Name: הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 18 s
Description: חקור בניית בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות עם תרופות וחומרים רעילים סביבתיים. שיטה זו מאפשרת הערכת חדירות וספיגת תרכובות בקרומים ביולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

חומר זה מבוסס על עבודה הנתמכת על ידי הקרן הלאומית למדע תחת גרנט מס ' 1942418 שהוענק ל- A.S., ומלגת מחקר לתואר שני של הקרן הלאומית למדע שהוענקה ל- C.M.B.H., תחת גרנט מס '1644760. כל הדעות, הממצאים, המסקנות או ההמלצות המובעות בחומר זה הן של המחברים ואינן משקפות בהכרח את עמדות הקרן הלאומית למדע. המחברים מודים לד"ר נואל ורה-גונזלס על רכישת נתוני אפיון השומנים. המחברים מודים לפרופסור רוברט הארט (אוניברסיטת בראון) על השימוש בזטסייזר שלו. המחברים מודים למתקן ספקטרומטריית המסה של אוניברסיטת בראון, בפרט, ד"ר טון-לי שן על הסיוע בכימות הרכב השומנים.

המחברים מצהירים כי אין להם ניגוד אינטרסים או אינטרסים פיננסיים מתחרים.

פרוטוקול זה מאפשר היווצרות שלפוחיות שומנים בדם, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ו bilayers שומנים מושעה. כאן מוצגים צעדים קריטיים ליצירת כל אחד מהמבנים הללו. בעת יצירת שלל שומנים, חשוב להבלט מעל טמפרטורת המעבר של השומנים39. כאשר מתחת לטמפרטורת המעבר, השומנים נוכחים פיזית בשלב הג'ל המוזמן שלו39. בשלב מסודר זה זנבות השומנים פחמימנים מורחבים לחלוטין ומאפשרים אריזה קרובה, מה שהופך את שחול מאתגר39. כאשר מחומם מעל טמפרטורת המעבר, השומנים הופך יותר הפרעה וכתוצאה מכ...

