ניתוח ועיבוד מדגם להדמיה קורלטיבית של שסתום הריאות מורין
5 באוגוסט 2021
כאן, אנו מתארים זרימת עבודה מתאם עבור כריתה, לחץ, קיבעון, והדמיה של שסתום הריאות מורין כדי לקבוע את הקונפורמציה ברוטו ומבני מטריצה חוץ תאיים מקומיים.
פרוטוקול זה הוא משמעותי כי הוא נועד לענות על שאלות על תפקוד המבנה בקורלציה של שסתום הריאות מורין, וזה בדרך כלל מסובך בגלל ההטרוגניות הטבועה שלה. הקיבעון המבוקר והדמיה המתאם שימשו ללכידת המבנה בקשקשים באורך מרובה. לאחר מכן ניתן למפות תמונות מקומיות ברזולוציה גבוהה בחזרה למיקום האנטומי המדויק על שסתום הריאות.
מי שידגים את ההליך יהיה ד"ר טאי יי, מנהל מיקרוכירורגיה במרכז לרפואה רגנרטיבית בבית החולים הלאומי לילדים. התחל על ידי עיבוד אוטומטי של הכלים הדרושים לניתוח העכבר, כולל מספריים עדינים, מיקרו-כוחס, מלחציים מיקרו-וסקולריים, מלקחיים להחלת מלקחיים, מחזיקי מיקרונידל, מספריים קפיציים ומפסקים. לאחר המתת חסד עכבר C57BL/6 מבוגר, מניחים אותו בתנוחת התאוששות געש על מגש, מאבטחים את גפיו בקלטת ומבצעים את בית החזה.
לחשוף את הלב על ידי הסרת כל עודף רקמת שומן fascia, ולאחר מכן להסיר את האטריום הימני ולפרוק את החדר השמאלי עם תמיסת מלח בטמפרטורת החדר. הסר את הלב כולו על ידי ניתוק הווריד העליון, וריד קאווה נחות, עורק ריאות, ואבי העורקים, ולחתוך כשני מילימטרים מעל צומת פיתום, אשר ישמש צינור ללחץ. הסר את החדרים השמאליים והימנים כדי לחשוף את התאים ללחץ אטמוספרי, להבטיח כי מבנה תא המטען הריאתי אינו מושפע על ידי הסרת החדרים.
צינורות לחץ Anastomose עם עורק הריאות, משאיר במרחק של כמילימטר בין הצומת sinotubular לבין סוף הצינורות כדי להכיל תנועות גדולות של העלונים ואת גזע הריאות. העלו את המאגר ללחץ פיזיולוגי אנלוגי ומלאו אותו בתמיסת המלח. בדוק את מערכת הזרימה כדי לוודא שאין חסימות או בועות אוויר.
חבר פקק שסתום ריאות anastomosed ולהבטיח זרימה נאותה דרך הצינורות על ידי החלפת דרכי היציאה. ברגע שהזרימה מספיקה, החליפו את הזרימה לשסתום הריאות המנומס והבטיחו לחץ על גזע הריאות שזוהה על ידי התנפחת תא המטען. לאחר אישור לחץ של תא המטען הריאתי, לשלב בהדרגה פתרון קיבוץ ראשוני עד 25% של קיבולת המאגר של תמיסת מלח מטוהר.
מניחים גזה ספוגה הקיבעון על דגימת הרקמה כדי למנוע ייבוש. לנטרל את הקיבעון במשך שלוש שעות, מילוי המאגר כדי לשמור על לחץ מתמיד. לאחר זלוף, לאחסן את שסתום הלב בתמיסה הקיבועית בארבע מעלות צלזיוס עד לשימוש עד שבוע.
להכתמה, לשטוף את דגימת שסתום הלב הקבוע שלוש פעמים עם חיץ קקודילאט טוחנת קר 0.15 במשך חמש דקות לחלוטין להטביע את שסתום הלב בתמיסה של 1.5 אשלגן ferrocyanide, 0.15 קקודילאט טוחנת, שני מילימולרי סידן כלוריד, ו 2% osmium tetroxide על קרח במשך שעה אחת. לשטוף את הדגימות עם טמפרטורת החדר מים מזוקקים כפולים על ידי הצבת אותם בצינור במשך חמש דקות עם עצבנות קלה. לאחר שלוש שטיפות נוספות, מניחים את המדגם בתמיסת thiocarbohydrazide מסוננת בטמפרטורת החדר.
לאחר 20 דקות, לשטוף את המדגם שלוש פעמים עם מים כפי שהוכח קודם לכן. לאחר מכן, מניחים את המדגם ב 2% osmium tetroxide בטמפרטורת החדר. לאחר 30 דקות, לשטוף אותו עם מים שלוש פעמים במשך חמש דקות כל אחד ודגורת המדגם ב 1%אורניל אצטט לילה בארבע מעלות צלזיוס.
