Name: פינצטה אופטית לחקר אינטראקציות בין RNA לחלבון בוויסות התרגום (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: למדו לחקור אינטראקציות RNA-חלבון באמצעות פינצטה אופטית ומיקרוסקופיית קונפוקל. הפרוטוקול מדגים מדידות כוחות פרישת RNA ומעקב אחר אירועי קשירה בוויסות תרגום בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לאנויה קייב וליוני פרופ' רדמונד סמית על סקירה ביקורתית של כתב היד. אנו מודים לטטיאנה קוך על הסיוע הטכני המומחה. אנו מודים לקריסטינה פקרקובה על העזרה בהקלטת סרטונים ניסיוניים. העבודה במעבדה שלנו נתמכת על ידי איגוד הלמהולץ ומימון ממועצת המחקר האירופית (ERC) גרנט 948636 (ל- NC).

למחברים אין מה לחשוף.

כאן, אנו מדגימים את השימוש פינצטה אופטית בשילוב פלואורסצנטיות כדי לחקור אינטראקציות והתנהגות דינמית של מולקולות RNA עם ליגנדים שונים. להלן, נדונים צעדים קריטיים ומגבלות של הטכניקה הנוכחית.
שלבים קריטיים בפרוטוקול באשר לשיטות רבות אחרות, איכות המדגם היא מרכזית כדי לקבל נתונים אמינים. לכן, כדי להשיג את הדגימות באיכות הגבוהה ביותר האפשרית, כדאי להשקיע זמן כדי לייעל את ההליך להכנת מדגם. שלבי האופטימיזציה כוללים עיצוב פריימר נכון, טמפרטורות חישול, RNA ושלבי טיהור חלבונים.
<p...