קרום התא, המורכב בעיקר פוספוליפידים, כולסטרול, וחלבונים, הוא מרכיב מכריע של כל התאים החיים1. עם ארגון מונע על ידי אמפיפיליות שומנים בדם, קרום התא מתפקד כמחסום מגן ומסדיר כיצד התא אינטראקציה עם הסביבה שמסביב2. מספר תהליכים תאיים תלויים בהרכב השומנים והחלבון של הממברנה1,2. לדוגמה, אינטראקציות קרום התא חשובות עבור משלוח סמים יעיל3. תרופות, ביולוגיות, ננו-חומרים, רעלנים ביולוגיים ורעילים סביבתיים יכולים להשפיע על שלמות קרום התא, ובכך להשפיע על תפקוד התא4. בניית תאי במבחנה מחקה מודלים ממברנה המבוססים על הרכב השומנים של קרום התא יש פוטנציאל לספק כלים facile כדי לשפר מאוד את המחקר של ההשפעה הפוטנציאלית של חומרים אלה על תאים.
דו-שכבתי השומנים לדוגמה כוללים שלפוחיות שומנים בדם, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ובולייה שומנים מושעים. bilayers שומנים נתמכים הם מודל של קרום התא פוספוליפיד נפוץ ביישומי ביוטכנולוגיה שבו שלפוחיות השומנים נקרעים על חומר מצע נתמך5,6,7,8,9. טכניקה נפוצה אחת המשמשת לניטור היווצרות bilayer היא מיקרו-איזון גביש קוורץ עם ניטור פיזור (QCM-D), הבוחן את ספיחת שלפוחיות בהשוואה למאפיינים הנוזליים בתפזורת במקום8,10,11,12,13,14 . בעבר, QCM-D שימש כדי להדגים כי בתנאי זרימה, פעם כיסוי ארסית קריטית של שלפוחיות שומנים (PC) מושגת על פני השטח, הם נקרעים באופן ספונטני לתוך bilayers שומנים נוקשים15. עבודה קודמת חקרה גם היווצרות דו-שכבתית שומנים נתמכת עם הרכבים שומנים שונים16, שילוב של חלבונים שומניםבדם 17,18,19, וניצול כריות פולימר20, מניב bilayers שומנים נתמכים מסוגל לחקות היבטים שונים של תפקוד קרום התא.
bilayers השומנים שימשו כדי לחקות מחסומים ביולוגיים שונים מן תת התא לרמות איברים כולל מיטוכונדריון, תא דם אדום, קרום תא הכבד על ידי שינוי רכיבי פוספוליפיד, כולסטרול, וגליקולפיד21. שלל רב שומנים מורכבים יותר אלה עשויים לדרוש שיטות נוספות כדי להשיג קרע ארסי, בהתאם להרכב השומנים. לדוגמה, מחקרים קודמים השתמשו בפפטיד α-סלילי (AH) הנגזר מהחלבון הלא מובנה של נגיף הפטיטיס C 5A כדי לגרום להיווצרות דו-שכבתית על ידי ערעור שלטי השומנים הפולאים22,23. באמצעות פפטיד AH זה, דו-שכבות שומנים נתמכות המחקות תאי שליה נוצרו בעבר24. הפוטנציאל הגדול של bilayers שומנים נתמך עבור יישומים ביו-רפואיים הוכח עם חקירות המשתרעות על פני מולקולרית וננו-חלקיקים25,26, אינטראקציות רעילות סביבתיות27, הרכבת חלבון ופונקציה17,18,19, סידור פפטיד והכנסת28,29, הקרנת סמים30,ופלטפורמות מיקרופלואידיות31.
bilayers שומנים מושעים שימשו למחקרי הקרנה פרמצבטית באמצעות בדיקת חדירות קרום מלאכותי מקביל (PAMPA) שבו bilayer שומנים מושעה על פני תוספת הידרופובית נקבובי32,33,34,35. מודלים שומנים PAMPA פותחו עבור ממשקים ביולוגיים שונים כולל הדם - מוח, buccal, מעיים, וממשקים transdermal36. על ידי שילוב הן של דו-שכבתי השומנים הנתמכות והן טכניקות PAMPA, ספיחה, חדורות והטמעה של תרכובות בתוך רכיבי השומנים של רקמה רצויה או סוג התא ניתן ללמוד ביסודיות.
פרוטוקול זה מתאר את הייצור והיישום של מודלים bilayer השומנים קרום התא במבחנה לחקור מספר אינטראקציות מולקולריות. הכנת דו-לשוניים חד-שומניים ורב-שומנים הנתמכים והשעייתם של שכבות השומנים מפורטת. כדי ליצור דו-שכבתית שומנים נתמכת, שלפוחיות שומנים מפותחות לראשונה באמצעות שיטות הידרציה ושחול סרט דק ואחריו אפיון פיזיקוכימי. היווצרות של דו-שכבתי שומנים נתמך באמצעות ניטור QCM-D ייצור של קרומי שומנים מושעים לשימוש PAMPA נדון. לבסוף, שלל רב שומנים להתפתחות של ממברנות מורכבות יותר חיקוי תאים נבדקים. באמצעות שני סוגי ממברנות שומנים מפוברקות, פרוטוקול זה מדגים כיצד כלי זה יכול לשמש לחקר אינטראקציות מולקולריות. בסך הכל, טכניקה זו בונה תאים מחקים שכבות שומנים עם רבייה גבוהה ורבגוניות.

