Name: בדיקת הפעלת בזופיל לאבחון אלרגיה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
Description: למדו בדיקת הפעלת בזופיל לאבחון אלרגיות IgE-ממומנות באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו מסייעת לחוקרים לאבחן תגובות לתרופות, מזון וחומרים נשימתיים תוך הימנעות מבדיקות אתגר מבוקרות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לקלאודיה קוראצה על תמיכתה בשפה האנגלית שלא תסולא בפז. עבודה זו נתמכה על ידי המכון לבריאות ''קרלוס השלישי'' (ISCIII) של MINECO (מענק במימון משותף של ERDF: "Una manera de hacer Europa"; מענקים מס' PI20/01715; PI18/00095; PI17/01410; PI17/01318; PI17/01237 ו- RETIC ARADYAL RD16/0006/0001; משרד הבריאות האזורי של אנדלוסיה (מענק מס' PI-0127-2020, PIO-0176-2018; PE-0172-2018; PE-0039-2018; PC-0098-2017; PI-0075-2017; PI-0241-2016). ID הוא חוקר קליני (B-0001-2017) ו-AA מחזיק בחוזה פוסט-דוקטורט בכיר (RH-0099-2020), שניהם נתמכים על ידי משרד הבריאות האזורי של אנדלוסיה (במימון משותף של ESF: "Andalucía se mueve con Europa").

