Name: שימוש בריצוף הדור הבא כדי לזהות מוטציות הקשורות לתיקון של שבר גדיל כפול המושרה על ידי CAS9 ליד מקדם CD4 (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-31T12:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: חקור זיהוי מוטציות בתיקון שברי DNA כפולים באמצעות CRISPR/Cas9 וריצוף הדור הבא בתאי קרטינוציט אנושיים. שיטה זו מציעה חלופה חסכונית ויעילה לריצוף גנום שלם לניתוח מנגנוני תיקון DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר שדווח בכתב יד זה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים של המכונים הלאומיים לבריאות (P20GM130448) (NAW ו- RP); המכון הלאומי לסרטן של המכונים הלאומיים לבריאות (NCI R15 CA242057 01A1); מרכז ג'ונסון לחקר הסרטן באוניברסיטת קנזס סטייט; ומשרד ההגנה של ארה"ב (CMDRP PRCRP CA160224 (NAW)). אנו מעריכים את KSU-CVM Confocal Core ואת ג'ואל סנמן על המיקרוסקופיה האימונופלואורסצנטית שלנו. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של הכותבים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של סוכנויות מימון אלה.

<ol><li>Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+DNA+double-strand+break+repair%3A+an+ever-growing+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Studying DNA double-strand break repair: an ever-growing toolbox.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 7, (2020).</li>
<li>Giglia-Mari, G., Zotter, A., Vermeulen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">DNA damage response.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (1), 000745(2011).</li>
<li>Khanna, K. K., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-strand+breaks%3A+Signaling%2C+repair+and+the+cancer+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection.</a> Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).</li>
<li>vanden Berg, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+limited+number+of+double-strand+DNA+breaks+is+sufficient+to+delay+cell+cycle+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">A limited number of double-strand DNA breaks is sufficient to delay cell cycle progression.</a> Nucleic Acids Research. 46 (19), 10132-10144 (2018).</li>
<li>Chang, H. H. Y., Pannunzio, N. R., Adachi, N., Lieber, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-homologous+DNA+end+joining+and+alternative+pathways+to+double-strand+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Non-homologous DNA end joining and alternative pathways to double-strand break repair.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (8), 495-506 (2017).</li>
<li>Daley, J. M., Sung, P. 53B. P. 1 <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRCA1%2C+and+the+choice+between+recombination+and+end+joining+at+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">BRCA1, and the choice between recombination and end joining at DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (8), 1380-1388 (2014).</li>
<li>Godin, S. K., Sullivan, M. R., Bernstein, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+insights+into+RAD51+activity+and+regulation+during+homologous+recombination+and+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Cell+Biology+%3D+Biochimie+et+Biologie+Cellulaire%22%5BJournal%5D)">Novel insights into RAD51 activity and regulation during homologous recombination and DNA replication.</a> Biochemistry and Cell Biology = Biochimie et Biologie Cellulaire. 94 (5), 407-418 (2016).</li>
<li>Jette, N., Lees-Miller, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-dependent+protein+kinase%3A+a+multifunctional+protein+kinase+with+roles+in+DNA+double+strand+break+repair+and+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Biophysics+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The DNA-dependent protein kinase: a multifunctional protein kinase with roles in DNA double strand break repair and mitosis.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 117 (0), 194-205 (2015).</li>
<li>Weterings, E., van Gent, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+non-homologous+end-joining%3A+A+synopsis+of+synapsis%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">The mechanism of non-homologous end-joining: A synopsis of synapsis.</a> DNA Repair. 3 (11), 1425-1435 (2004).</li>
<li>Bhargava, R., Lopezcolorado, F. W., Tsai, L. J., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+canonical+non-homologous+end+joining+factor+XLF+promotes+chromosomal+deletion+rearrangements+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The canonical non-homologous end joining factor XLF promotes chromosomal deletion rearrangements in human cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (1), 125-137 (2020).</li>
<li>Gunn, A., Bennardo, N., Cheng, A., Stark, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correct+end+use+during+end+joining+of+multiple+chromosomal+double+strand+breaks+is+influenced+by+repair+protein+RAD50%2C+DNA-dependent+protein+kinase+DNA-PKcs%2C+and+transcription+context%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Correct end use during end joining of multiple chromosomal double strand breaks is influenced by repair protein RAD50, DNA-dependent protein kinase DNA-PKcs, and transcription context.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (49), 42470-42482 (2011).</li>