העברת מידע גנטי מדנ"א לחלבונים באמצעות mRNAs הוא תהליך ביוכימי מורכב, אשר מוסדר במדויק בכל הרמות באמצעות אינטראקציות מקרומולקולריות בתוך תאים. לוויסות תרגומי, אינטראקציות בין חלבון RNA מעניקות תפקיד קריטי להגיב במהירות לגירויים ולאותות שונים1,2. אינטראקציות מסוימות של חלבון RNA משפיעות על יציבות ה-mRNA ובכך משנות את הזמן ש-RNA פעיל מבחינה תרגומית. אינטראקציות אחרות של חלבון RNA קשורות למנגנוני recoding כגון קריאת עצירת קודון, עקיפת או מיזוג מסגרת ריבוזומלי מתוכנת (PRF)3,4,5,6,7. לאחרונה, מספר חלבונים מחייבי RNA (RBPs) הוכחו לקיים אינטראקציה עם אלמנטים mRNA מגרה ומכונות התרגום כדי להכתיב מתי וכמה recoding יתרחש בתא7,8,9,10,11. לכן, כדי לנתח את התפקיד של חלבונים מחייבי RNA בתרגום וכיצד הם לווסתים מבנה RNA ויציבות, זה חיוני ללמוד את עקרונות האינטראקציה ואת המאפיינים המכניים של מתחמי חלבון RNA אלה בפירוט.
עשרות שנים של עבודה הניחו את היסודות לחקר תהליך התרגום הרב-שלבי ורב-מרכיבים, הנשען על תקשורת מורכבת בין רכיבי הרנ"א והחלבון של מכונות התרגום כדי להשיג מהירות ודיוק12,13,14. צעד מכריע הבא בהבנת אירועים רגולטוריים מורכבים הוא קביעת הכוחות, צירי הזמן ודטרמיננטות מבניות במהלך התרגום בדיוק גבוה12,15,16,17. חקר הדינמיקה הקונפורמציה של RNA ובמיוחד האופן שבו גורמי עזר טרנס-פועלים על מבנה הרנ"א במהלך התרגום הוארו עוד יותר על ידי הופעתם של כלים חד-מולקולתיים, כולל פינצטה אופטית או מגלי גל במצב אפס16,17,18,19,20,21,22,23,24 25,26.
פינצטה אופטית (OT) מייצגת טכניקה מדויקת ביותר של מולקולה אחת, אשר יושמה כדי לחקור סוגים רבים של תהליכים דינמיים תלויי RNA כולל שעתוק, ותרגום26,27,28,29,30,31,32. השימוש בפינצטה אופטית אפשר לבחן אינטראקציות מולקולריות, מבני חומצות גרעין ומאפיינים תרמודינמיים, קינטיקה ואנרגטיה של תהליכים אלה בפירוט16,17,22,33,34,35,36,37,38,39 . פינצטה אופטית מבוססת על מלכוד של עצמים מיקרוסקופיים עם קרן לייזר ממוקדת. בניסוי OT טיפוסי, מולקולת העניין קשורה בין שני חרוזים שקופים (בדרך כלל פוליסטירן) (איור 1A)27. חרוזים אלה נתפסים לאחר מכן על ידי מלכודות אופטיות, אשר מתנהגים כמו מעיינות. לפיכך, ניתן לחשב את הכוח המופעל על המולקולה בהתבסס על תזוזת החרוז ממרכז קרן הלייזר הממוקדת (מרכז המלכודת). לאחרונה, פינצטה אופטית שולבה עם מיקרוסקופיה קונפוקלית (איור 1B), המאפשרת מדידות פלואורסצנטיות או העברת אנרגיית תהודה של פורסטר (FRET)40,41,42. זה פותח שדה חדש לגמרי של ניסויים אפשריים המאפשרים מדידה סימולטונית, ולכן, מתאם מדויק של ספקטרוסקופיה כוח נתוני פלואורסצנטיות.
כאן, אנו מדגימים ניסויים באמצעות פינצטה אופטית בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי לחקור אינטראקציות חלבון-RNA המסדירות את המסגרת התרגומית. בין המטרה לבין המחזק, תא זרימה עם חמישה ערוצים מאפשר יישום מדגם רציף עם זרימת למינאר. דרך הערוצים המיקרופלואידיים, ניתן להזריק רכיבים שונים ישירות, מה שמקטין את זמן הידיים, כמו גם מאפשר צריכת מדגם קטנה מאוד לאורך הניסוי.
ראשית, מוצעת הנחיה בסיסית לסיוע בתכנון ניסויי OT ונוצבים יתרונות כמו גם מלכודות של מערכונים שונים. לאחר מכן, הכנת דגימות וזרימות עבודה ניסיוניות מתוארות, ונדפק פרוטוקול לניתוח הנתונים. כדי לייצג דוגמה, אנו מתארים את התוצאות שהתקבלו מניסויי מתיחת RNA כדי לחקור את אלמנט ה-RNA של SARS-CoV-2 (איור 2A) עם גורם הטרנס-משחק האיזופורם הקצר של חלבון אנטי-ויראלי באצבע אבץ (ZAP), המשנה את התרגום של ה-RNA הנגיפי ממסגרת קריאה חלופית43. בנוסף, הוא הוכיח כי ריבוזומים תווית פלואורסצנטית ניתן להשתמש זה OT confocal assay, אשר יהיה שימושי כדי לפקח על העיבוד ואת המהירות של מכונות התרגום. השיטה המוצגת כאן יכולה לשמש כדי לבדוק במהירות את ההשפעה של מאגרים שונים, ליגנדים או רכיבים תאיים אחרים כדי ללמוד היבטים שונים של התרגום. לבסוף, נדונים מלכודות ניסיוניות נפוצות וכיצד לפתור אותן. להלן כמה נקודות מכריעות בעיצוב ניסיוני.