ביצוע הפרוטוקול נערך על פי עקרונות הצהרת הלסינקי ואושר על ידי ועדת האתיקה המקומית (Comité de Ética para la Investigación Provincial de Málaga, ספרד). כל הנבדקים קיבלו מידע בעל פה על המחקר והם חתמו על טופס ההסכמה מדעת המתאים.
הערה: הפרוטוקול הנוכחי מפרט את הליך ה-BAT שבו משתמשים המחברים מדי יום. עם זאת, זו אינה שיטה סטנדרטית וקיימים הבדלים עם נהלים שפורסמו על ידי מחברים אחרים. השינויים העיקריים בפרוטוקול קשורים לשימוש ב- IL-3 במאגר הגירוי, זמן הדגירה עם הגירוי, שיטה לעצירת דה-גרנולציה של בזופילים ואסטרטגיות ציטומטריה של זרימה. יתר על כן, ערכות שונות הזמינות מסחרית עבור BAT כוללות פרוטוקולים ספציפיים המומלצים על ידי היצרן.
1. הכנת מדגם
<ol><li>לאסוף דם היקפי בצינורות הפרינים של 9 מ"ל ולשמור על הדגימה בטמפרטורת החדר (RT) ברוטור עד שהיא נדרשת לפרוטוקול הניסוי.</li>
	<li>תווית 5 מ"ל צינורות ציטומטר לבקרות שליליות (2 צינורות), בקרות חיוביות (2 צינורות) וריכוזים שונים של אלרגן/תרופה (שפופרת אחת לכל ריכוז אלרגן/תרופה שנבדק). הניחו את הצינורות במדף שבו הצינורות מתאימים בצורה מושלמת מבלי להחליק.</li>
	<li>יש להכין חיץ גירוי במים מזוקקים כפולים המכילים 2% (v/v) HEPES, 78 מ"ג/ל' NaCl, 3.7 מ"ג/ל' KCl, 7.8 מ"ג/ל' CaCl 2, 3.3 מ"ג/ל' MgCl2, 1 גרם/ל' HSA. התאם את ה-pH ל-7.4 והוסף IL-3 ב-2 ננוגרם/מ"ל. בדרך כלל מכינים 100 מ"ל ומחלקים ב 2.5 מ"ל aliquots להיות קפוא ב -20 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הכן בקרות חיוביות ב- PBS-Tween-20 0.05% (v/v) (PBS-T): בקרה חיובית 1, N-פורמיל-מתיוניל לאוציל-פנילאלנין (fMLP) (4 μM), כדי לאשר את איכות הבזופילים; בקרה חיובית 2, אנטי-IgE (0.05 מ"ג/מ"ל) כבקרה חיובית בתיווך IgE.</li>
	<li>יש להכין את האלרגן/תרופה ב-PBS-T בריכוז הסופי הרצוי פי 2. הערה: ריכוזי אלרגן/תרופה אופטימליים לשימוש חייבים להיקבע מראש על ידי שימוש במגוון רחב של ריכוזים, על ידי עקומות מינון-תגובה, ועל ידי מחקרי ציטוטוקסיות בעקבות אותם שלבי פרוטוקול139.</li>
</ol>2. הכנת תערובת צביעה
<ol><li>הוסיפו נוגדנים חד שבטיים המסומנים בפלואורוכרום למאגר הגירוי בעקבות ריכוז הנוגדנים המומלץ על ידי היצרן או על ידי טיטרציה קודמת של נוגדנים. בפרוטוקול זה אנו מוסיפים 1 μL מכל נוגדן (CCR3-APC ו- CD203c-PE לזיהוי בזופיל; CD63-FITC להפעלת בזופיל)140 לכל 20 μL של מאגר גירוי. הערה: יש להגן על תערובת הכתמים מפני האור.</li>
	<li>הוסיפו 23 מיקרון ליטר של תערובת כתמים לכל צינור.</li>
</ol>3. גירוי דם
<ol><li>הוסף 100 μL של PBS-T לצינורות 1 ו-2 (בקרה שלילית), 100 μL של fMLP לצינור 3, 100 μL של אנטי-IgE לצינור 4, ו-100 μL של ריכוזי האלרגן/תרופות השונים לצינורות הבאים. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט תרמוסטטי עם תסיסה בינונית לריאגנטים מוכנים מראש.</li>
	<li>הוסיפו בעדינות 100 μL של דם לכל צינור כדי למנוע המוליזה. מערבלים בעדינות צינורות ודוגרים במשך 25 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט תרמוסטטי עם תסיסה בינונית.</li>
	<li>עצור את degranulation, שמירה על צינורות ב 4 מעלות צלזיוס לפחות 5 דקות. הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 30-45 דקות במידת הצורך141,142,143.</li>
</ol>4. אריתרוציטים שוכבים
<ol><li>הוסף 2 מ"ל של 1x חיץ lysing לכל צינור כדי lyse אריתרוציטים. מערבלים כל צינור ודוגרים במשך 5 דקות ב- RT. הערה: בשלב זה, התאים קבועים עקב חומרים מקבעים (פורמלדהיד) הכלולים במאגר.</li>
	<li>צנטריפוגה ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. דקר את הסופר-נטנט, והפך את המדף לכיור. התאים נשארים בתחתית הצינורות.</li>
	<li>יש להוסיף 3 מ"ל של PBS-T לכל צינור כדי לשטוף תאים. מערבולת כל צינור.</li>
	<li>צנטריפוגה ב-300 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. דקר את הסופר-נטנט, והפך את המדף לכיור. הערה: יש לשמור את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, מוגנות מפני האור עד לרכישת ציטומטר זרימה.</li>
</ol>5. רכישת ציטומטריה של זרימה
<ol><li>קבל דוגמאות על ידי ציטומטר זרימה (לדוגמה, ציטומטר זרימה BD FACSCalibur). חבר את ציטומטר הזרימה לתוכנת המחשב והמתן עד שהציטומטר יהיה מוכן. טען את הגדרות התבנית והמכשיר (טבלה 1).</li>
	<li>התחל רכישה לדוגמה.</li>
	<li>השתמש באסטרטגיות הציטומטר הבאות לבחירת בזופילים פעילים139.<ol><li>שער את הלימפוציטים מן הצד פיזור (SSC) - פיזור קדימה (FSC) העלילה.</li>
		<li>שער את הבזופילים מאוכלוסיית הלימפוציטים כתאי CCR3+CD203c+ . לרכוש לפחות 500 בזופילים לכל צינור.</li>
		<li>הצג תרשים CCR3 - CD63 כדי לנתח הפעלה באמצעות CD63 כסמן הפעלה. הגדר את הסף השלילי של CD63 לכ-2.5% באמצעות צינורות הבקרה השלילית.</li>
		<li>רכוש את כל הדוגמאות.</li>
	</ol></li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

BAT הוא מבחן אבחון משלים במבחנה להערכת תגובות אלרגיות בתיווך IgE שהוכח כיעיל באבחון תגובות המושרות על ידי טריגרים שונים כגון תרופות, מזון או ממסים נדיפים, כמו גם בצורות מסוימות של אורטיקריה כרונית. באופן כללי, יש לשקול ביצועי BAT אם i) האלרגן/התרופה מייצרים תוצאות חיוביות שגויות ב-ST; ii) האלרגן/התרופה אינם זמינים לשימוש לכימות ST או sIgE; 3) קיימת מחלוקת בין ההיסטוריה הקלינית לבין קביעת ST או sIgE; 4) הסימפטומים מצביעים על כך ש-ST עשוי לגרום לתגובה מערכתית; v) לפני CCT עבור אלרגן אשם / אישור תרופה<sup class="xr...