<li>Simsek, D., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+end-joining+is+suppressed+by+the+canonical+NHEJ+component+Xrcc4-ligase+IV+during+chromosomal+translocation+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Alternative end-joining is suppressed by the canonical NHEJ component Xrcc4-ligase IV during chromosomal translocation formation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 17 (4), 410-416 (2010).</li>
<li>Certo, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+genome+engineering+outcome+at+individual+DNA+breakpoints%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Tracking genome engineering outcome at individual DNA breakpoints.</a> Nature Methods. 8 (8), 671-676 (2011).</li>
<li>Murthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+DNA+repair+processes+at+transient+and+long-lasting+double-strand+DNA+breaks+by+immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Characterizing DNA repair processes at transient and long-lasting double-strand DNA breaks by immunofluorescence microscopy.</a> JoVE Journal of Visualized Experiments. (136), e57653(2018).</li>
<li>Wang, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+DNA+double-strand-break+repair+using+novel+single-molecule+forceps%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissection of DNA double-strand-break repair using novel single-molecule forceps.</a> Nature Structural & Molecular Biology. , (2018).</li>
<li>Azzam, E. I., Jay-Gerin, J. -P., Pain, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation-induced+metabolic+oxidative+stress+and+prolonged+cell+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury.</a> Cancer Letters. 327 (0), 48-60 (2012).</li>
<li>Kuo, L. J., Yang, L. -X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3-H2AX+-+A+novel+biomarker+for+DNA+double-strand+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">γ-H2AX - A novel biomarker for DNA double-strand breaks.</a> In Vivo. 5, (2008).</li>
<li>Sanders, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+DNA+damage+and+repair+effects+on+3D+genome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced DNA damage and repair effects on 3D genome organization.</a> Nature Communications. 11 (1), 6178(2020).</li>
<li>Bellaiche, Y., Mogila, V., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+endonuclease%2C+a+new+tool+for+studying+DNA+double-strand+break+repair+mechanisms+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">I-SceI endonuclease, a new tool for studying DNA double-strand break repair mechanisms in Drosophila.</a> Genetics. 152 (3), 1037-1044 (1999).</li>
<li>Wallace, N. A., Robinson, K., Howie, H. L., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-HPV+5+and+8+E6+disrupt+homology+dependent+double+strand+break+repair+by+attenuating+BRCA1+and+BRCA2+expression+and+foci+formation%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">β-HPV 5 and 8 E6 disrupt homology dependent double strand break repair by attenuating BRCA1 and BRCA2 expression and foci formation.</a> PLOS Pathogens. 11 (3), 1004687(2015).</li>
<li>Hu, C., Bugbee, T., Gamez, M., Wallace, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+human+papillomavirus+8E6+attenuates+non-homologous+end+joining+by+hindering+DNA-PKcs+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Beta human papillomavirus 8E6 attenuates non-homologous end joining by hindering DNA-PKcs activity.</a> Cancers. 12 (9), 2356(2020).</li>
<li>Hu, C., Bugbee, T., Dacus, D., Palinski, R., Wallace, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+human+papillomavirus+8+E6+allows+colocalization+of+non-homologous+end+joining+and+homologous+recombination+repair+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Beta human papillomavirus 8 E6 allows colocalization of non-homologous end joining and homologous recombination repair factors.</a> PLOS Pathogens. 18 (3), 1010275(2022).</li>
<li>Butler, T. A. J., Paul, J. W., Chan, E. -C., Smith, R., Tolosa, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Misleading+westerns%3A+Common+quantification+mistakes+in+western+blot+densitometry+and+proposed+corrective+measures%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Misleading westerns: Common quantification mistakes in western blot densitometry and proposed corrective measures.</a> BioMed Research International. 2019, 5214821(2019).</li>
<li>Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+double-stranded+breaks+induce+histone+H2AX+Phosphorylation+on+serine+139%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">DNA double-stranded breaks induce histone H2AX Phosphorylation on serine 139.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).</li>
<li>Taning, C. N. T., Van Eynde, B., Yu, N., Ma, S., Smagghe, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+insects%3A+Applications%2C+best+practices+and+biosafety+concerns%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in insects: Applications, best practices and biosafety concerns.</a> Journal of Insect Physiology. 98, 245-257 (2017).</li>
<li>Ghezraoui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+translocations+in+human+cells+are+generated+by+canonical+nonhomologous+end-joining%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Chromosomal translocations in human cells are generated by canonical nonhomologous end-joining.</a> Molecular Cell. 55 (6), 829-842 (2014).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