עיצוב מבנה באופן עקרוני, קיימות שתי גישות נפוצות ליצירת מבנה RNA תואם OT. הגישה הראשונה משתמשת במולקולת RNA ארוכה, המרוכזת בידיות דנ"א משלימות, ובכך מניבה מבנה המורכב משני אזורים היברידיים של רנ"א/דנ"א המאגפים רצף RNA חד-גדילי באמצע (איור 2B). גישה זו מועסקת ברוב ניסויי ה- OT RNA33,44,45.
הגישה השנייה מנצלת ידיות dsDNA עם overhangs קצר (סביב 20 nt) 15,17. ההכלאות האלה מהויברידיות עם מולקולת הרנ"א. למרות שהוא מסובך יותר בעיצוב, השימוש בידיות dsDNA מתגבר על חלק מהמגבלות של מערכת ה- DNA / RNA-היברידית. באופן עקרוני, אפילו ידיות ארוכות מאוד (>10kb) ניתן ליישם, וזה נוח יותר למדידות confocal. בנוסף, ניתן לקשור את מולקולת ה-RNA לידיות DNA כדי להגביר את יציבות הרצועה.
אסטרטגיית סימון קצה המבנה חייב להיות קשור חרוזים באמצעות אינטראקציה מולקולרית חזקה. אמנם יש גישות זמינות עבור מליטה covalent של ידיות חרוזים46, אינטראקציות חזקות אך לא קוולנטי כגון סטרפטבידין-ביוטין ו דיגוקסיגנין-נוגדן משמשים בדרך כלל בניסויי OT15,33,35,45. בפרוטוקול המתואר, המבנה מסומן ביוטין או דיגוקסיגנין, והחרוזים מצופים בסטרפטבידין או בנוגדנים נגד דיגוקסיגנין, בהתאמה (איור 1A). גישה זו תתאים להחלת כוחות עד כ-60 pN (לכל חבל)47. יתר על כן, השימוש באסטרטגיות תיוג שונות של 5' ו-3' מאפשר לקבוע את הכיוון של הרצועה שנוצרה בין החרוזים17.
תיוג חלבונים למדידות פלואורסצנטיות עבור הדמיה קונפוקלית, ישנן מספר גישות נפוצות עבור תיוג פלואורסצנטיות. לדוגמה, פלואורופורים יכולים להיות מחוברים באופן קוולנטי לשאריות חומצות אמינו שנמצאות באופן מקורי בחלבונים או מוצגות על ידי מוטגנזה מכוונת אתר באמצעות קבוצה אורגנית תגובתית. צבע תיול או אמין-תגובתי יכול לשמש לתיוג של שאריות ציסטאין וליצין, בהתאמה. ישנן מספר שיטות הגנה הפיכות כדי להגדיל את הספציפיות של labeling48,49, אולם חלבונים מקומיים בדרך כלל יסומנו בשאריות מרובות. למרות שהגודל הקטן של הפלורופור עשוי להעניק יתרון, תיוג לא ספציפי עלול להפריע לפעילות החלבון ולכן עוצמת האות עשויה להשתנות 49. כמו כן, בהתאם לעוצמת האות יעילות התיוג עשוי להיות שונה בין ניסויים שונים. לכן, יש לבצע בדיקת פעילות לפני הניסוי.
במקרה שחלבון העניין מכיל תג N-או C-terminal, כגון תג שלו או תג סטרפטופון, תיוג ספציפי של תגים אלה מייצג גישה פופולרית אחרת. יתר על כן, תיוג ממוקד תג מקטין את הסיכוי של פלואורופור מפריע לפעילות החלבון יכול לשפר את המסיסות49. עם זאת, תיוג ספציפי לתג בדרך כלל מניב חלבונים מונו-פלואורופור שכותרתו, אשר עשוי להיות מאתגר לזהות. דרך נוספת של תיוג ספציפי יכולה להתבצע על ידי שימוש בנוגדנים.
הגדרת מיקרופלואידיקה השילוב של OT עם מערכת מיקרופלואידיקה מאפשר מעבר מהיר בין תנאי ניסוי שונים. יתר על כן, מערכות נוכחיות מנצלות את השמירה על זרימת למינאר בתוך תא הזרימה, אשר מונע ערבוב של נוזלים מערוצים אחרים בכיוון הניצב ביחס לכיוון הזרימה. לכן, זרימת למינאר היא יתרון במיוחד עבור העיצוב הניסיוני. נכון לעכשיו, תאי זרימה עם עד 5 ערוצים נמצאים בדרך כלל (איור 3).