<table><tbody><tr><td>1-פלמיטויל-2-אולויל-גליצרו-3-פוספוכולין&nbsp; (POPC, 16:0-18:1 PC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td> 850457-1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine <td></td></tr><tr><td>(מלח נתרן) (POPS, 16:0-18:1 PS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td> 840034-1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine <td></td></tr><tr><td>(16:0-18:1 PE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td> 850757-1,2-dioleoyl-sn-glycero-2-phospho-L-serine <td></td></tr><tr><td>(DOPS, 18:1 PS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC, 18:1 (&Delta; 9-Cis) PC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td> 850375-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine <td></td></tr><tr><td>(DOPE, 18:1 (&Delta; 9-CIS) PE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td> 850725-1,2-distearoyl-sn-glycero-3-ethylphosphocholine <td></td></tr><tr><td>(מלח כלוריד) (18:0 EPC (מלח Cl))</td><td>ליפידים קוטביים של Avanti</td><td>890703</td><td></td></tr><tr><td>3 מ"ל מזרקי Luer-Loc</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>בקבוקון דגימה של 40 מ"ל, ענבר עם פוליטטרפלואורואתילן (PTFE)/תוחם גומי</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>W224605</td><td></td></tr><tr><td>אצטוניטריל</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>271004</td><td></td></tr><tr><td>אלקונוקס</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-821-781</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פורמט</td><td>Millipore Sigma</td><td>LSAC70221</td><td></td></tr><tr><td>C18, עמודה 3.5 אום x 50 מ"מ, SunFire</td><td>Waters</td><td>&nbsp; </td><td></td>186002551</tr><tr><td></td><td>Chloroform Millipore Sigma</td><td>LSAC288306</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette UV Micro LCH 8.5 מ"מ, 50 אום, RPK</td><td>Sarstedt</td><td>67.758.001</td><td></td></tr><tr><td>Di(2-ethylhexyl) phthalate (DEHP)</td><td>Millipore Sigma</td><td>36735</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Millipore Sigma</td><td>LSAC472301</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>תומכי מסנן, 10 מ"מ</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610014</td><td>גודל למיני אקסטרודר</td></tr><tr><td>תא זטה נימי מקופל</td><td>Malvern Panalytical</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>190764-4L</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34256</td><td></td></tr><tr><td>L-&alpha;-phosphatidylinositol (soy) (Soy PI)</td> <td>Avanti Polar Lipids</td><td></td><td></td></tr><tr><td>840044 L-&alpha;-פוספיטידילכולין (ביצה, עוף)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td> 840051-LiposoFast <td></td></tr><tr><td>&reg; LF-50</td><td>Avestin, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td> 179337 - סט מיני מכבש <td>4 ליטר</td><td></td></tr><tr><td>עם מחזיק/בלוק חימום</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>MultiScreen-IP לוחית סינון, 0.45&nbsp; ומיקרו; m, שקוף וסטרילי</td><td>Millipore Sigma</td><td>MAIPS4510</td><td>למחקרי PAMPA</td></tr><tr><td>גז חנקן,</td> ממברנות הידרופיליות <td>TechAir</td><td>NI T5.0</td><td></td></tr><tr><td>Nuclepore Ultrapure , פוליקרבונט, 19 מ"מ, 0.1 אום</td><td>Whatman</td><td>800309</td><td>גודל למיני אקסטרודר</td></tr><tr><td>ממברנות הידרופיליות Nuclepore, פוליקרבונט, 25 מ"מ, 0.1 אום</td><td>Whatman</td><td></td><td>110605 גודל למכבש גדול</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>פוספט מאגר מלח (PBS), 10x</td><td>Genesee Scienfitic</td><td>25-507X</td><td>לדלל ל-1x</td></tr><tr><td>Qsoft 401 תוכנה</td><td>Biolin Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קוורץ קריסטל מיקרו-איזון עם פיזור Q-Sense מנתח</td><td>Biolin Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני נצנוץ, בקבוקוני זכוכית בורוסיליקט, 20 מ"ל</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>986561</td><td></td></tr><tr><td>צורן דו-חמצני, QSensors דק</td><td>Biolin</td><td>Scientific QSX 303</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>Millipore Sigma</td><td>LSACS5886</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-100</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה בטוחים לממס</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8064</td><td></td></tr><tr><td>Sphingomyelin (ביצה, עוף)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td></td><td></td>860061</tr><tr><td>בסיס Trizma</td><td>Millipore Sigma</td><td>LSACT1503</td><td></td></tr><tr><td>חומצה טריפסין-אתילנדיאמינטרטאצטית</td><td>Caisson Labs</td><td>TRL01-6X100ML</td><td></td></tr><tr><td>דיסק ניקוז Whatman, 25 מ"מ</td><td>Whatman</td><td>230600</td><td>גודל עבור מכבש גדול</td></tr><tr><td>Zetasizer ZS90</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer 7.01 תוכנה</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