בנוסף לעומק המידע המסופק, ישנם מספר יתרונות לשיטה זו. ראשית, תיקון DSB, בתיאוריה, ניתן להעריך בכל מוקד גנומי מבלי לשנות את הגנום של התא המעניין. שנית, הגישה לניתוח NGS של תיקון גדלה על ידי העלות המופחתת והמאמץ החישובי הניתנים על ידי ביצוע וניתוח של DSB יחיד המיועד לאזור מוגדר. לבסוף, כאשר הגנומים של אורגניזמים נוספים הופכים לזמינים באופן שגרתי ופרסומים מרובים המדגימים טרנספקציה מוצלחת של קווי תאים מגוונים של יונקים ולא יונקים, התועלת של גישה זו צפויה להיות רחבהשל 10,23,24.<sup class="xr...

שמירה על יציבות גנומית היא קריטית עבור כל האורגניזמים החיים. שכפול דנ"א מדויק ותגובת נזק חזקה לדנ"א (DDR) נחוצים כדי להפיץ בנאמנות את החומר הגנטי 1,2. נזקי דנ"א מתרחשים באופן קבוע ברוב התאים 2,3. כאשר חשים נזקים אלה, התקדמות מחזור התאים נעצרת, ומנגנוני תיקון הדנ"א מופעלים. שברים של גדילים כפולים בדנ"א או ב-DSBs הם הסוג הרעיל והמוטגני ביותר של נזק לדנ"א 3,4.
בעוד שכמה מסלולי איתות DDR יכולים לתקן נגעים אלה, מסלולי תיקון DSB שנחקרו ביסודיות הרבה ביותר הם רקומבינציה הומולוגית (HR) והצטרפות קצה לא הומולוגית (NHEJ). HR הוא מסלול נטול שגיאות ברובו, המתקן DSB באמצעות כרומטיד אחות כתבנית הומולוגית. זה נוטה לקרות בשלב S ובשלב G2 של מחזור התא 5,6,7. NHEJ מועד יותר לשגיאות, אבל זה יכול לקרות לאורך כל מחזור התא 8,9. מבחני כתבים שונים פותחו כדי למדוד את היעילות של מנגנוני תיקון ספציפיים 10,11,12. מבחנים אלה נוטים להסתמך על ציטומטריית זרימה למדידת תפוקה גבוהה של פעילות מסלול תיקון DSB באמצעות GFP או mCherry כקריאה11,13. למרות שהם יעילים מאוד, הם מסתמכים על תיקון קנוני המתרחש ב- DSB שהוכנס באופן מלאכותי.
ישנן מגוון שיטות אחרות המשמשות לחקר תיקון DSB. רבים מהם מסתמכים על מיקרוסקופיה אימונו-פלואורסצנטית (IF) 1,14. אם מיקרוסקופיה מזהה מוקדים גרעיניים בדידים המייצגים את מתחמי התיקון לאחר ש-DSBs מושרים על ידי חשיפה לכימיקלים גנוטוקסיים או קרינה מייננת15,16. מעקב אחר היווצרותם ופתרונן של מוקדים אלה מספק אינדיקציה לתחילת התיקון ולהשלמתו, בהתאמה14,17. עם זאת, שיטות אלה של אינדוקציה DSB (כלומר, כימיקלים או קרינה מייננת) אינן גורמות ל-DSBs במקומות מוגדרים בגנום. זה גם בלתי אפשרי מבחינה פונקציונלית להשתמש בהם כדי לגרום באופן עקבי רק למספר קטן (למשל, 2-4) של DSBs. כתוצאה מכך, השיטות הנפוצות ביותר של גרימת DSBs לגרום לשפע של נגעים המופצים באופן אקראי ברחבי הגנום18. ניתן להציג מספר קטן של DSBs על ידי הכנסת אתר הזיהוי לאנדונוקלאז חותך נדיר והבעת האנדונוקלאז הרלוונטי, כגון I-Sce119. למרבה הצער, האינטגרציה הנדרשת של אתר מטרה מונעת בדיקה של DSB במוקדים גנומיים אנדוגניים.
כתב יד זה מתאר שיטה לאיתור מוטציות הקשורות לתיקון של DSB שנוצר בלוקוס המוגדר על ידי המשתמש. אנו מספקים דוגמה מייצגת לגישה המיושמת להערכת יכולתו של חלבון נגיפי להגדיל את מספר המוטציות הקשורות ל-DSB. באופן ספציפי, כתב יד זה מתאר את השימוש ברנ"א מנחה יחיד (sgRNA) כדי לכוון אנדונוקלאז CAS9 כדי לגרום ל-DSB במסגרת קריאה פתוחה CD4 אנושית בעורלה אנושית קרטינוציטים המבטאים שליטה וקטורית (HFK LXSN) ו-HFK המבטאת את חלבון E6 של נגיף הפפילומה האנושי מסוג 8 (HFK 8E6). ריצוף ממוקד של הדור הבא (NGS) של האזור המקיף את השבר מאפשר להגדיר בקפדנות מוטציות הקשורות לתיקון הנגע. נתונים אלה מראים כי החלבון הנגיפי גורם לעלייה של כ-20 פעמים במוטציות במהלך תיקון DSB. הוא גם מספק אפיון בלתי משוחד של ההשלכות המוטגניות של DSBs במוקד יחיד ללא צורך בריצוף גנום שלם. באופן עקרוני, ניתן להתאים את הפרוטוקול בקלות כדי להשוות את הסיכון היחסי למוטציות בין מוקדי הגנום או קווי התאים.

