למדוד כל ריכוז פעמיים, דגירה במשך 120 שניות ולמדוד שלוש פעמים נוספות. השתמש בכל תוכנה מועדפת לניתוח נתונים כדי להתוות את הזרם הנמדד לעומת הזמן ולבחור את הפונקציה להערכת גובה השיא בטווח התוספת של מאגר ההפעלה. התווה את זרמי השיא נגד ריכוז nanobody כדי לקבוע את IC50 באמצעות רגרסיה לא ליניארית.

לקביעת ריכוז המצע שישמש במהלך הקרנה של ננו-ביגודיות, הובלה אלקטרוגנית נמדדה בריכוזים מצע שונים כדי לקבוע EC50. ריכוז מצע המתאים לתנאי רוויה, חמישה מילימולר, נבחר ונשמר קבוע בכל המאגרים המפעילים. ההשפעה של ננו-בומני מעכבות על הובלה אלקטרוגנית הוצגה מהירידה במשרעת של זרמי השיא.

לאחר הפעלת פרוטוקול הכביסה כדי לאפשר ננו-גוף unbinding, התאוששות של 80 עד 95% של משרעת זרם השיא הראשוני נצפתה. בעת מעבר מתנאים לא פעילות להפעלת, לא זרמי חפץ משמעותיים הוצגו על ידי ננו-בודיות הקיימות במאגרים אלה. לאחר בחירת ננו-בודיות עם תכונות מעכבות, נקבעו ערכי IC50 עבור ננו-בודיות בודדות.

זה חיוני כדי לתת מספיק זמן לכיול של proteoliposomes על השבב עם המאגר המכיל את nanobody. מאז הכריכה היא הפיכה, nanobody צריך להיות נוכח הן הפעלה ולא הפעלת מאגרים.