<table><tbody><tr><td><זנים חזקים>חיידקים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>E. coli HB101</td><td>אוסף מעבדה</td><td>N/A</td><td>של הווקטורים</td></tr><tr><td><חזקים>כימיקלים ואנזימים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>31424</td><td>חוצצים</td></tr><tr><td>ביוטין-16-dUTP</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td>ביוטינילציה</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4737</td><td>מאגרים</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>מערכת scavanger חמצן</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Melford Labs</td><td>D11000</td><td>Buffers</td></tr><tr><td>DNAse I מלבלב בקר</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>שעתוק במבחנה</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Th.Geyer</td><td>11786181</td><td>PCR</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E9884</td><td>חוצצים</td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' 11814320001</td><td>מאגרים</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>G8270-1KG</td><td>מערכת סקאוונג'ר חמצן</td></tr><tr><td>גלוקוז-אוקסידאז</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>מערכת סקאוונג'ר חמצן</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth</td><td>HN78.3</td><td>חוצצים</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>קארל רוט</td><td>2189.1</td><td>חוצצים</td></tr><tr><td>Phusion DNA פולימראז</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td>מכלול גיבסון, שיבוט</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Merck</td><td>529552-1KG</td><td>חוצצים</td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA Polymerase</td><td>Takara Bio Clontech</td><td>R050A</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Pyrophosphotase, תרמוסטאביל, אנאורגני</td><td>NEB</td><td>M0296L</td> מעכב RNase <td>שעתוק חוץ גופי</td></tr><tr><td></td><td>מאגר 1000379515 מולוקס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rNTPS</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>R0481</td><td>שעתוק במבחנה</td></tr><tr><td>נתרן תיוסולופאט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S6672-500G</td><td>השבתת אקונומיקה</td></tr><tr><td>Sytox Green</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>מדידות קונפוקליות</td></tr><tr><td>T4 DNA פולימראז</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td>ביוטינילציה</td></tr><tr><td>T5 אקסונוקלאז</td><td>NEB</td><td>M0363S</td><td>גיבסון הרכבה, שיבוט</td></tr><tr><td>T7 RNA פולימראז</td><td>מיוצר בבית</td><td>N/A</td><td>שעתוק במבחנה</td></tr><tr><td>Taq DNA פולימראז</td><td>NEB</td><td>M0267S</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Taq ligase</td><td>Biozym</td><td>L6060L</td><td>Gibson מכלול, שיבוט</td></tr><tr><td>TWEEN 20 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td>מאגרים</td></tr> <tr><td><חזקים>ערכות</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת תיוג חלבון מונוליט RED-NHS דור שני (אמין תגובתי)</td><td>Nanotemper</td><td>MO-L011</td><td>משמש לתיוג ריבוזומים</td></tr><tr><td>Purefrex 2.0</td><td>GeneFrontier</td><td>PF201-0.25-EX</td><td>ריבוזומים המשמשים לתיוג</td></tr><tr><td><חזק>אוליגונוקלאוטידים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5' ידית T7 קדימה</td><td>Microsynth</td><td>הזמנה</td> <td>מותאמת אישית5' - CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC - 3', משמש ליצירת תבנית תמלול OT במבחנה ב-PCR 1</td></tr><tr><td>3' ידית הפוכה</td><td>Microsynth</td><td>סדר מותאם אישית</td><td>5' -&nbsp; GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', משמש ליצירת תבנית תמלול OT במבחנה ב-PCR 1</td></tr><tr><td>5' ידית קדימה</td><td>Microsynth</td><td>הזמנה מותאמת אישית</td><td>5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3', משמש ליצירת ידית 5' ב-PCR</td></tr><tr><td>2 5' ידית הפוכה</td><td>Microsynth</td><td>הזמנה מותאמת אישית</td><td>5' - CATAAATACCTCTTTACTAATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3', משמש ליצירת ידית 5' ב-PCR 2</td></tr><tr><td>3 'ידית קדימה</td><td>Microsynth</td><td>הזמנה מותאמת אישית</td><td>5' - ATCCTGCAACCTGCTCTCTTCGCC AG - 3', המשמש ליצירת ידית 3' ב-PCR</td></tr><tr><td>3 3' ידית הפוכה 5' מתויג עם digoxigenin</td><td>Microsynth</td><td>הזמנה מותאמת אישית</td><td>5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCCCTTTATCC - 3', המשמש ליצירת ידית 3' ב-PCR 3</td></tr><tr><td><חזק>וקטורי DNA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pMZ_OT</td><td>מיוצר ב-N</td><td>/A</td> פנימי <td>תיאור נוסף ב"מחקרים מבניים של חלבון Cardiovirus 2A חושפים את הבסיס המולקולרי לזיהוי RNA ובקרת תרגום" כריס ה. היל, סאוסן נפטין, לוקאס פקרק, אנוג'ה קיבה, אנדרו א. פירת', סטיבן סי גרהאם, נבה קליסקאן, איאן בריירלי bioRxiv 2020.08.11.245035; doi: https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035</td></tr><tr><td>תוכנה ואלגוריתמים</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atom</td><td>https://atom.io/packages/ide-python</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>Bluelake</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad</td><td>https://www.graphpad.com/</td> <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>InkScape 0.92.3</td><td>https://inkscape.org/</td> <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td><td>תפוחי</td> אדמה https://github.com/lpekarek/POTATO.git <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>לא / A</td><td></td></tr><tr><td>RNAמבנה</td><td>https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html</td><td>לא ישים</td><td></td></tr><tr><td>ספיידר</td><td>https://www.spyder-ide.org/</td> <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td><חזק>אחר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>חלקיקי פוליסטירן מצופים סטרפטווידין, 1.5-1.9 ומיקרו; m, 5 מ"ל, 1.0% משקל/נפח</td><td>Spherotech</td><td>SVP-15-5</td><td></td></tr><tr><td>חלקיקי פוליסטירן מצופים אנטי-דיגוקסיגנין, 2.0-2.4 ומיקרו; m, 2 מ"ל, 0.1% משקל/נפח</td><td>Spherotech</td><td>DIGP-20-2</td><td></td></tr><tr><td>מזרקים</td><td>VWR</td><td>TERUMO SS+03L1</td><td></td></tr><tr><td><חזק>התקנים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-trap</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>&nbsp; פינצטה אופטית בשילוב מיקרוסקופיה קונפוקלית</td></tr></tbody></table>