מודל קרום התא הם כלי סינון שימושי עם יישומים החל גילוי סמים מוקדם מחקרים רעילות. קרום התא מהווה מחסום מגן חיוני לכל סוגי התאים, המפריד בין הרכיבים התאיים הפנימיים לסביבה החוץ-תאית. ממברנות אלה מורכבות בעיקר מביבאי שומנים, המכיל קבוצות ראש הידרופיליות החיצוניות וקבוצות זנב הידרופוביות פנימיות, יחד עם חלבונים וכולסטרול שונים. הרכב ומבנה השומנים עצמם ממלאים תפקיד מכריע בוויסות התפקוד הביולוגי, כולל אינטראקציות בין תאים לבין המיקרו-סביבה התאית, שעשויה להכיל תרופות, רעלים ביולוגיים וטפילים סביבתיים. במחקר זה, שיטות לגיבוש חד שומנים, מרובה שומנים תומכים ותא מושעה מחקה bilayers שומנים מתוארים. בעבר, פוספטידילכולין חד שומני (PC) bilayers שומנים, כמו גם רב שומנים שליה טרופיבלסט בהשראת bilayers שומנים פותחו לשימוש בהבנת אינטראקציות מולקולריות. כאן יוצגו שיטות להשגת שני סוגי דגמי הדו-שכבתיה. עבור תאים מחקים דו-שכבתיים מרובי שומנים, הרכב השומנים הרצוי נקבע תחילה באמצעות מיצוי שומנים מתאים ראשיים או מקווי תאים ואחריו ספקטרומטריה נוזלית של כרומטוגרפיה-מסה (LC-MS). באמצעות קומפוזיציה זו, שלפוחיות השומנים מפוברקות בשיטת הידרציה ושחול סרט דק ואת הקוטר ההידרודינמי שלהם ואת פוטנציאל זטה מאופיינים. לאחר מכן ניתן ליצור דו-שכבתי שומנים נתמכים ומושעים באמצעות מיקרו-איזון קריסטל קוורץ עם ניטור פיזור (QCM-D) ועל קרום נקבובי לשימוש בבדיקת חדירות מקבילה של קרום מלאכותי (PAMPA), בהתאמה. התוצאות הייצוגיות מדגישות את הרבייה והרבגוניות של דגמי דו-שכבתי השומנים של קרום התא במבחנה. השיטות המוצגות יכולות לסייע בהערכה מהירה ומקלה של מנגנוני האינטראקציה, כגון חדירות, ספיחה והטמעה, של מולקולות שונות ומקרומולקולות עם קרום התא, המסייעות בהקרנת מועמדים לתרופות וחיזוי רעילות תאית פוטנציאלית.

פרוטוקול זה מפרט שיטות ליצירת דו-שכבתיות שומנים נתמכות ומושעות(איור 1). הצעד הראשון ליצירת דו-שכבתי שומני נתמך הוא לפתח שלל שומנים. מחשוף מיני מאפשר כמויות קטנות של שלשולי שומנים להיות מוכן (1 מ"ל או פחות), בעוד המחשוף הגדול מאפשר 5-50 מ"ל של שלשולי שומנים להיות מוכן באצווה אחת. התפלגות הגודל של שלשלולי השומנים החד-שומניים שנוצרו על ידי האקספלודר המיני או הגדול מוצגות באיור 2A. כמו extruder גדול משתמש בלחץ גבוה N2 גז לדחוף את הפתרון ארסית דרך קרום פול...

פרוטוקול זה מתאר היווצרות של תאים מחקים שלפוחיות חד-שומנים ורב-שומנים, דו-שכבתי שומנים נתמכים, ושכבות שומנים מושעות. מודלים במבחנה אלה ניתן להתאים לשלב מגוון רחב של סוגי שומנים וניתן להשתמש בהם כדי לחקור מולקולות שונות ואינטראקציות macromolecule.