<table><tbody><tr><td>6 באר צלחת תרבית רקמות</td><td>Celltreat</td><td>229106</td><td>צלחת תרבית תאים</td></tr><tr><td>ערכת BCA VWR</td><td></td><td>89167-794</td><td>ערכת בדיקת BCA</td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5910 R</td><td>Eppendorf</td><td>2231000772</td><td>צנטריפוגה שולחנית</td></tr><tr><td>CLC שולחן עבודה גנומי</td><td>Qiagen</td><td>832001</td><td>תוכנת ניתוח נתוני רצף עמוק / מתקשר אינדל / מתקשר וריאנט</td></tr><tr><td>דיגיטלי Microplate Genie דופק</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-400A</td><td>שייקר צלחת</td></tr><tr><td>DYKDDDDK תג נוגדן חד שבטי (FG4R)</td> <td>ThermoFisher Scientific</td><td>MA191878</td><td>נוגדן נגד FLAG</td></tr><tr><td>Epilife CF Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MEPICF500</td><td>Cell cultrue Media ותוספי מזון</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td> <td>VWR</td><td>89510-194</td><td>תוסף תרבית תאים</td></tr><tr><td>עיזים אנטי ארנב IgG</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11012</td><td>נוגדן משני</td></tr><tr><td>HighPrep PCR ניקוי מערכת</td><td>MagBio</td><td>AC-60005</td><td>ערכת ניקוי PCR מבוססת חרוזים</td></tr><tr><td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix PCR ערכת</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK2600</td><td>PCR Mastermix / PCR מבחן</td></tr><tr><td>MagAttract HMW DNA ערכת</td><td>Qiagen</td><td>67563</td><td>ערכת מיצוי DNA במשקל מולקולרי גבוה</td></tr><tr><td>מעמד מגנטי-96</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM10027</td><td>96 בארות מתלה מגנטי</td></tr><tr><td>MiniAmp Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>A37834</td><td>Thermal Cycler</td></tr><tr><td>Miseq</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td>Sequencer</td></tr><tr><td>Miseq v2 300 cycle reagent kit</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td>300 מחזורי מחסנית/רצף ריאגנטים</td></tr><tr><td>Nextera XT DNA Library ערכת הכנה</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>ערכת הכנת ספרייה</td></tr><tr><td>Nextera XT Kit v2 Set A</td><td>Illumina</td><td>20027215</td><td>Indexes</td></tr><tr><td>Nunc 96 בארות פוליפרופילן DeepWell Stroage לוחות</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>260251</td><td>באר עמוקה 96 בארות תמיסת</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (100X)</td> <td>Calsson Labs</td><td>PSL02-6X100ML</td><td>אנטיביוטיקה לתרבית</td></tr><tr><td>תאים פוספט חוצץ מלח (PBS)</td><td>Bio Basic</td><td>PD8117</td><td>PBS</td></tr><tr><td>px330-CD4</td><td>Addgen</td><td>136938</td><td>SgRNA/CAS9 פלסמידים המכוונים ל-5'- GGCGTATCTGTGTGAGGACT</td></tr><tr><td>QIAxcel מערכת מתקדמת</td><td>Qiagen</td><td>9001941</td><td>מכונת אלקטרופרזה נימית</td></tr><tr><td>QIAxcel ערכת הקרנת DNA</td><td>Qiagen</td><td>929004</td><td>מאגר DNA / צינורות אלקטרופרזה נימיים</td></tr><tr><td>Qubit 1x ds HS ערכת בדיקה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q23851</td><td>ריאגנטים פלואורומטר / 1x תמיסת dsDNA</td></tr><tr><td>Qubit 4 פלואורומטר</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Q33238</td><td>פלואורומטר</td></tr><tr><td>צינורות בדיקת קיוביט</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>Q32856</td><td>צינורות בדיקת פלואורומטר</td></tr><tr><td>RIPA מאגר ליזה</td><td>VWR</td><td>VWRVN653-100 מ"ל</td><td>מאגר ליזה למיצוי חלבון</td></tr><tr><td>טריפסין-EDTA (0.05%), פנול אדום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300054</td><td>Trypsin</td></tr><tr><td>Vortex-Genie 2</td><td>Scientific industries</td><td>SI-0236</td><td>Vortex</td></tr><tr><td>Xfect Transfection Reagent</td><td>Takara Bio</td><td>631318</td><td>Transfection Reagent</td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח נתונים גנומיים</td><td>QIAGEN</td><td>CLC Workbench v21.0.</td><td>תוכנה לניתוח נתונים</td></tr></tbody></table>