פינצטה אופטית לחקר אינטראקציות בין rna לחלבון בוויסות התרגום

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA מאמצת קפלים מבניים מגוונים, החיוניים לתפקודיו ובכך יכולים להשפיע על תהליכים מגוונים בתא. בנוסף, המבנה והתפקוד של RNA יכול להיות מווסת על ידי גורמים טרנס-משחק שונים, כגון חלבונים, מטבוליטים או RNAs אחרים. מולקולות RNA משניות מסגרת, למשל, הן RNAs תקינים הממוקמים באזורי קידוד, אשר מכוונים את הריבוזומים למסגרת קריאה פתוחה חלופית, ובכך פועלים כמתגי גנים. הם עשויים גם לאמץ קפלים שונים לאחר קשירה לחלבונים או גורמים טרנס אחרים. כדי לנתח את תפקידם של חלבונים מחייבי RNA בתרגום וכיצד הם מווסתים את מבנה הרנ"א ואת היציבות, חיוני ללמוד את יחסי הגומלין והמכניים של מתחמי חלבון RNA אלה בו זמנית. עבודה זו ממחישה כיצד להשתמש פינצטה אופטית מצמידה מולקולה אחת-פלואורסצנטית כדי לחקור את הנוף הקונפורמציה והתרמודינמי של מתחמי חלבון RNA ברזולוציה גבוהה. כדוגמה, האינטראקציה של ה- SARS-CoV-2 מתוכנתת מסגרת ריבוזומלית אלמנט עם גורם טרנס-משחק איזופורם קצר של חלבון אנטי ויראלי באצבע אבץ הוא פירט. בנוסף, ריבוזומים המסומנים בפלואורסצנטיות היו במעקב באמצעות יחידת הקונפוציה, אשר בסופו של דבר תאפשר את חקר התארכות התרגום. בדיקת OT בשילוב פלואורסצנטיות יכולה להיות מיושמת באופן נרחב כדי לחקור מתחמי חלבון RNA מגוונים או גורמים טרנס-משחק המסדירים תרגום ויכול להקל על מחקרים של ויסות גנים מבוססי RNA.

בסעיף זה, המיקוד ניתן בעיקר על מדידות של אינטראקציות חלבון RNA/ ליגנד על ידי פינצטה אופטי פלואורסצנטית. לתיאור של ניסויי פינצטה אופטיים כלליים של RNA ותוצאות מייצגות מתאימות, ראה 32. לדיון מפורט יותר באינטראקציות בין RNA לחלבון DNA, ראו גם 1,2,26,59,60.
באופן עקרוני, כריכה של RBP או כל גורם עניין טרנס-משח...