אבחון אלרגיה בתיווך IgE מבוסס על היסטוריה קלינית, בדיקות עור (STs), כימות של IgE ספציפי לסרום (sIgE), ואם הוא נדרש ומצוין, בדיקות אתגר מבוקרות (CCTs)1,2,3,4,5,6. עם זאת, ההיסטוריה הקלינית יכולה להיות לא אמינה מכיוון שייתכן שיש מחסור במידע מדויק, ו- STs ו- CCTs אינם הליכים נטולי סיכון שיכולים להיות התווית בנבדקים החווים תגובות מסכנות חיים חמורות 1,2,3,4,5,6 . סוגיות אלה, יחד עם העובדה שקביעת sIgE על ידי אימונו-אנזים פלואורו-אנזים מאומת ומסחרי זמינה רק עבור אלרגנים ותרופות מעטים, הדגישו את התפקיד החשוב של מבחנים פונקציונליים אחרים במבחנה כגון בדיקת הפעלה בזופילית (BAT).
בזופילים הם תאי מפתח המעורבים בתגובות אלרגיות בתיווך IgE המופעלות על קישור צולב של sIgE סמוך הקשור לקולטני זיקה גבוהה (FcεRI) על פני התא לאחר חשיפה לאלרגן/תרופה. הפעלת בזופיל גורמת לפירוק תאים ולשחרור של מתווכי דלקת מסונתזים מראש וחדשים הכלולים בגרגירי הפרשה תוך-ציטופלסמטיים 7,8,9. BAT היא שיטת in vitro המנסה לחקות את הפעלת הבזופיל בנוכחות גירוי (אלרגן או תרופה) וקובעת שינויים בביטוי של סמני הפעלה בזופיליים על ידי ציטומטריה של זרימה 7,10. ישנן אסטרטגיות שונות לזיהוי בזופילים (IgE+, CCR3+, CRTH2+, CD203c+) ולמדידת הפעלת תאים (בעיקר ויסות של CD63 ו-CD203c) באמצעות שילובים של נוגדנים בעלי תווית פלואורוכרום 7,10. CD63, סמן ההפעלה המאומת ביותר קלינית 11,12,13,14, הוא חלבון ממברנה המעוגן בגרגירי ההפרשה המכילים היסטמין, שלאחר הפעלת התא ואיחוי הגרגירים עם הממברנה, מתבטא על משטח בזופיל 15,16,17,18,19,20,21 . CD203c הוא סמן פני השטח המתבטא באופן מכונן על בזופילים ומווסת לאחר גירוי FcεRI, אשר הראה גם תוצאות אמינות ב- BAT 15,22,23,24,25. חוץ מזה, נראה שהוא מבטא במשותף עם CD6326.
בעשורים האחרונים, BAT הוכיח להיות שימושי באבחון של תגובות אלרגיות בתיווך IgE המושרה על ידי גורמים שונים כמו סמים, מזון, או ממסים נדיפים, כמו גם בצורות מסוימות של אורטיקריה כרונית, כפי שמתואר להלן. עם זאת, המיקום של טכניקה זו באלגוריתמים אבחון הוא משתנה מאוד ולא נקבע היטב.
רגישות יתר לסמים BAT הוכחה כיעילה כבדיקה משלימה עבור תרופות וחולים נבחרים, במיוחד עבור אלה שחווים תגובות חמורות בשל העובדה כי הערך האבחנתי של ST אינו מבוסס היטב עבור רוב התרופות, שכן הם מאומתים ומתוקננים עבור מספר מוגבל של תרופות27,28,29,30. בנוסף, כימות של sIgE זמין רק עבור מספר מוגבל של תרופות, עם רגישות נמוכה יותר מאשר ST 27,28,29,30,31,32. לכן, האבחנה של רגישות יתר לסמים מסתמכת בדרך כלל על בדיקת פרובוקציה של סמים, אשר יכולה להיות התווית אצל נבדקים החווים תגובות מסכנות חיים חמורות33.
תוצאות מבטיחות דווחו לשימוש ב- BAT בחולים נבחרים המדווחים על תגובות רגישות יתר מיידיות לתרופות שונות כמו בטאלקטמים (BLs)20,34,35,36,37,38,39, חומרים חוסמים עצביים-שריריים (NMBAs)19,22,40,41,42, 43,44,45, פלואורוקווינולונים (FQs)46,47,48,49, פיראזולונים50,51,52, מדיה רדיוקונטרנטית (RCM)53,54,55,56 ותרכובות פלטינה57,58,59 . דווח כי ל-BAT יש רגישות וספציפיות בין 51.7-66.9% ל-89.2-97.8%, בהתאמה; וערכי ניבוי חיוביים ושליליים מתוארים בטווח שבין 93.4% ל-66.3%,בהתאמה 27,31. יתר על כן, BAT הוצע כסמן ביולוגי מנבא לתגובות פורצות דרך במהלך דה-סנסיטיזציה עם תרכובות פלטינה, שכן ביטוי CD203c מוגבר בהשוואה ל- CD63 בחולים עם סיכון גבוה לתגובות שליליות במהלך רגישות לתרופות57.
יש לציין כי BAT שימושי רק רגישות יתר לסמים כאשר התגובה כרוכה degranulation basophil; לכן, הוא אינו שימושי בתגובות הנובעות מעיכוב אנזימטי של ציקלואוקסיגנאז 142.
אלרגיה למזון BAT התגלה ככלי אבחון פוטנציאלי לאלרגיה למזון מכיוון שקביעת sIgE בסרום לכל תמצית האלרגנים או לאלרגנים בודדים היא לעתים קרובות מעורפלת, ודורשת אתגר מזון אוראלי כדי לאשר את האבחנה, אשר, בדומה לרגישות יתר לתרופות, היא הליך יקר ולא נטול סיכון60. מספר מחקרים הראו תוצאות רלוונטיות עם חלב פרה 61,62, ביצה61,63, חיטה 64,65,66,67,68, בוטנים 63,69,70,71,72, אגוזי לוז 73,74,75,76 ,77, רכיכות78, אפרסק 79,80,81, תפוח21, סלרי וגזר 82,83.
הערך המוסף העיקרי של BAT באבחון אלרגיה למזון בהשוואה ל- STs ו- sIgE בסרום הוא שהוא מראה ספציפיות גבוהה יותר ורגישות דומה. לפיכך, BAT הוא כלי שימושי כדי להבדיל בין מטופלים אלרגיים קלינית לבין נבדקים רגישים, אך סובלניים, שיש להם גם ספציפיות גבוהה (75-100%) וגם רגישות (77-98%)63,69,84. ערכי הרגישות והספציפיות תלויים באלרגן ובגורמים אחרים כפנוטיפים (למשל, תסמונת אלרגיה אוראלית לעומת אנפילקסיס), גיל ודפוסי רגישות הקשורים לגיאוגרפיה63,85.