שימוש בריצוף הדור הבא כדי לזהות מוטציות הקשורות לתיקון של שבר גדיל כפול המושרה על ידי cas9 ליד מקדם cd4

Using Next Generation Sequencing to Identify Mutations Associated with Repair of a CAS9-induced Double Strand Break Near the CD4 Promoter

שברים של גדיל כפול (DSBs) בדנ"א הם הסוג הציטוטוקסי ביותר של נזק לדנ"א. מאחר ששלל עלבונות יכולים לגרום לנגעים אלה (למשל, מתח שכפול, קרינה מייננת, נזקי UV לא מתוקנים), DSBs מתרחשים ברוב התאים בכל יום. בנוסף למוות תאי, DSBs שלא עודכנו מפחיתים את שלמות הגנום והמוטציות המתקבלות יכולות להניע גידולים סרטניים. סיכונים אלה ושכיחותם של DSBs מניעים חקירות של המנגנונים שבאמצעותם תאים מתקנים נגעים אלה. ניתן לשלב את ריצוף הדור הבא עם אינדוקציה של DSBs על ידי קרינה מייננת כדי לספק כלי רב עוצמה להגדרה מדויקת של המוטציות הקשורות לפגמים בתיקון DSB. עם זאת, גישה זו דורשת ריצוף גנום שלם מאתגר מבחינה חישובית ועלותית כדי לזהות את התיקון של ה-DSBs המתרחשים באופן אקראי הקשורים לקרינה מייננת. אנדונוקליזות חיתוך נדירות, כגון I-Sce1, מספקות את היכולת ליצור DSB יחיד, אך יש להכניס את אתרי הזיהוי שלהן לגנום המעניין. כתוצאה מכך, אתר התיקון הוא מלאכותי מטבעו. ההתקדמות האחרונה מאפשרת ל-RNA מנחה (sgRNA) לכוון אנדונוקלאז Cas9 לכל מוקד גנום שמעניין אותו. ניתן ליישם זאת במחקר של תיקון DSB שהופך את ריצוף הדור הבא לחסכוני יותר בכך שהוא מאפשר להתמקד בדנ"א האגף ל-DSB המושרה על ידי Cas9. מטרת כתב היד היא להדגים את ההיתכנות של גישה זו על ידי הצגת פרוטוקול שיכול להגדיר מוטציות הנובעות מתיקון של DSB במעלה הזרם של הגן CD4. ניתן להתאים את הפרוטוקול כדי לקבוע שינויים בפוטנציאל המוטאגני של DSB הקשורים לגורמים אקסוגניים, כגון מעכבי תיקון, ביטוי חלבונים ויראליים, מוטציות וחשיפות סביבתיות עם דרישות חישוב מוגבלות יחסית. לאחר ריצוף הגנום של אורגניזם, ניתן להשתמש בשיטה זו באופן תיאורטי בכל לוקוס גנומי ובכל מודל תרבית תאים של אותו אורגניזם שניתן לבצע טרנספקטציה. התאמות דומות של הגישה יכולות לאפשר השוואות של נאמנות תיקון בין מוקדים שונים באותו רקע גנטי.