בינתיים, להכין פתרון של עופרת חנקתית. למחרת, לבצע את שלב הכביסה שלוש פעמים כפי שהוכח קודם לכן, ולאחר מכן לדגור על רקמת שסתום הלב בתמיסת אספרטט עופרת ב 60 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לשטוף את הדגימות שלוש פעמים נוספות, ולאחר מכן לבצע טיפול התייבשות סדרתי על רקמות שסתום הלב עם מוכן טרי 20, 50, 70, ו 90%אתנול על קרח במשך חמש דקות כל אחד, ואחריו שני טיפולים הבאים עם 100%אתנול.
לאחר התייבשות, להזיז את הרקמות כדי אצטון קר קרח, ולאחר מכן למקם אותו אצטון טרי בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. עבור הטבעה, להפוך את תערובת שרף על פי מפרטי היצרן. מניחים רקמות בטיפולים הבאים של 25 עד 75, 50 עד 50 ו 75 עד 25 שרף לתערובת אצטון במשך שעתיים כל אחד.
לבסוף, מניחים את הרקמות ב-100% שרף בן לילה. למחרת, מניחים רקמות ב-100% שרף טרי. לאחר שעתיים, מעבירים את הרקמות לקפסולה הטמעה, מוסיפים שרף טרי 100% ומניחים אותו בתנור 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לריפוי.
עורק הריאות המופק לפני ואחרי היישום של לחץ הידרוסטטי מוצג כאן. תא המטען הריאתי נפוח באופן רדיאלי ומציין כי עלוני שסתום הריאות נמצאים בתצורה סגורה. טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת אישרה את אישור שסתום הריאות.
העלונים היו סגורים והאנולוס היה מעגלי בעוד דרגות שונות של לחץ שסתום ריאתי לקוי על ידי קיבוע או קריסת עורקים נצפו. עוצמת הקול של מיקרו CT בעיבוד חתך רוחב וירטואלי הייתה מתואמת עם תמונות אופטיות כדי לאשר את כיוון החתך והמיקום. תמונות SBF SEM ברזולוציה גבוהה צולמו באזור מקומי בתוך עלון כאשר בלוק הדגימה היה במיקום הרצוי ובכיוון.
תמונות מתואמות בין עוצמת הקול של מיקרו CT שמעבדות פרוסה וירטואלית, רזולוציה נמוכה ותמונות SBF SEM ברזולוציה גבוהה מוצגות כאן. בייצוג תלת-ממדי של אזור מקוטע של שסתום הריאות, ניתן לזהות רכיבים חוץ תאיים כמו תאי אנדותל, תאים ביניים valvular וסיבים חוץ תאיים. בעת ניסיון פרוטוקול זה, זכור כי ביצוע לחצים הוא קריטי ויבטיח את התשואה להיות גבוהה ככל האפשר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול מקיף לאפיון מבני של מסתם הריאה בעכברים במגוון קשכי אורך. המתודולוגיה משלבת קיבוע הידרוסטטי מבוקר, צביעה של הגוש כולו (en bloc) ודימיון קורלטיבי באמצעות טומוגרפיה ממוחשבת מיקרוסקופית (μCT) ומיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת של פני חתכים סדרתיים (SBF-SEM). גישה זו מאפשרת מיפוי מדויק של נתונים אולטרה-מבניים ברזולוציה גבוהה למיקומים אנטומיים, ובכך מסייעת בניתוח מפורט של ארגון מסתמי הלב.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- ביולוגיה של מערכת הלב וכלי הדם
- מיקרוסקופיה והדמיה
- היסטולוגיה
רקע
- המנגנונים של מחלות מסתמי הלב (HVD) עדיין אינם מובנים דיו בשל המורכבות המבנית וההטרוגניות שלהם.
- מודלים של עכברים הם בעלי ערך למחקר של HVD, אך הם דורשים טכניקות מתקדמות לצורך ניתוח מבני מדויק.
- תיעוד מבנה המסתם במספרי סדרי גודל שונים הוא חיוני להבנת התפקוד והפתולוגיה.
- דימות קורלטיבי מגשר על הפער שבין נתונים אנטומיים לנתונים אולטרה-מבניים.
מטרת המחקר
- מתן פרוטוקול מפורט לניתוח, קיבוע, צביעה והדמיה של שסתומי לב ריאתיים של עכברים.
- מתן אפשרות לכימות מבני מדויק במגוון קשרי מידות (length scales).
- ביצוע קורלציה בין נתוני μCT לנתוני SBF-SEM לצורך ניתוח מקיף של השסתום.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- נתיחה והכנה של לבבות עכברים בוגרים מזן C57BL/6.
- לחץ הידרוסטטי מבוקר וקיבוע כימי לשימור קונפורמציית השסתומים.
- צביעה בשיטת en bloc באמצעות אוסמיום טטראוקסיד, אורניל אצטט ועופרת אספרטט ליצירת ניגודיות במיקרוסקופיה אלקטרונית.
- דהידרציה טורית, הטמעה בשרף והקשיה של דגימות הרקמה.
- טומוגרפיה ממוחשבת זעירה (μCT) לייחוס אנטומי בתלת-ממד ולאישור גאומטריית השסתומים.
- מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת של פני חתכים טוריים (SBF-SEM) לדימות ברזולוציה גבוהה של המטריקס החוץ-תאי ומרכיבים תאיים.