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

בניית ממברנות דו-שכבתיות שומנים המתוארות בפרוטוקול זה יכולה לשמש כדי לקבל מידע חיוני על אינטראקציות ממברנה עם סוכני תרופות, רעילים סביבתיים, ואפילו תרכובות ביולוגיות. טכניקות אלה יכולות לשמש כדי לפברק ממברנות של מורכבות נוזלית משתנה, ולהעריך חדירות תרכובת, ספיגה, והטמעה בתוך ממברנות. כדי להתחיל, להוסיף את הנפח המתאים של תמיסת מלאי השומנים לתוך זכוכית נקייה לתפלת כדי להשיג ריכוז ארסיות סופי של 2.5 מיליגרם למיליליטר לאחר rehydration.הסר כלורופורם מתמיסת השומנים, באמצעות זרם של גז חנקן. כדי להבטיח הסרה מלאה של כלורופורם, חבר את סרט השומנים המיובש לוואקום במשך ארבע שעות לפחות. Rehydrate סרט השומנים היבש עם נפח נדרש של חוצץ טריס נתרן כלורי כדי להניב את ריכוז ההזרמה הסופי של 2.5 מיליגרם למיליליטר, מערבולת במשך כ 15 עד 30 שניות.מעבירים את ההשעיה הארסית למיכל עם קרח יבש עד להקפאה של כ-30 דקות. לאחר המדגם קפוא לחלוטין, להפשיר את ההשעיה באמבט מים 30 עד 40 מעלות צלזיוס. מערבולת השעיית ארסיה מופשרת.כדי להפוך מיליליטר אחד או פחות של שלל, להשיג מחול מיני. יש להרטיב מסנן עם מים טהורים במיוחד, ולאחר מכן להניח אותו על משטח התמיכה בממברנה בתוך טבעת ה-O. חזור על הפעולה לקבלת התמיכה הפנימית השנייה בממברנה.מקם תמיכה פנימית אחת בממברנה לתוך המארז החיצוני של המהלומה. הנח קרום פוליקרבונט אחד של 100 ננומטר על התמיכה הפנימית בממברנה ישירות מעל התמיכה במסנן. מקם את התמיכה הפנימית השנייה בממברנה לתוך המארז החיצוני של המהלומה עם טבעת O וסינון צד תמיכה מול קרום פוליקרבונט.חבר את הפוליטרפלואורואתילן הנושא לתוך קשר שכר הטרחה ובורג אותו סגור עם המארז החיצוני של המכבש. חותכים את המהלל לבלוק החימום. לטעון את ההשעיה השומנים לתוך אחד המזרקים למקם את המזרק לתוך בלוק חום extruder, החדרת המחט באופן מלא לתוך קצה אחד של המכבש.הכנס את המזרק הריק השני לצד הנגדי ונעל את שני המזרקים באמצעות מהדקי הזרוע על בלוק החום. לאט לאט לדחוף את ההשעיה vesicle לתוך המזרק הריק ולאחר מכן בחזרה למזרק המקורי. חזור על 20 פעמים נוספות עבור סך של 21 עובר דרך קרום פוליקרבונט.מעבירים את שלל השומנים לשפל זכוכית נקי לאחסון. כדי להבליט חמישה עד 50 מיליליטר של שלל, להרכיב את המבליט הגדול על ידי הצבת התמיכה במסך החור הגדול, דיסק ממורכז, דיסק ניקוז, וקרום פוליקרבונט לתוך החלל בתמיכה התחתונה extruder. חבר את התמיכה העליונה והתחתון באמצעות ארבעת הברגים והידוק.חבר את יחידת המבליט לצילינדר המדגם על ידי קרצוף זה לתחתית והידוק עם מפתח ברגים כדי לאבטח. מלא את גליל המדגם במים אולטרה-סברים ונווט את המים דרך יחידת האקסטרודר לפני הוספת הדגימה לצילינדר המדגם. מוסיפים את מתלה השומנים לצילינדר המדגם ומברגים את החלק העליון סגור.לאט להגביר את הלחץ עד המדגם מתחיל לטפטף מיחידת extruder בקצב של כ שתיים עד שלוש טיפות לשנייה לתוך זכוכית נקייה. לאחר כל המדגם כבר extruded, לכבות את אספקת חנקן ולשחרר את הלחץ בצילינדר המדגם על ידי פתיחת שסתום הקלה בלחץ לאט. יוצקים את שלטי השומנים בחזרה לתוך גליל המדגם ולחזור על השלב הקודם תשע פעמים נוספות עבור סך של 10 שחול.טען את ההשעיה הזרימה לתוך cuvette המתאים, ולהכניס לתוך מכשיר פיזור האור הדינמי, להזין את פרטי המדגם, ולבצע את המדידה באמצעות התוכנה המשויכת. מניחים את תא הזטה בתא הדגימה, ומוודאים שהאלקטרודות נמצאות בקשר, וסוגרים את מכסה מחזיק הדגימה. בתוכנה המשויכת, הזן את הפרטים לדוגמה ואסוף מדידות.הכנס את חיישן גביש הקוורץ המקודד של סיליקה למודול הזרימה, והבטח שצורת ה- T על הגביש תתיישר עם צורת ה- T במודול ותברג את מודול הזרימה סגור. במכשירים עם תאים מרובים, bilayers נוספים ניתן ליצור במקביל. חבר את הצינורות והשקע למודול הזרימה והמשאבה.מניחים את הצינורות לתוך שומרי ההחזקה וסוגרים את המכסה של מערכת המנתח. מניחים מיכל פסולת בשקע המשאבה כדי לאסוף פתרונות שהוצאו. כדי לבצע את הניקוי, הפעל תחילה את המשאבה והגדר את מהירות הזרימה ל-400 מיקרוליטרים לדקה.הכנס את צינורות הכניסה למים טהורים במיוחד ולזרום חמישה עד 10 מיליליטר דרך המודול. החלף צינורות לתוך SDS ולהזרים חמישה עד 10 מיליליטר דרך המודול. מעבירים צינורות בחזרה למים טהורים במיוחד וזורמים 10 עד 20 מיליליטר דרך המודול.לבסוף, לזרום אוויר דרך המודול עד שלא נאסף פתרון שנותר. הסר את החיישן ממודול הזרימה ושטוף את החיישן במים טהורים במיוחד. כונן החיישן ואת מודול הזרימה עם זרם גז חנקן, מוודא כי האלקטרודה תמיד נשאר ללא כל נוזל.