שלוש תוצאות מייצגות מוצגות עבור פרוטוקול זה. איור 1 הוא אימונובלוט המאשר ביטוי של CAS9 בבקרת HFK (LXSN) ו-HFK המבטאת בטא-HPV 8E6 (8E6). 48 שעות לאחר הטרנספקציה, נקטפו ליזטים של תאים שלמים ולאחר מכן נבדקו עם נוגדן נגד CAS9 (או GAPDH כבקרת העמסה). התוצאה מראה כי HFK LXSN ו- HFK 8E6 מבטאים כמות דומה של CAS9 המצביעה על כך שנצילות הטרנספקציה דומה בין שני קווי תאים. איור 2 הוא תמונה של מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית המציגה DSBs המושרים...

מוצג כאן sgRNA/CAS9 endonuclease ופרוטוקול ריצוף מהדור הבא שניתן להשתמש בו כדי לזהות את המוטציות הקשורות לתיקון שבר גדיל כפול ליד מקדם CD4.

שימוש בריצוף הדור הבא כדי לזהות מוטציות הקשורות לתיקון של שבר גדיל כפול המושרה על ידי CAS9 ליד מקדם CD4

Double strand breaks (DSBs) in DNA are the most cytotoxic type of DNA damage. Because a myriad of insults can result in these lesions (e.g., replication ...

פרוטוקול זה מסייע לך לזהות מוטציות המתרחשות במהלך תיקון של שבר דו-גדילי המושרה על-ידי RNA ו-CAS9 חד-כיווניים. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שזוהי דרך חסכונית וחזקה לזהות מוטציות בלוקוס גנומי מסוים. אנו משתמשים בקרטינוציטים אנושיים כדוגמה, אך פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לכל קווי תאים הניתנים להעברה.מי שידגים את הפרוטוקול הזה יהיה טיילור בוגבי, עוזר לתואר ראשון מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, תרבית HFK LXSN ותאי HFK 8E6 בלוחות 10 ס"מ ב-37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו-חמצני בחממת ז'קט המכילה מדיה של תרבית קרטינוציטים עם תוסף גדילה קרטינוציטים אנושי ו-1%פניצילין סטרפטומיצין. החליפו את המדיה התרבותית בשלושה מיליליטרים של טריפסין-EDTA ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות.לאחר מכן, נטרל את הטריפסין עם נפח שווה של מדיה בתוספת FBS. כעת, העבירו את התאים לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב-300 פעמים G למשך חמש דקות. להשעות מחדש תאים עם 10 מיליליטרים של מדיה תרבית קרטינוציטים עם תוסף גדילת קרטינוציטים אנושי ולקבוע את ריכוז התאים עם המוציטומטר.לאחר מכן, זרעו שתי צלחות כל אחת עבור תאי HFK LXSN ו-HFK 8E6 בארבעה מיליליטרים של תרבית קרטינוציטים עם תוסף גדילה קרטינוציטים אנושי ו-1%פניצילין סטרפטומיצין. לאחר הזריעה, הדגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני באינקובטור ז'קט. ביום הטרנספקציה, החליפו את המדיה בשלושה מיליליטרים של מדיה ללא אנטיביוטיקה ותוספי דגירה במשך שעתיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממת ז'קטים.כדי לבצע טרנספקטציה של התאים, מחממים את ריאגנטים טרנספקציה לטמפרטורת החדר ומטפטפים אותם בעדינות לפני השימוש. מניחים כמות מתאימה של חיץ טרנספקציה בשני צינורות צנטריפוגה סטריליים של 1.5 מיליליטר עבור כל קו תאים ומתייגים אותם כצינור אחד ולועגים לטרנספקציה מדומה, או צינור שני. לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוגרם של פלסמידים המבטאים דנ"א, CAS9, מדריך יחיד, מכוון RNA אנושי CD4 כדי לצינור אחד ופיפט בעדינות כדי לערבב לחלוטין.מוסיפים נפח שווה של מים סטריליים לצינור שתיים. הוסיפו כמות מתאימה של מגיב הטרנספקציה לצינור אחד עם תערובת DNA וההעתקה המדומה או הצינור השני. באמצעות פיפטה, ערבבו אותם בעדינות לחלוטין ודגרו בטמפרטורת החדר במשך 15 עד 30 דקות כדי ליצור את המתחמים.מוסיפים את תערובת הטרנספקציה בצורה טיפתית לצלחת ומנערים בעדינות את צלחת התרבית למשך דקה אחת כדי להפיץ באופן שווה את תערובת הטרנספקציה. כדי לקצור את התאים על ידי טריפסיניזציה, החליפו את מדיית התרבית במיליליטר אחד של טריפסין EDTA ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. לאחר מכן, נטרל את טריפסין עם נפח שווה של מדיה בתוספת FBS.עבור כל צלחת של תאים, העבירו את תרחיף התא לשני צינורות מיקרוצנטריפוגה עם אליקוטים שווים וצנטריפוגה ב-300 פעמים G למשך חמש דקות. לאחר צנטריפוגה, להשעות מחדש את גלולת התא מצינור אחד במיליליטר אחד של PBS לריצוף, ובצינור אחר, עם PBS קר כקרח עבור אימונובלוט. בדיקת Immunoblot בוצעה כדי להשוות את ביטוי CAS9 בתאי HFK לא מתורגמים ומתעלים.התוצאות מראות שתאי HFK לא מתורגמים ומתעלים ביטאו כמות דומה של CAS9, מה שמצביע על כך שנצילות הטרנספקציה דומה בין שני קווי תאים. התקבלו תמונות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית של היסטון H2AX S139 זרחני בתאים טרנספקטציה SgRNA/CAS9 ובקרה לא מתורגמת. התוצאות הצביעו על כך ששתי הפסקות דו-גדיליות הושרו על ידי CAS9 SgRNA.וריאציות גנומיות קובצו לפי סוגים של אירועים מוטציוניים ב-HFK LXSN וב-HFK 8E6, כאשר כל קבוצה של וריאציות גנומיות והמספר הכולל של וריאציות הושוו בין HFK LXSN ל-HFK 8E6. התוצאות הראו כי 8E6 מגביר את הווריאציות הגנומיות בטווח של 200 קילו-בסיס סביב הפסקות הגדיל הכפול המושרות על-ידי CAS9, מה שמצביע על כך ש-HPV 8E6 מבטל את הוויסות של תיקון שברים דו-גדילי ומגביר את חוסר היציבות הגנומית. מטרת האימונובלוט היא למדוד את יעילות הטרנספקציה, שיש לקחת בחשבון במהלך ניתוח הנתונים.בנוסף ליעילות הטרנספקציה, מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית יכולה לשמש לאישור אינדוקציה של שבר דו-גדילי באמצעות phospho-H2AX כסמן. אנו משתמשים בבטא HPV 8E6 כדוגמה. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לזהות שינויים בתדירות המוטציה או בסוג שנגרמו על ידי ריאגנטים אחרים כגון מעכבי מולקולות קטנות.