BAT באמצעות רכיבי אלרגן בודדים יכול לשפר את דיוק האבחון עבור אלרגנים מסוימים במזון 61,80. ישנם מחקרים המשתמשים בחלבוני אחסון זרעים (למשל, Ara h 1, Ara h 2, Ara h 3 ו-Ara h 6 מבוטנים)86; חלבוני העברת שומנים (למשל, Pru p 3 מאפרסק ו- Ara h 9 מבוטנים)80,86; ו-Bet v 1 הומולוגים (למשל, Ara h 8 מתוך בוטנים)87. שירותים פוטנציאליים אחרים קשורים לזיהוי האלרגן האשם במקרים של תסמונת אלרגיה למזון 21,87,88, אלרגיה לבשר אדום 89, או אנפילקסיס הנגרם על ידי פעילות גופנית תלוית מזון66.
מעניין, BAT יכול לספק מידע על חומרת וסף של תגובות אלרגיות מאז חולים עם תגובות חמורות יותר להראות שיעור גדול יותר של בזופילים מופעלים, כפי שנצפה במחקרים של בוטנים וחלב פרה אלרגיים חולים 84,90,91; וחולים המגיבים לכמויות זעירות של האלרגן מראים רגישות בזופילית גדולה יותר 84,90,92. נתונים אלה מצביעים על כך ש- BAT עשוי להיות שימושי לזיהוי חולים אלרגיים בסיכון גבוה הזקוקים למעקב צמוד יותר ולחינוך מוגבריותר 93. יתר על כן, דווח כי BAT יכול לחזות תגובות לאתגר מזון 70,91,92,94 וסף של תגובתיות90,95 כדי לעזור לקבוע מתי ניתן להכניס מזון בבטחה (מחדש) 84. עם זאת, ממצאים אלה שנויים במחלוקת בחלק מהמחקרים63,96 ונדרשים מחקרים נוספים.
מאידך גיסא, BAT שימש לניטור רזולוציה של אלרגיה למזון, באופן טבעי או תחת טיפולים אימונומודולטוריים, לאורך זמן, אשר עד כה הוערך רק על ידי אתגר מזון אוראלי, עם הסיכונים הקשורים ועלויות 84,97,98,99,100,101,102,103,104,105,106 ,107,108. יתר על כן, הוא שימש גם כדי לפקח על ההשפעה של omalizumab באלרגיה למזון כמו ההפעלה basophil פוחתת במהלך הטיפול עם omalizumab, אבל זה עולה לאחר הפסקת הטיפול109.
אלרגיה ממסים נדיפים BAT מועיל רק לעתים רחוקות באלרגיה ממסים נדיפים, שכן ניתן לקבוע אבחנה באופן שגרתי על ידי כימות sIgE ו-ST. עם זאת, במקרים של נזלת אלרגית מקומית (רמות בלתי ניתנות לגילוי של sIgE ו- STs שליליים עם בדיקות פרובוקציה חיוביות באף), BAT אפשרה אבחון ב -50% מהמקרים110. עוד דווח על קשר בין רגישות לבזופיל ותגובה לבדיקות פרובוקציה באף/בסימפונות, וכן בין חומרת אסתמה ליעילות הטיפול באומליזומאב111,112.
BAT שימש גם לניטור אימונותרפיה של אלרגנים עבור קרדית אבק הבית ואבקנים, שכן הרגישות לבזופילים פוחתת במהלך אימונותרפיה, ככל הנראה עקב הפרעה של חסימת נוגדני IgG 113,114,115,116,117.
אלרגיה לארס קרום הבתולים אבחנה של אלרגיה לארס קרום הבתולים מבוססת באופן שגרתי על ST וסרום sIgE. BAT הראה רגישות גבוהה (85-100%) וספציפיות גבוהה (83-100%) ודווח כי הוא שימושי במקרים המניבים תוצאות חד משמעיות או בחולים עם היסטוריה קלינית מרומזת של אלרגיה לארס אך sIgE בלתי ניתן לגילוי ו- ST118,119 שלילי. עם זאת, נראה כי BAT אינו מנבא את חומרת התגובות הללו120,121.
עד 60% מהחולים מפגינים sIgE הן לארס הצרעות והן לארס הדבורים, וזיהוי האלרגן הדומיננטי חיוני לטיפול אימונותרפי הולם. במקרים אלה, דווח כי BAT שימושי בזיהוי האלרגן הדומיננטי 119,122,123,124. למרות ש- sIgE לאלרגנים העיקריים של ארס דבורים וצרעות עשוי להפחית את התועלת של BAT בחולים עם חיוביות כפולה לשני הארסים, הוא מספק מידע שימושי בעיקר בנושאים עם תוצאות שליליות בקביעות sIgE123.
מחקרים מסוימים מצביעים על כך ש-BAT עשוי להיות שימושי כסמן ביולוגי מנבא לתופעות לוואי במהלך שלב ההצטברות של אימונותרפיה של ארס, שכן דווח כי אפשרות טיפול זו מפחיתה את הרגישות לבזופיל. עם זאת, תגובתיות אינה פוחתת וזה BAT השירות שנוי במחלוקת כיום 13,120,125,126,127,128,129,130.
אורטיקריה ואנגיואדמה לתת-קבוצה של חולי אורטיקריה כרונית יש פתופיזיולוגיה אוטואינמונית, עקב נוגדנים עצמיים של IgE לאוטואלרגנים ונוגדנים עצמיים של IgG המכוונים לקומפלקסים FcεRI או IgE-FcεRI הנמצאים על פני התא הפיטום131,132. בתרגול הקליני, אבחון של סוג זה של אורטיקריה כרונית הסתמך על סרום אוטולוגי חיובי ST, אשר יש סיכון של זיהום בשוגג. BAT הוצע כבדיקת מבחנה לאבחון ומעקב אחר חולים עם חשד לאורטיקריה כרונית. הן CD63 והן CD203c ביטוי על פני השטח של בזופילים דווח כי הוא מוגבר בעקבות גירוי עם sera מחולי אורטיקריה כרונית, מראה זיהוי של נוגדנים עצמיים פעילים 133,134,135,136,137. לאחרונה דווח כי חולים עם BAT חיובי חווים לעתים קרובות את מצב המחלה הפעיל ביותר, המוערך על ידי ציון פעילות אורטיקריה, וזקוקים למינונים גבוהים יותר של אנטיהיסטמינים יחד עם טיפולי קו שלישי (ציקלוספורין A או omalizumab), בהשוואה לאלה עם BAT138 שלילי.