במכסה המנוע הכימי, הכנס את חיישן גביש הקוורץ מצופה סיליקה למכשיר ניקוי אולטרה סגול או אוזון. הפעל את המכשיר ולאפשר טיפול במשך שתי דקות לפחות. הסר את החיישנים בזהירות והחזר אותם לתוך מודול הזרימה.הפעל את מכשיר המנתח כדי לחבר את התוכנה המשויכת ולהגדיר את הטמפרטורה לערך הרצוי ליצירת דו-שכבתי השומנים התומך. אפשר לטמפרטורה להתייצב לקלט הרצוי. קבע את תצורת המדידה ומצא את כל תדרי התהודה של החיישן, ופיזור צלילים 3, 5, 7, 9, 11 ו- 13 לפני תחילת המדידה.אפשר ל-Tris נתרן כלוריד לזרום דרך המודול במשך חמש עד עשר דקות, מה שמבטיח שהשדר הבסיסי ישתנה או דלתא F ושינוי פיזור או ערכי דלתא D בנוזל יישארו יציבים. עצרו את המשאבה, הסירו את צינורות הכניסה מתמיסת טריס נתרן כלורי, והכניסו אותה בזהירות לתמיסת השומנים. זרימה אחורית למשך חמש שניות כדי להסיר את כל בועות האוויר מהצינורות בפרצון, ולאחר מכן להמשיך את הזרימה קדימה.הפעל מחדש את המדידה בתוכנה כדי לאפס את קו הבסיס. לזרום שלטי שומנים עד היווצרות bilayer הוא ציין בזמן אמת בתוכנה לרכישת נתונים. לאחר מכן חזור על שלב זה כדי לשנות את צינורות ההכנסה של שלל השומנים בחזרה למאגר נתרן כלורי טריס.הוסף חמישה microliters של פתרון השומנים לתא התורם, שהוא דיפלואוריד פוליווינילידן נקבובי 96 היטב צלחת מסנן רב מסך עם גודל נקבובית 0.45 מיקרו מטר. מיד להטביע את צלחת המסנן לתוך תא הקבלה, שהוא צלחת מקלט תובלה המכיל 300 microliters של תמיסת מלח חוצץ פוספט. הוסף 200 מיקרוליטרים של תמיסת מלח חוצץ פוספט לתא תורם התחבורה.בצע את השלבים הקודמים של עצירת המשאבה ושינוי צינורות הכניסה לפתרון ארסילי שומנים וצפייה היווצרות bilayer, ולאחר מכן לשנות את צינורות הכניסה לתוך פתרון אלפא הלילי או AH פפטיד. הצג את הפתרון לתוך מודול הזרימה עד שינוי תדירות ושינוי פיזור נצפים מתוספת הפתרון החדשה. עצרו את המשאבה ואפשרו לפפטיד AH לדגור עם שלל במשך 10 דקות.החליפו את צינורות הכניסה ל-Tris נתרן כלורי, והתחלו את הזרימה כדי להסיר את הפפטיד של AH משלשלות הקרועות, מה שמוביל להיווצרות מוצלחת של דו-שכבתית שומנית. ראשית, להזרים את ממס המולקולה, ולאחר מכן, להעביר את צינורות הכניסה לתוך הפתרון המכיל את המולקולה של עניין ולזרום במשך חמש דקות לפחות. אם תרצה, לעצור את הזרימה ולאפשר לנוזל המכיל את המולקולה הרצויה לדגור עם bilayer.לשנות את צינורות המפרצון בחזרה לממס המולקולה לבד. לזרום במשך חמש דקות לפחות, ולאחר מכן להעביר את צינורות הכניסה לתוך טריס נתרן כלורי, ולזרום במשך חמש דקות לפחות. בתוכנה, הפסק את המדידה, שמור את הקובץ והפסק את המשאבה.מיד לאחר שלבים קודמים עבור bilayer מושעה שומנים חד שומנים או עבור bilayer מושעה שומנים מרובים, להסיר PBS מתא צלחת מסנן התורם ולהחליף עם 200 microliters של פתרון הבדיקה. מיד לשקוע בלוח מקלט תחבורה חדש עם 300 microliters של PBS. לאחר דגירה עם נדנדה עדינה במשך שעתיים ב 25 מעלות צלזיוס, לאסוף 150 microliters של הפתרון מן התורם ותאי הקבלה.מדוד את ריכוז המולקולה בשתי הדגימות בשיטה מתאימה המבוססת על תכונות של מולקולה זו. גודל, polydispersity, ופוטנציאל זטה של שלל מחשב ביצה חד שומנים, ושני הרכבים ארסיות שומנים מרובים הושוו. התפלגות הגודל של שלל מחשב הביצה ושלשלות מרובות שומנים היו כמעט זהות.שלל אחד מרובה שומנים של ביצים ומחשב אישי טעונים לרעה, בעוד שני שלטי שלטי שומנים מרובים טעונים באופן חיובי. שלפוחיות מחשב ביצה חד-שומנית נספגות בקלות על פני השטח, כפי שמוצג על ידי הירידה בשינוי התדר, ועלייה בשינוי פיזור, ואחריו קרע ספונטני. שלטי שומנים מרובים נספגים על פני השטח, אבל דורשים את התוספת של פפטיד AH כדי לקרוע את שלל, וכתוצאה מכך היווצרות bilayer השומנים.עם bilayers שומנים נתמכים, שינוי תדירות ושינוי פיזור ניתן לנתח לפני ואחרי הצגת תרכובת של עניין. לדוגמה, אינטראקציות של DEHP ורעיל סביבתי עם חד נתמך ורב שכבתי על ידי שכבות נחקרו. רמות דומות של ספיגת DEHP נצפו עבור שני סוגי bilayer השומנים.עם זאת, הבדלים בשינוי פיזור נצפו בין bilayers עם שינוי פיזור גדול יותר לראות עבור bilayer PC ביצה לעומת bilayer אחד שומנים מרובים. חלחלה קטנה נצפתה הן עבור דו-שכבתיות חד-שומניות והן עבור שכבות מרובות שומנים. בעקבות הליך זה, ניתן לפתח מגוון של תאים מחקים שכבות שומנים כדי לאפשר הקרנה ללא תאים של אינטראקציות מולקולריות עם תרכובות החל תרופות רעילים סביבתיים.