using-next-generation-sequencing-to-identify-mutations-associated

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

העשרת gDNA לריצוף NGS היא כלי קל ורב עוצמה לחקר מוטציות חוקתיות. במאמר זה, אנו מציגים את ההליך לניתוח פשוט של הרצף המלא של 11 גנים המעורבים בתיקון נזק ל-DNA.

gDNA העשרה על ידי טכנולוגיה מבוססת Transposase לניתוח NGS של הרצף השלם של BRCA1, BRCA2, ו -9 גנים המעורבים בתיקון נזק לדנ"א

PCR חוסם מסוג פרא ואחריו ריצוף ישיר מציע שיטה רגישה ביותר לזיהוי מוטציות סומטיות בתדירות נמוכה במגוון סוגי דגימות.

חסימת PCR משולבת מסוג Wild עם רצף ישיר כשיטה רגישה עבור איתור של תדרים נמוכים מוטציות סומטיות

טכניקת גנוטיפ המתוארת כאן, אשר זוגות תגובת השרשרת של פולימראז פלורסנט (PCR) כדי נימי ג'ל אלקטרופורזה, מאפשרת גנוטיפ תפוקה גבוהה של שיבוטים בנוקאאוט בתיווך nuclease. זה עוקף מגבלות בפני טכניקות גנוטיפ אחרות הוא יותר חסכוני מאשר שיטות סידור.

באמצעות טכניקה ג&#39;ל אלקטרופורזה פלורסנט PCR-נימי הגנוטיפ קריספר / Cas9 בתיווך נוק מוטאנטים בתוך פורמט תפוקה גבוהה

פרוטוקול זה מתווה את זרימת העבודה של הגן מבוססת על CRISPR/Cas9 עריכת המערכת עבור התיקון של מוטציות נקודה בתרבית של תאים. כאן, אנו משתמשים בגישה קומבינטורית לעריכת ג'ין עם נתונים היסטוריים אסטרטגיה ניסיוני המשכית למדידת ויאסין היווצרות באתר היעד — בעיקרו של דבר, ניתוח מוטגנזה מכוונת באתר.

