הפעלה והטיאה של פוליסכרידים מסיסים באמצעות 1-Cyano-4-דימתילאמינופירידין טטרפלואורובוראט (CDAP)

פוליסכרידים הם אימונוגניים בצורה גרועה אלא אם כן הם קשורים לחלבון ויש להפעילם לצורך נגזרת או הטיות לחלבונים. בשיטה זו, CDAP משמש כמדבר חול. ה- CDAP מפעיל הידרוקסילים פוליסכרידים לגזרה או להיות מקושר לחלבונים לשימוש בחיסונים או ריאגנטים אבחנתיים.

CDAP החליף במידה רבה ציאנוגן ברומיד כמו ריאגנט מטען חול פוליסכריד. CDAP הוא פשוט יותר לשימוש, יעיל יותר, וניתן להשתמש בו ב- pH נמוך יותר מאשר ציאנוגן ברומיד. זה ריאגנט הרבה יותר טוב.

CDAP יכול לשמש עם רוב פוליסכרידים, שלא כמו למשל amination רדוקטיבי, אשר דורש הידרוקסילים ויקנין. הכימיה יכולה לשמש הן במישרין והן בעקיפין מצומדת לחלבונים, וניתן להשתמש בה כדי ליצור ריאגנטים אבחנתיים. תגובת ההפעלה של CDAP, כפי שתואר במקור, הייתה מהירה מאוד וקשה לשליטה.

הפרוטוקול המסופק כאן הופך את הכימיה להרבה יותר קלה לביצוע והרבה יותר ניתנת לשחזור. לפני תחילת הניסוי, להתאים את ה- pH של פתרון פוליסכריד ל 9 על ידי הוספת 200 microliters של תמיסת מלאי dimethylaminopyridine באופן dropwise תוך ערבוב. שמור את התגובה מקוררת באמבט מי קרח במשך כל תהליך ההפעלה.

המשך עם צילאנו-דימטילמינופירידאין-טטרפלואורובוראט או הפעלת CDAP על ידי העברת 100 מיקרוליטרים של CDAP לתמיסת הפוליסכריד תוך כדי ערבוב. הפעל את טיימר ולנטר את שינוי ה- pH במהלך ההפעלה כולה במשך 15 דקות. שמור על התגובה ב- pH היעד על ידי הוספת 10 תוספת מיקרוליטר במהירות של 0.1 נתרן הידרוקסיד טוחנת.

כאשר זמן ההפעלה האופטימלי הוא הגיע, להוסיף שני מיליליטר של 0.5 אדיפיק אדיהיפיק דיהידזיד 0.5 אדיפיק בבת אחת לפוליסכריד מופעל. בדוק כי ה- pH נמצא בטווח הנדרש לפונקציונליזציה של הידרוקסיד. לאחר ערבוב מתמשך של תערובת התגובה במשך שעה אחת לפחות, להעביר את תערובת התגובה לארבע מעלות צלזיוס.

כדי להפחית את ריכוז ADH מהמוצר, חייג את פתרון הפוליסכריד הגולמי שמקורו באמצעות התקן הדיאליזה. לשחזר את הפוליסכריד נגזר דיאליזה ולקבוע את הריכוז של פוליסכרידים הידרזיד כדי לחשב את הידראזיד ליחס פוליסכריד. הכן מיליגרם אחד למיליליטר פתרון פוליסכריד לא שנופץ שישמש כסטנדרט.

מחממים את בלוק החימום ל-140 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות כדי להשיג טמפרטורה אחידה ויציבה. השתמש כרית מגן מתחת וסביב בלוק החימום במקרה של שפיכות חומצה. הוסף כמויות משתנות של מיליגרם אחד למיליליטר פחמימות תקן לכותרת 13 על 100 מביצות borosilicate בטריפליקאטים ולהגדיר את הנפח ל 100 microliters עם מים כדי להשיג את הריכוזים הסטנדרטיים הרצויים.