<table><tbody><tr><td>מבחנה פוליסטירן תחתון עגול 5 מ"ל, ללא מכסה,</td><td>קורנינג</td> לא סטרילי <td>352008</td><td></td></tr><tr><td>APC אנטי אנושי CD193 (CCR3) נוגדן</td><td>BioLegend</td><td>310708</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSציטומטר זרימת קליבור</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>FITC אנטי אנושי CD63 נוגדן</td><td>BioLegend</td><td>353006</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 מ')</td>תמיסת ליזינג <td>15630106</td><td></td> <td>תרמו-פישר</td></tr><tr><td>10x מרוכז</td><td>BD Biosciences</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>N-פורמיל-מט-לאו-פה</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>F3506</td><td></td></tr><tr><td>PE אנטי-אנושי CD203c (E-NPP3) נוגדן</td><td>BioLegend</td><td>324606</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>עכבר מטוהר אנטי-אנושי IgE</td><td>BD Biosciences</td><td>555857</td><td></td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי IL-3</td><td>R& D Systems</td><td>203-IL</td><td></td></tr><tr><td>נוזל נדן</td><td>BD Biosciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>TUBE 9 מ"ל LH ליתיום הפרין</td><td>גריינר ביו-וואן</td><td>455084</td><td></td></tr><tr><td>20</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P1379</td><td></td></tr></tbody></table>