פרוטוקול זה מציג זרימת עבודה ניסיונית מלאה לחקר אינטראקציות חלבון RNA באמצעות פינצטה אופטית. מספר הגדרות ניסיוניות אפשריות מתארות כולל שילוב של פינצטה אופטית עם מיקרוסקופיה קונפוקלית.

פינצטה אופטית לחקר אינטראקציות בין RNA לחלבון בוויסות התרגום

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

המטרה הכוללת של מאמר השיטה הבאה היא להדגים פרוטוקול שימושי כדי ללמוד אינטראקציות RNA עם חלבונים או גורמים אחרים באמצעות פינצטה אופטית בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. בעשור האחרון פותחו מספר טכניקות מתוחכמות כדי לחקור את המאפיינים של מקרומולקולים בודדים. אחת הטכניקות האלה היא פינצטה אופטית של מולקולה אחת.עם פינצטה אופטית חדשה בסיוע פלואורסצנטיות, לא רק כוחות הנדרשים להתפתחות של מולקולות RNA, כמו גם אירועים מחייבים במהלך התרגום ניתן לפקח בפירוט. כאן אנו מתמקדים במדידות שבהן מולקולות RNA נמתחות עם ובלי גורמי טרנספרציה המסדירים את התרגום. אנו גם ממחישים כיצד ניתן ליישם את הטכניקה לניטור התרגום באמצעות ריבוזומים המסומנים בתווית.הפרוטוקול יודגם על ידי שני סטודנטים לתארים מתקדמים בקבוצה שלי, לוקאס פקארק וסטפן פארק. בסרטון זה, אנחנו הולכים להנחות אותך דרך ההתקנה והביצוע של ניסוי פינצטה אופטית. אנו גם מתארים את זרימת העבודה הפשוטה של ניתוח נתונים.היתרון של טכניקה זו הוא שהיא פשוטה וחזקה. מולקולה קשורה בין שני חרוזים, קשורה במוקד קרני לייזר, ושינוי וכוח בעת תזוזה ניתן למדוד במדויק במה שמכונה ניסויים ברמפה כוח. מבנים משניים בתוך חבל נפרשים בכוח מסוים בהתאם לאנרגיה הפנימית של המולקולה.מעבר דינמי זה בין מבנים מרובים ניתן לחקור עוד יותר עם מדידות כוח קבועות. יתר על כן, השימוש המקביל של הדמיה פלואורסצנטית יכול לשמש כדי לדמיין אירועים מחייבים בזמן אמת. פרופיל ברור של מרחק כוח של קשר עשוי להשתנות לאחר כריכת גורמי טרנספרציה פוטנציאליים המשפיעים על יציבותו.ראשית, הרנ"א של עניין צריך להיות משובט לתוך וקטור DNA. במעלה ובמורד הזרם של רצף זה, חלקים נוספים, הידיות נדרשות כדי לקשור את מבנה ה- DNA-RNA הסופי בין החרוזים. לאחר שיבוט מוצלח והגברה של plasmid, שלוש תגובות PCR שונות מבוצעות.עבור כל תגובת PCR, מערבבים את הריאגנטים לפי טבלה אחת בפרוטוקול. הפעל את ה- PCR ב-50 עליקוטים מיקרוליטרים ברכב אופניים תרמי מתאים. הראשון גורם לדנ"א כפול של כל המבנה עם מקדם T7 לתמלול במבחנה שלאחר מכן.ה-PCR השני מייצר את חמש הידיות הראשיות. בעוד שהתגובה האחרונה גורמת לשלוש הידיות העיקריות. יש לתייג הן את 5 נקודות הפריים והן את 3 ידיות הפריים לפי החרוזים המשומשים.שלוש נקודות האחיזה העיקריות מסומנות במהלך ה-PCR באמצעות פריימר הפוך עם תווית דיגוקסיגנין, ויש לתייג את חמש הידיות העיקריות בשלב נוסף באמצעות ביו-טינילציה. שלוש הביוטילציה העיקרית של חמש הידיות העיקריות מבוצעת באמצעות T 40 ופולימראז. התגובה מתבצעת במשך שעה עד שעתיים בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, לבצע את תמלול אין ויטרו באמצעות T7 פולימראז. לדגור על התגובה ב 37 מעלות במשך שעתיים עד ארבע שעות, בהתאם לאורך הרנ"א. בשלב אחד אחרון, הידיות מחושלות עם ה- RNA מהתעתיק במבחנה כדי להשיג את מבנה ה- DNA-RNA הסופי עם אזור העניין התקוע היחיד בין הידיות התקועות הכפולות.כדי לטל את היברידית ה-RNA-DNA הרצויה, מערבבים את הידיות ואת הרנ"א במאגר חישול. מחממים, תערובת חישול עד 85 מעלות במשך 10 דקות, ולאחר מכן לאט לאט לקרר את המדגם לארבע מעלות. מערבבים את המדגם המחושג עם 1/10 של נפח של שלושה אצטט נתרן טוחן, ושלושה כרכים של אתנול קר קרח ודגרה מינוס 80 מעלות במשך שעה לפחות.צנטריפוגה הדגימות ב 15, 000 xg במשך 30 דקות בארבע מעלות. להשליך את supernatant ולייבש את הכדור תחת ואקום. עליקוטים קטנים של הכדור resuspended קפואים בחנקן נוזלי נשמרים במינוס 80 מעלות עד שהם משמשים.ראשית להסיר את המלבין מתוך המזרקים ולמלא mL אחד של מים חינם RNase. מוסיפים 50 מיקרוליטר של נתרן טוחן 0.5 תיוסולפט ושטפו את המערכת עם מוט אחד. היזהר כי המערכת microfluidic אף פעם לא פועל יבש כדי למנוע בועות אוויר במערכת.לאחר מכן, להשליך את פתרון נתרן thiosulfate הנותר ולהחליף את המזרקים עם חדשים. ואז לשטוף שוב עם לפחות 0.5 מ"ל של מים חינם RNase. כדי להגדיר את המערכת האופטית של המכונה, לשים שתי טיפות של שמן טבילה על המטרה.שים את תא הזרימה במקום ולהעלות את המטרה עד הנוזל נוגע בתא הזרימה. ואז לשים שתי טיפות של שמן טבילה על גבי תא הזרימה. עכשיו להפעיל את יחידת היגוי מלכודת ולייזר הלכיד.המטרה מותאמת באמצעות כלי איתור Z של מצלמות האבחון של המכונה. על ידי סיבוב בורג המיקרו, ציר Z מותאם לאמצע התא בין ההשתקפות השנייה והשלישית. היכן שטבעות השחלה הן הגדולות ביותר.מעבירים את מצלמות האבחון למצב ירח ומפחיתים את לייזר ההשמנה לסביבות 50%ואז מורידים את המעבה ומתאימים את מיקומו כך שתראו כ-10 רצועות אור. לתא המדידה יש חמישה ערוצים, ולפני הניסוי יש לשקול אפשרויות התקנה שונות. לניסוי פשוט של רמפה כוח, חרוזים-חוצץ-חרוזי הוא סידור ערוצים נוח.