מתודולוגיה סטנדרטי כדי לבדוק באתר המוטגניות כפונקציה של תיקון נקודת מוטציה על ידי CRISPR/Cas9 ו- SsODN בתאי אדם

ג'ין יישוב עריכה באמצעות CRISPR/Cas9 הנחתה במידה רבה את ההבנה של פונקציות ביולוגיות של גנים. כאן, אנו מנצלים את המתודולוגיה CRISPR/Cas9 כדי דגם calreticulin מוטציות בתאים hematopoietic תלויי-ציטוקין לשם פעילותם oncogenic למידה.

שימוש CRISPR/Cas9 ג'ין עריכה כדי לחקור את פעילות Oncogenic Calreticulin מוטציה בתאים Hematopoietic תלויי ציטוקין

תיקון של זוגיות-גדיל DNA מעברי הוא תהליך דינמי, הדורשים לא רק היווצרות תיקון מכלולי השברים, אבל גם הרזולוציה שלהן לאחר הנגע הוא ממוען. כאן, אנו משתמשים מיקרוסקופ immunofluorescence עבור ארעי לטווח ארוך כפול גדילי ומעברי ככלי לנתח מנגנון תחזוקה זה הגנום.

אפיון תהליכי תיקון DNA-ארעי ומעברי DNA ארוך כפול-strand על ידי מיקרוסקופ Immunofluorescence

ספרייה CRISPR/sgRNA הוחל כדי לחקור חלבונים. עם זאת, הכדאיות של ספרייה sgRNA לחשוף את הפונקציה של גבול CTCF ב הכונה נשאר נחקרו. כאן, אנו מתארים ספרייה ספציפית sgRNA לוקוסים HOX התירי את הפונקציה של גבולות CTCF HOX לוקוסים.

HOX לוקוסים Focused CRISPR/sgRNA ספריית הקרנת זיהוי קריטי CTCF גבולות

מטרת פרוטוקול זה היא לאפשר עריכה חלקה של CRISPR/Cas9 של הגנום C. elegans באמצעות מתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים וסמן ה- DPY-10 המשותף CRISPR להקרנה. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבצע מגוון של שינויים גנטיים C. elegans כולל הוספות, מחיקות, תחליפי גנים והחלפות קודון.

CRISPR/Cas9 עריכה של ג'ין C. elegans rbm-3.2 באמצעות סמן ההקרנה DPY-10 Co-CRISPR ומתחמי ריבונוקלאופרוטאין מורכבים.

אסטרטגיות חדשניות למודל נאמן של מוטציות סומטיות בתאי גזע ותאי אב המטופויאטיים (HSPCs) נחוצות כדי לחקור טוב יותר ביולוגיה של תאי גזע המטופויאטיים וממאירויות המטולוגיות. כאן מתואר פרוטוקול למודל מוטציות רווח הטרוזיגוטיות ב-HSPCs על ידי שילוב השימוש ב-CRISPR/Cas9 והתמרה כפולה של תורמי rAAV.

הנדסת מוטציות הטרוזיגוטיות אונקוגניות בתאי גזע המטופויאטיים אנושיים ובתאי אב

אנו מציגים פרוטוקולים להערכת מיומנות מסלול תיקון שבר גדיל כפול בתאים באמצעות חבילה של מצעי כתב חוץ-כרומוזומליים מבוססי לומינסנציה.

הערכה של פעילות תיקון שבר גדיל כפול DNA באמצעות תפוקה גבוהה וכמותית מבוססת מבחני כתב

מחסום משמעותי לטכנולוגיות כמו CRISPR הוא אירועים מחוץ למטרה שיכולים לשבש גנים חיוניים. 'סירקולריזציה לדיווח במבחנה על השפעות מחשוף על ידי ריצוף' (CIRCLE-seq) היא טכניקה שנועדה לזהות אתרי מחשוף לא מכוונים. שיטה זו ממפה את הפעילות הכלל-גנומית של CRISPR-Cas9 ברגישות גבוהה וללא משוא פנים.

CIRCLE-Seq לחקירת עריכת גנים מחוץ למטרה

חקור זיהוי מוטציות בתיקון שברי DNA כפולים באמצעות CRISPR/Cas9 וריצוף הדור הבא בתאי קרטינוציט אנושיים. שיטה זו מציעה חלופה חסכונית ויעילה לריצוף גנום שלם לניתוח מנגנוני תיקון DNA.

שימוש בריצוף הדור הבא כדי לזהות מוטציות הקשורות לתיקון של שבר גדיל כפול המושרה על ידי CAS9 ליד מקדם CD4

גלה סרטונים נוספים