בדיקת הפעלת בזופיל לאבחון אלרגיה

Basophil Activation Test for Allergy Diagnosis

בדיקת ההפעלה הבזופילית (BAT) היא בדיקת אבחון משלימה במבחנה שניתן להשתמש בה בנוסף להיסטוריה קלינית, בדיקת עור (ST) וקביעת IgE (sIgE) ספציפית בהערכת תגובות אלרגיות בתיווך IgE למזון, ארס חרקים, תרופות, כמו גם צורות מסוימות של אורטיקריה כרונית. עם זאת, תפקידה של טכניקה זו באלגוריתמי האבחון משתנה מאוד ולא נקבע היטב.
BAT מבוסס על קביעת התגובה הבזופילית להפעלת IgE צולבת של אלרגן/תרופה באמצעות מדידת סמני הפעלה (כגון CD63, CD203c) על ידי ציטומטריה של זרימה. בדיקה זו יכולה להיות כלי שימושי ומשלים כדי למנוע בדיקות אתגר מבוקרות כדי לאשר אבחון אלרגיה, במיוחד בנבדקים החווים תגובות מסכנות חיים חמורות. באופן כללי, יש לשקול את הביצועים של BAT אם i) האלרגן/התרופה מייצר תוצאות חיוביות שגויות ב-ST; ii) אין מקור אלרגן/תרופה לשימוש לצורך קביעת ST או sIgE; 3) קיימת מחלוקת בין היסטוריית המטופלים לבין קביעת ST או sIgE; 4) הסימפטומים מצביעים על כך ש-ST עלול לגרום לתגובה מערכתית; v) לפני ששוקלים CCT כדי לאשר את האלרגן/התרופה האשם. המגבלות העיקריות של הבדיקה קשורות לרגישות לא אופטימלית, במיוחד באלרגיה לתרופות, הצורך לבצע את הבדיקה לא יותר מ-24 שעות לאחר מיצוי הדגימה, והיעדר סטנדרטיזציה בין המעבדות מבחינת נהלים, ריכוזים וסמנים תאיים.

BAT המבוצע עם אלרגנים או תרופות מאפשר חקירה של תגובות רגישות יתר תלויות IgE. תגובתיות בזופילית צריכה להימדד בשני ריכוזים אופטימליים לפחות על מנת להשיג את התוצאות הטובות ביותר34 וההפעלה מומחשת על ידי ויסות של CD63 על פני התא. במקרה של אלרגנים, יתר על כן, כדי לאשר את תגובתיות הבזופיל, יש לנתח את הרגישות הבזופילית על ידי מדידת התגובה בריכוזי אלרגנים יורדים מרובים114. מדד זה מאפשר לקבוע את ריכוז האלרגנים המשרה את התגובה של 50% בזופילים (EC50), אשר ניתן לבטא כמו "CD-sens"<sup cl...

מבחן ההפעלה הבזופילי הוא מבחן אבחון משלים במבחנה להערכת תגובות אלרגיות בתיווך IgE המבוסס על זיהוי הפעלת בזופיל בנוכחות גירוי מסוים באמצעות מדידת סמני הפעלה על ידי ציטומטריה של זרימה.

The basophil activation test (BAT) is a complementary in vitro diagnostic test that can be used in addition to clinical history, skin test (ST), and ...