עבור מדידות עם המתחם הרביעי, כמו ריבוזומים פלואורסצנטיים או גורמי טרנספר, גורם חרוזים-חרוזים-חוצץ הוא סידור טוב יותר, אבל זה מקשה על לתפוס חרוזים. aliquot של מבנה חישול הוא דגירה עם שלושה השעיית חרוזים MICROLITER AD, מעכבי RNase microliter אחד, ושמונה microliter של חוצץ בדיקת בטמפרטורת החדר במשך 10 עד 20 דקות. לאחר מכן המדגם מדולל ב-500 מיקרו-ליטר, ובחצץ.עבור הסוג השני של חרוזים, 0.8 microliter של חרוזי אסאי מעורבבים עם mL אחד של חוצץ אסאי ומנוהל לתוך הערוץ המתאים. הערוצים נפתחים ונשטפים בלחץ נמוך. עכשיו תדליק את לייזר ההשמנה.כדי לתפוס חרוזים, הלייזרים מופרדים זה מזה וחרוז AD נתפס במלכודת אחת. בשלב הבא הבמה מועברת לערוץ חרוז SA וחרוז נתפס במלכודת 2. כדי להימנע מאובדן החרוזים, או כדי לתפוס שני באותה מלכודת, הבמה מועברת לערוץ המאגר וכל הערוצים סגורים.במאגר מתבצע כיול השמנה. יש להגדיר את החרוזים שנתפסו כתבניות חזותיות עבור המדידות הבאות. וציון הדמיון צריך להישמר מעל 90% בין מדידות כדי להבטיח השוואתיות.לבסוף, החרוזים מועברים קרוב יותר זה לזה ואפשר להתחיל לתפוס קשר אחד. זה נעשה הזזת החרוזים קרוב במשך כמה שניות ולאחר מכן לאט לאט לעזוב את החרוזים שוב. היווצרות קשירה גורמת לעלייה של כוח מדוד על משיכת שני החרוזים אחד מהשני.ניתן לבדוק את מספר ואיכות הצמיגים על ידי מציאת הרמה המתוחה ולהשוות את המסלול עם השרשרת המשותפת החופשית או מודל השרשרת דמוי התולעת. הרמה המתוחה צריכה להיות בין 50 ל -60 piconewton עבור חבל אחד. כדי לבצע את מדידות הפלואורסצנטיות, הפעל את הלייזרים הקונפוקליים ואת ספירת הפוטוסים על יחידת ומכונת פינצטה אופטית.לאחר מכן, הפעל את לייזר העירור של אורך הגל הרצוי ואת ממשק התוכנה והגדר את כוח הלייזר ל -5% ומעלה, בהתאם לפלואורופור. כעת ניתן להתחיל בהדמיה באמצעות פונקציות התמונה או הקימוגרף של התוכנה. על מנת לקבל תמונות ממוקדות היטב, ודא כי מישור המוקד של מיקרוסקופ קונפוקלי ואת המלכודות האופטיות מיושרים.לשם כך, ניתן להשתמש בפלואורסצנטיות של חרוזי הפוליסטירן בערוץ הלייזר הכחול. לנוע למעלה ולמטה עם המישור המוקד של המלכודות האופטיות עד autofluorescence של החרוזים מגיע הקוטר הגבוה ביותר שלה. במיקום זה, ניתן לזהות את אותות הפלואורסצנטיות המתרחשים במולקולה קשורה.עבור שתי הפונקציות חשוב לבחור את אזורי העניין המתאימים. לאורך כל הרכב מאגר המדידה ניתן לשנות בקלות על ידי העברת החרוזים לערוצים שונים, או על ידי שינוי המאגר המסופק במערכת microfluidic. כדי למנוע הלבנת תמונות, תמיד לכבות את לייזר העירור כאשר לא מדידה.פלט הנתונים הגולמיים מהמכשיר מכיל לעתים קרובות הרבה רעש. לכן, על מנת להמשיך לנתח נתונים מפוזרים, יש הראשון לעבד אותם מראש. השלב הראשון הוא להוריד את המדגם ולסנן את הנתונים עם מסנן Butterworth לעבור נמוך, תוצאות טובות הושגו.לניסויי רמפה כוח, האירועים המתפתחים צריכים להיות מסומנים באזורים המקופלים והמפותלים המתאימים של עקומת המרחק הראשונה ניתן להתקין באמצעות שרשרת דמוית תולעת או מודלי שרשרת משותפים בחופשיות. עבור נתוני הכוח הקבועים, ניתן להתוות את המרחק לאורך זמן וכדאי ליצור היסטוגרמה כדי לכמת את הקונפורמציה הדומיננטית בכוח נתון. כאן מוצג כי הפרמטרים המסננים חיוניים כדי להבחין בין מצבי קיפול שונים.כדי להבין טוב יותר מה ניתן להשיג בטכניקה זו, כמה תוצאות מייצגות מוצגות. כך נראית עקומת מרחק כוח סטנדרטית מניסוי של רמפה כוחית. במקרה זה, חקרנו את אלמנט הסטת המסגרת של SARS-coronavirus-2.ראינו התגלגלות במספר צעדים סביב 15 piconewton. כאשר הכיוון הפוך והחרוזים מתקרבים שוב, הרצועה חוזרת בעוצמה מעט נמוכה יותר. כאשר מדדנו את אותו RNA בנוכחות חלבון אנטי ויראלי אצבע אבץ ZAP, דפוס דומה של התגלגלות נצפתה.אבל המבנה המשני של הרנ"א לא התגלגל מחדש. זוהי דוגמה טובה כדי להראות איזו השפעה גדולה חלבון מחייב יכול להיות על קינטיקה RNA. כשמסתכלים על נתוני כוח קבועים ניתן לחקור עוד יותר את הקינטיקה המתפתחת.המרחק לאורך זמן מתוות לכוחות שונים וההיסטוגרמה של המדינות השונות שנצפו מתווספת מימין. ב 10 piconewton, RNA הוא לגמרי במצב מקופל. ב 11.5 piconewton הוא עובר בין מדינות, וב 13 piconewton הרנ"א הוא לצמיתות במצב נפרש.עם זאת, כאשר אלמנט הסטת המסגרת של SARS-coronavirus-2 נמדד יחד עם ZAP, ה- RNA היה לגמרי במצב של 11 piconewton, ואפילו הראה מעט מאוד מעבר למצב מקופל ב 10 piconewton. הדבר מציין כי ZAP נקשר לרכיב הסטת המסגרת התקועה היחידה ומונע היווצרות של מבנה משני. לבסוף, נבחן כמה נתוני פינצטה אופטיים יחד עם מיקרוסקופיה קונפוקלית.בניסוי זה, נעשה שימוש בצבע פלואורסצנטי המתייג חומצות גרעין נטושות כפולות, לא במיוחד עם כוח גובר. הקימוגרף מראה שככל שהחרדים מתרחקים זה מזה, עוצמת הפלואורסצנטיות עולה והיא נעלמת לחלוטין ברגע שהקשירה נמתחת יותר מדי ונשברת. באיור האחרון שכותרתו פלואורסצנטית ריבוזומים נוספו דרך ערוץ ארבע.בניסוי זה נצפתה כריכה ספציפית של ריבוזום לקשירת הרנ"א. אנו מקווים שהסרטון הזה נתן לכם תובנה על פינצטה אופטית ומה ניתן לבצע את הטכניקה המדהימה הזו.