assembly-cell-mimicking-supported-suspended-lipid-bilayer-models-for

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

Bilayers מישוריים נתמכים הם כלים רבי עוצמה שיכולים לשמש מודל אינטראקציות מולקולריות בסינפסה האימונולוגית. כאן, אנו מציגים שיטות לעיגון הידבקות התא חלבונים ידועים לווסת היווצרות הסינפסה לעלון העליון של bilyer השומנים ולדמיין היווצרות הסינפסה באמצעות מיקרוסקופ TIRF.

Bilayers מישורי נתמכות עבור תצורת לימוד של סינפסות החיסונית Kinapse

בסרטון זה, אנו מדגימים הליך לחקירת ארגון ספטין על שכבה דו-שכבתית ליפידית הנתמכת בזכוכית במבחנה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת.

בדיקת דו-שכבתית ליפידית נתמכת מישורית: טכניקת מבחנה מבוססת מיקרוסקופיה לחקר הרכבת ספטין על חיקויי קרום ביולוגי

bilayers שומנים נתמך וחלקיקי קרום טבעיים הם מערכות נוחים שיכול להתקרב למאפיינים של קרום תא ולהיות משולבות במגוון רחב של אסטרטגיות אנליטיות. כאן אנו מדגימים שיטה להכנת microarrays המורכב של SiO 2 חרוזים נתמכים שומנים מצופים bilayer, שלפוחית ​​פוספוליפידים או חלקיקי קרום טבעיים.