בדיקת ההפעלה הבזופילית היא בדיקת אבחון חוץ-גופית משלימה להערכת תגובות אלרגיות בתיווך IgE שהוכחו כמועילות לתגובות המושרות על ידי תרופות, מזון או ממסים נדיפים, כמו גם בצורות מסוימות של אורטיקריה כרונית. בדיקה זו מבוססת על קביעת תגובה בזופילית לאלרגן או להפעלת IgE צולבת של תרופה באמצעות מדידת סמני הפעלה על ידי ציטומטריה של זרימה. בדיקת ההפעלה הבזופילית יכולה להיות כלי שימושי ומחמיא כדי להימנע מבדיקות אתגר מבוקרות כדי לאשר אבחנה של אלרגיה, במיוחד בנבדקים שחווים תגובות מסכנות חיים חמורות.יתר על כן, בדיקה זו יש את היתרון של היכולת לנתח את התגובה נגד כל תרופה או אלרגן לעומת שיטות אחרות in vitro כי הם זמינים רק עבור כמה תרופות ואלרגנים. המגבלות העיקריות של הבדיקה קשורות לרגישות לא אופטימלית, במיוחד באלרגיה לסמים. הצורך לבצע את הבדיקה לא יותר מ 24 שעות לאחר מיצוי הדגימה וחוסר סטנדרטיזציה בין מעבדות ואלגוריתמים אבחון.התחל על ידי איסוף דם היקפי בצינורות הפרינים של תשעה מיליליטר, והנח את הדגימות ברוטור כדי לשמור עליהן בטמפרטורת החדר עד שהן נדרשות לפרוטוקול הניסוי. תייג שני צינורות ציטומטר חמישה מיליליטר כל אחד לשליטה שלילית ושליטה חיובית. כמו כן, יש לסמן שפופרת אחת כל אחת עבור ריכוזי האלרגנים או התרופות השונים הנבדקים.לאחר מכן מניחים את הצינורות במדף כך שהצינורות יתאימו בצורה מושלמת מבלי להחליק. לקבלת הבקרה החיובית הראשונה, הכינו תמיסת ארבעה מיקרומולרים של N-פורמיל-מתיוניל לאוציל-פנילאלנין או fMLP ב-0.05% PBS-T כדי לאשר את איכות הבזופילים. לקבלת הבקרה החיובית השנייה, הכן תמיסת אנטי-IgE של 0.05 מיליגרם למיליליטר באמצעות PBS-T.הכינו את תערובת הצביעה על ידי הוספת מיקרוליטר אחד לכל אחד מנוגדני CCR3-APC, CD203c-PE ו-CD63-FITC לכל 20 מיקרוליטרים של מאגר הגירוי. לאחר מכן הוסף 23 מיקרוליטר של תערובת מכתים זו לכל צינור. הוסף 100 מיקרוליטרים של PBS-T לצינורות הבקרה השלילית.הוסף 100 מיקרוליטרים של fMLP לאחד מצינורות הבקרה החיוביים והוסף 100 מיקרוליטרים של אנטי-IgE E לשני לשאר הצינורות. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של ריכוזי האלרגנים או התרופות השונים ודוגרים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר הדגירה, להוסיף 100 microliters של דם לכל צינור בעדינות כדי למנוע המוליזה.ואז בעדינות מערבל את הצינורות לדגור אותם במשך 25 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט תרמוסטטי עם תסיסה בינונית. שמור את הצינורות על ארבע מעלות צלזיוס לפחות חמש דקות כדי לעצור את degranulation. לכל צינור, להוסיף שני מיליליטר של חיץ lysing כדי lyse את אריתרוציטים.מערבלים כל צינור ולאחר מכן דגירה של הצינורות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה את הצינורות ב 300 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן הפכו את המדף לתוך הכיור כדי לרוקן את הסופר-נטנט בזמן שהתאים נשארים בתחתית הצינורות.הוסף שלושה מיליליטר של PBS-T לכל צינור כדי לשטוף את התאים ולמערבל את הצינורות. בצע סיבוב שני של צנטריפוגה באמצעות אותה קבוצה של פרמטרים, ונטרל את הסופרנטנט על ידי הפיכת המדף לכיור. לאחר מכן שמור את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס מוגנות מפני אור עד ציטומטריית זרימה.חבר את ציטומטר הזרימה לתוכנת המחשב והמתן עד שהציטומטר יהיה מוכן. טען את הגדרות התבנית והמכשיר כמתואר בכתב היד של הטקסט. התחל את תהליך רכישת המדגם.כדי לבחור בזופילים פעילים, ראשית, שער את הלימפוציטים מן העלילה פיזור צד קדימה. לאחר מכן שער את הבזופילים מאוכלוסיית הלימפוציטים כתאי CCR3+CD203c+ורכוש לפחות 500 בזופילים לכל צינור. הגדר את סף CD63 לכ-2.5% באמצעות צינורות הבקרה השלילית ונתח את הדגימות.תגובות רגישות יתר תלויות IgE נחקרו על ידי ביצוע בדיקת הפעלה בזופילית, או BAT, באמצעות אלרגנים ותרופות. רגישות בזופיל נותחה על ידי מדידת התגובה בריכוזי אלרגנים יורדים מרובים המסייעים לקבוע את הריכוז האלרגי שגורם לתגובה של 50% בזופילים או EC50. ראשית, לימפוציטים היו מגודרים מן הצד פיזור קדימה העלילה לפזור.לאחר מכן בזופילים היו מגודרים מאוכלוסיית הלימפוציטים כתאי CCR3+CD203c+. לאחר מכן נעשה שימוש בעלילת CCR3-CD63 לניתוח הפעלת בזופיל באמצעות CD63 כסמן הפעלה לשתי תרופות וריכוזים שונים של אלרגן. הבדיקה מבוצעת עם דם שלם טרי ויש לבצע אותה לא יותר מ 24 שעות לאחר מיצוי הדם.הגירוי המשמש בבדיקה לא צריך לכלול כל excipients ואת המאפיינים הכימיים של התרופות צריך להיחשב. שיטות נוספות אחרות במבחנה לאבחון תגובות אלרגיות בתיווך IgE, או קביעת sIgE, או בדיקת שחרור היסטמין.