optical-tweezers-to-study-rna-protein-interactions-translation

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מדגים בדיקת RNA במבחנה נפתחת לזיהוי חלבונים קושרי RNA (RBPs), אשר מקיימים אינטראקציה עם רצפי היסוד העשיר באדנילט-אורידילאט (ARE) ב-mRNA. RBPs המטרה מליזט התא מעורבבים עם בדיקת RNA כדי ליצור קומפלקסים של RNA-חלבון. הקומפלקסים מבודדים באמצעות טיהור זיקה תוך ניצול הזיקה של תווית הדסתיוביוטין של גשושית הרנ"א לחרוז מגנטי המסומן בסטרפטווידין.

RNA-Protein Pull-Down Assay לבידוד חלבונים קושרי RNA באמצעות מיצוי זיקה

כאן אנו מתארים את המכשור ושיטות לגילוי מולקולות חלבון בודד fluorescently שכותרתו אינטראקציה עם מולקולת DNA חד התלויה בין שני microspheres הלכוד אופטי.

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

פינצטה אופטית שימשה לחקר קיפול RNA על ידי מתיחת מולקולות בודדות מקצות 5' ו-3' שלהן. כאן מתוארים נהלים נפוצים לסינתזה של מולקולות RNA לפינצטה, כיול המכשיר ושיטות למניפולציה של מולקולות בודדות.

Nanomanipulation של יחיד RNA מולקולות על ידי מלקחיים אופטיים

כתב יד זה מתאר שיטה כדי להמחיש ולכמת תרגום לשפות אחרות אירועים בתאים subcellular. הגישה המוצעת כתב יד זה דורש מערכת הדמיה קונאפוקלית בסיסית, ריאגנטים, והוא מהיר וחסכוני.

Immunofluorescence כמותי מודדים הגלובלי לשפות אחרות תרגום

Toeprinting נועד למדוד את היכולת של במבחנה עיבד RNA ל טופס תרגום חניכה מתחמי עם הריבוזומים תחת מגוון תנאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור toeprinting בתרבית של RNA והוא יכול לשמש כדי ללמוד תרגום תלויי-קאפ והן מונחות IRES.

ניתוח Toeprinting של תרגום חניכה היווצרות מורכבות על יונקים mRNAs

טנדם RNA בידוד שגרה (טיול) עבור שחזור של mRNA בנוי endogenously-חלבון מתחמי מתואר. באופן ספציפי, מתחמי RNA-חלבון תפור ויוו, polyadenylated RNAs מבודדים של תמציות עם חרוזים oligo(dT), mRNAs מסוים נלכדים עם ששונה oligonucleotides antisense RNA. חלבונים מאוגדים mRNAs מזוהים על-ידי ניתוח immunoblot.

הליך בידוד RNA טנדם מבוססי Oligonucleotide לשחזר את מתחמי ה-mRNA האיקריוטים-חלבון

בשיטה זו, אנו מכמת את הזיקה המחייב של מאגד כריכת RNA (rbps) כדי קנצוני ואתרי כריכה שאינם קנצוני באמצעות שיטה פשוטה, לחיות, העיתונאי בתאי חיידקי. השיטת היסוד מבוססת על דיכוי של גן עיתונאי.

שיטת בדיקת מעטפת חלבון-RNA כריכת חיידקים

שיטת ה-DNA כפול מפותחת כדי לקבוע את מיקום mRNA במהלך הריבוטרנסלוקציה, אשר נשענת על כוחות הדיסוציאציה של דופלקסים DNA-mRNA הנוצר. עם יחיד-נוקלאוטיד החלטה ויכולת להגיע שני הקצוות של mRNA, זה יכול לספק תובנות מכניסטיות עבור טרנסלוקציה ריבוכמה ולחקור אחרים חומצות גרעין displacements.

שליטי ה-DNA כפול ללמוד את המנגנון של טרנסלוקציה הריבוכמה עם פתרון יחיד נוקלאוטיד

העברת אנרגיה פלואורסצנטית של מולקולה בודדת היא שיטה העוקבת אחר הדינמיקה של ה- tRNA במהלך סינתזת חלבונים ריבוזומליים. על ידי מעקב אחר ריבוזומים בודדים, זוהו אוכלוסיות לאהומוגניות, אשר שופכים אור על מנגנונים. שיטה זו יכולה לשמש כדי לעקוב אחר שינויים קונפורמציה ביולוגית באופן כללי כדי לחשוף קשרי גומלין דינמיים-פונקציה במערכות ביולוגיות מורכבות רבות אחרות. שיטות מולקולה בודדת יכולות לבחון צעדים מגבילים שאינם בקצב ומתווכים מרכזיים מאוכלסים נמוך, שאינם נגישים בשיטות הרכב קונבנציונליות בשל האפקט...

מולקולה בודדת פלואורסצנטית העברת אנרגיה מחקר של סינתזת חלבון ריבוזום

אינטראקציות של תרגום משותף ממלאות תפקיד מכריע בשינויים בשרשרת המתהווה, במיקוד, בקיפול ובמסלולי הרכבה. כאן, אנו מתארים פרופיל ריבוזום סלקטיבי, שיטה לניתוח ישיר של in vivo, של אינטראקציות אלה במודל eukaryote Saccharomyces cerevisiae.

זיהוי גלובלי של רשתות אינטראקציה בין תרגומים משותפים על ידי פרופיל ריבוזום סלקטיבי

כאן, אנו מציגים שיטה מותאמת במבחנה לחשיפה, כימות ואימות של אינטראקטורים חלבוניים של רצפי RNA ספציפיים, תוך שימוש בתמצית חלבון כוללת מתאים אנושיים, חרוזי סטרפטווידין המצופים ב-RNA ביוטינילציה וניתוח ספקטרומטריית מסות.

ניתוח כמותי אופטימלי של חלבונים קושרי RNA באמצעות RNA קצר ביוטינילציה

למדו לחקור אינטראקציות RNA-חלבון באמצעות פינצטה אופטית ומיקרוסקופיית קונפוקל. הפרוטוקול מדגים מדידות כוחות פרישת RNA ומעקב אחר אירועי קשירה בוויסות תרגום בזמן אמת.

פינצטה אופטית לחקר אינטראקציות בין RNA לחלבון בוויסות התרגום

גלה סרטונים נוספים