באופן דומה, להגדיר בדיקות מדגם על ידי הוספת נפח המכיל חמישה מיקרוגרם של פוליסכריד נגזר לשלושה צינורות מדגם. הוסף 100 מיקרוליטרים של שישה מיליגרם טרי מוכן למיליליטר resorcinol לכל צינור. באמצעות pipetter חוזר, להוסיף 300 microliters של חומצה גופרתית מוכן 75%לכל צינור, מערבולת הצינורות במרץ, הצבעת הצינור משם, ולאחר מכן למקם את כל הצינורות בלוק תנור בקצב קבוע בסדר רציף מיד להגדיר את הטיימר במשך שלוש דקות.

בשלוש דקות, להסיר את הצינורות באותו סדר ולהניח אותם ישירות על מתלה באמבט מי קרח. הסר את צינורות קרים קרח כדי לאפשר להם להתפלש לטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. קרא את הספיגה של כל הצינורות על ספקטרופוטומטר UV-Vis ב 430 ננומטר באמצעות cuvette אורך נתיב 10 מ"מ.

כדי להגדיר תגובות מבחנים, מיין וסדר את הצינורות הסטנדרטיים המסומנים במתלה הצינורות על מנת להגביר את הריכוז. באמצעות מיקרופיפט מכויל, הוסף 100 מיקרוליטרים של הסטנדרטים לכל צינור מתאים. עבור תקן האפס, השתמש ב- 100 מיקרוליטרים של מאגר הדגימה.

באופן דומה, להכין ולסדר את צינורות מדגם. לאחר מכן, באמצעות מיקרופיט 1,000 מיקרוליטרים מכוילים, הוסף 875 מיקרוליטרים של חיץ בדיקות לכל צינורות ה- assay. כדי להתחיל את תגובת בדיקת ההסתה, הוסיפו 25 מיקרוליטרים של 1%, חומצה גופרתית טריניטרבנזן לכל צינור אסאי בסדר קבוע מראש תוך חמש דקות.

מערבולת צינורות ה- assay במשך שתי שניות במהירות גבוהה, מוודאת שהנוזל מסתחרר לגובה של חצי סנטימטר מפתיחת הצינור. הקלט את שעת ההתחלה של ההסתה והגדר את הטיימר לשעתיים. ואז למקם את מתלה צינור בדיקת בחושך בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.

בסיום הזמן, מערבולת הצינורות ולהמשיך לאיסוף נתונים. דקסטרן ADH נטען עבור דקסטרן באמצעות בדיקת חומצה גופרתית resorcinol. צינור סטנדרטי טיפוסי באמצעות גלוקוז כמו תקן הסוכר היה שרטט.

תכולת ההידרזיד בפוליסכריד נגזר או דקסטרן נקבעה באמצעות בדיקת TNBS. רמת הגזרה חושבה כהירידים לכל 100 קילודלטון של דקסטרן כדי להקל על ההשוואה בין פולימרים במשקלים מולקולריים ממוצעים שונים. ייתכן שיהיה צורך להתאים את הפרוטוקול המתואר כאן לפוליסכריד מסוים.

הכימיה CDAP יכול לשמש כדי פונקציונליזציה פוליסכרידים לשימוש עם מגוון רחב של ריאגנטים הטיות. זה יכול לשמש, למשל, כדי biotinylate פוליסכרידים לשימוש ב ELISAs. חלבונים יכולים להיות מקושרים ישירות פוליסכרידים המופעלים על ידי CDAP, אבל זה בדרך כלל דורש קצת אופטימיזציה עבור פוליסכריד ספציפי.

תפוקת ההטיה יכולה להיות מעל 75% השימוש בכימיה של CDAP איפשר חיסונים מצומדים בעלות נמוכה, כמו אלה שנעשו, למשל, על ידי מכון הסרום של הודו.