- קורלציה בין תמונות μCT ל-SBF-SEM למיפוי מאפיינים אולטרה-מבניים למיקומים אנטומיים.
תוצאות עיקריות
- קיבוע הידרוסטטי שמר על המסתם ריאתי בתצורה סגורה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית.
- בדיקת μCT אישרה את גאומטריית המסתם וסיפקה נקודת ייחוס לשלבי העיבוד הבאים.
- שיטת SBF-SEM אפשרה שחזור תלת-ממדי של ארגון המטריצה החוץ-תאית המקומית, תוך זיהוי תאי אנדותל, תאי אינטרסטיציאליים של המסתם וסיבים חוץ-תאיים.
- דימוי קורלטיבי אפשר מיקום מדויק של נתונים אולטרה-מבניים בתוך ההקשר האנטומי של המסתם.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר ניתוח מבני מפורט ורב-קני מידה של מסתמי לב עכבריים.
- דימות משולב של μCT ו-SBF-SEM מתגבר על אתגרי ההטרוגניות המרחבית.
- מתודולוגיה זו ניתנת להתאמה למחקר של ארגון היררכי במערכות ביולוגיות אחרות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
אפיון מבני רב-קנה מידה של המסתם הריאתי בעכברים מאפשר מיפוי מדויק של מאפיינים אנטומיים ואולטרסטרוקטורליים, ובכך נותן מענה לאתגר מרכזי בתיקוף יעדים קרדיווסקולריים. זרימות עבודה של דימות קורלטיבי, המשלבות מיקרו-computed tomography (μCT) ומיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת עם חיתוך רצוף של פניי הבלוק (SBF-SEM), מספקות רמת ביטחון ניבוי גבוהה לקשרי מבנה-תפקוד במודלים פרה-קליניים. יכולת זו תומכת בקידום מותאם-סיכונים של תוכניות גילוי קרדיווסקולריות ומספקת בסיס לאסטרטגיות של ביומרקרים טרנסלציונליים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשרת בחינה קפדנית של היפותזות על מבנה ותפקוד של מסתמי לב במודלים עכבריים רלוונטיים למחלה.
- תומכת בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי פיתרון של הטרוגניות מרחבית במספר סדרי גודל.
- מקל על תיקוף של מטרות תפקודיות באמצעות לוקליזציה אנטומית מדויקת של מאפיינים אולטרה-מבניים.
- משפרת את הביטחון החזוי עבור תעדוף פורטפוליו בשלבים הבאים במחקר קרדיו-וסקולרי.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מקיים מערכות ייחוס מתוקפות עבור בדיקות כמותיות מבוססות דימות.
- מסטנדרט את פרוטוקולי הכנת הדגימות והדימות לצורך הדירות בין מחקרים.
- מאפשר מיפוי ברזולוציה גבוהה של המטריצה החוץ-תאית ומרכיבים תאיים לצורך מוכנות לסריקה.
- תומך בזרימות עבודה של דימות הניתנות להרחבה להערכה מהימנה של תרכובות במודלים פרה-קליניים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את האפיון המבני למדדי קצה רלוונטיים למחלה לצורך רצף תרגומי.
- מספקת מסגרת למתאם בין ביומרקרים של דימות לתוצאות תפקודיות במחקרים פרה-קליניים.
- מפחיתה עמימות מכניסטית בבחירה ובתיקוף של מודלים.
- מאפשרת קבלת החלטות מותאמות סיכון לקידום מועמדים המכוונים לפתולוגיה של מסתמי לב.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול דימות קורלטיבי זה מגשר בין שלבי הגילוי המוקדמים לאימות פרה-קליני, על ידי מתן אפשרות לניתוח כמותי רב-קנימי של מבנה מסתמי הלב במודלים של עכברים.
- ביולוגיה של התגליות: תומכת בבדיקת השערות ובבירור מסלולים באמצעות מיפוי אנטומי ואולטרה-מבני מדויק.
- סריקה: מספקת פלטי דימות כמותיים הניתנים לשחזור לצורך פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מספקת נתוני ייחוס בתלת-ממד וקריאות ברזולוציה גבוהה לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מסייעת בהתאמת נקודות קצה של דימות פרה-קליני עם אסטרטגיות של ביומרקרים קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מקימה זרימת עבודה של דימות ואנליזה הניתנת לשימוש חוזר וניתנת להתאמה למערכות ביולוגיות אחרות.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף יעדים קרדיווסקולריים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של ההדמיה ועיבוד הדגימות לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של go/no-go וניהול פורטפוליו יעיל מבחינת הון.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעודף מותאם סיכון ובקידום תוכניות גילוי קרדיווסקולריות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה של עכברים, קיבוע רקמות וטכניקות דימוג מתקדמות.
- מחייב גישה למכשור ותשתיות אנליטיות של μCT ו-SBF-SEM.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת דגימות ודימוג.
- ניתן להתאמה למערכות איברים אחרות עם שינויים מתאימים בפרוטוקול.
- תלות קריטית בלחצון וקיבוע מדויקים כדי להבטיח את איכות הנתונים.