היווצרות של microarrays Biomembrane עם שיטת הרכבה מבוססת מגב

אנו מתארים פרוטוקול להכנת שכבות דו-שכבתיות ליפידים נתמכות ואפיונו באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי וספקטרוסקופיית כוח.

כוח האטומי מיקרוסקופית הדמיה וחיל ספקטרוסקופיה של bilayers שומנים הנתמכים

אנו מדגימים מערכת היווצרות bilayer שומנים שאפשר לשמור, יבילה. קרום bilayer השומנים יכול להיווצר בתוך שעה 1 עם למעלה מ -80% אחוזי הצלחה כאשר מבשר קרום קפוא מובא טמפרטורת הסביבה. מערכת זו תפחית תהליכי מייגע ומומחיות הקשורים תעלות יונים.

גיבוש ליפידים אוטומטי bilayer ממברנה באמצעות סרט polydimethylsiloxane רזה

אנו מספקים פרוטוקול עבור במבחנה מבחני ארגון עצמי של המוח, שלי ליפידית הנתמכות בחדר פתוח. בנוסף, אנו נתאר כיצד הקף וזמינותו של לבושת השומנים microcompartments PDMS לחקות ויוו תנאים על ידי תגובת כליאה.

במבחנה בנייתו מחדש של דפוסי חלבון ב- Bilayers הנתמכים השומנים ארגון-עצמי

היתוך מיטוכונדריאלי הוא תגובה הוםוסטטית חשובה הבסיסית לדינמיקה המיטוכונדריאלית. מתואר כאן היא מערכת איסוף חוץ תוך כדי לימוד היתוך מיטוכונדריאלי פנימי-קרום שיכול לפתור רצועה קרום, עגינה, המיתוך, ופתיחת נקבוביות. הרב-תכליתיות של גישה זו בחקר מערכות קרום התא נדון.

פלטפורמת ממברנה לדוגמה לשיכור דינמיקת קרום מיטוכונדריאלי

פרוטוקול זה מתאר את היווצרותם של דו-שכבתיות שומנים נתמכות ואת התוספת של חוטים ציטוסקטליים וחלבונים מוטוריים כדי לחקור את הדינמיקה של רשתות ציטוסקטליות משוחזרות, הקשורות לממברנה, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שחזור של קליפות אקטין מינימליות הקשורות לממברנה על דו-שכבתיות שומנים נתמכות

שחזור ללא תאים היה כלי מרכזי להבנת הרכבת השלד של הציטוסקלטון, והעבודה בעשור האחרון ביססה גישות לחקר דינמיקת ספטין במערכות מינימליות. מוצגות כאן שלוש שיטות משלימות לצפייה בהרכבת ספטין בהקשרים שונים של ממברנות: דו-תאיים מישוריים, תומכים כדוריים ותמיכות מוטות.

שחזור של מכלול ספטין בממברנות לחקר תכונות ותפקודים ביופיזיים

כאן מוצג פרוטוקול לביצוע וניתוח הקשירה, הניידות וההרכבה של מולקולות בודדות על ממברנות שומנים מלאכותיות צפופות באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת של מולקולה אחת (smTIRF).

דיפוזיה והרכבה של מולקולה בודדת על ממברנות שומנים עמוסות פולימרים

גיוון השומנים בממברנה במבנה ובהרכב הוא תורם חשוב לתהליכים תאיים ויכול להיות סמן למחלות. סימולציות של דינמיקה מולקולרית מאפשרות לנו לחקור ממברנות ואת יחסי הגומלין שלהן עם ביומולקולות ברזולוציה אטומית. כאן, אנו מספקים פרוטוקול לבנייה, הפעלה וניתוח של מערכות ממברנות מורכבות.

מידול ממברנות מציאותי באמצעות תערובות שומנים מורכבות במחקרי סימולציה

חקור בניית בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות עם תרופות וחומרים רעילים סביבתיים. שיטה זו מאפשרת הערכת חדירות וספיגת תרכובות בקרומים ביולוגיים.

הרכבה של חיקוי תאים מודלים נתמכים ומושעים של בולי עץ לחקר אינטראקציות מולקולריות

גלה סרטונים נוספים