basophil-activation-test-for-allergy-diagnosis

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

מבחן Basophil ההפעלה הוא כלי רב עוצמה לצורך זיהוי של IgE תלויי...

Basophil מבחן הפעלה לחקירות IgE בתיווך מנגנונים של תרופות רגישות יתר

מודלים העכבר ניסיוני של אסטמה אלרגית להציע אפשרויות חדשות ללימוד בהיווצרות המחלה ופיתוח ותרופות חדשות. דגמים אלה מתאימים גם לגורמים השולטים מדידה תגובה חיסונית אלרגית, דלקת בדרכי הנשימה, ו פתופיזיולוגיה ריאתי.

דגם Murine של אסטמה אלרגן מושרה

בסרטון זה אנו מתארים שיטה חוץ גופית להערכת הפוטנציאל האלרגי של אנטיגן לגרימת גרגירת בזופילים. β-הקסוזמינידז משמש כאינדקס לשחרור מתווך כימי, ופעילות האנזים של β-הקסוזמינידז נמדדת באמצעות מצע פלואורוגני.

Humanized Mediator Enzyme Release Assay: שיטה אימונוכימית לסינון פוטנציאל אלרגי של אנטיגן בדיקה על ידי ניטור תגובת בזופיל degranulation במבחנה

בסרטון זה, אנו מדגימים את הבדיקה להערכת הפעלת בזופילים בנוכחות אלרגן בדיקה באמצעות ציטומטריית זרימה.

ניתוח הפעלת בזופילים בנוכחות אלרגן בדיקה באמצעות ציטומטריית זרימה

סרטון זה מדגים פרוטוקול לזיהוי אימונוגלובולין E ספציפי לסרום באמצעות מערכת כימילומינסנציה מבוססת מחסניות מיקרופלואידיות. סרום IgEs אינטראקציה עם אלרגנים שונים משותקים באזור התגובה של המחסנית, אשר מזוהים לאחר מכן עם נוגדנים מצומדים peroxidase anti-IgE ומצע chemiluminescent, המאפשר זיהוי בו זמנית של IgEs ספציפיים לאלרגנים מרובים.

מערכת זיהוי מבוססת מחסניות מיקרופלואידיות עבור אימונוגלובולין E ספציפי לאלרגן

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכמת חלקיקים טעונים האלרגן על ידי cytometry הזרימה. חלקיקי חומר חלקיקי הסביבה עלולים לשמש נשאים של אלרגנים adsorbed. ונביא כאן כי cytometry זרימה, שיטה בשימוש נרחב כדי לאפיין מוצקים מרחפים&gt; 0.5 מיקרומטר קוטר, ניתן להשתמש כדי למדוד חלקיקים אלרגנים טעונות אלו.

ניתוח תזרים Cytometric נ בית נכנס חלקיקים 1 האלרגנים PM10

עבודה זו מתארת ​​פרוטוקול המשתמש בגישה המוטמעת ברכיבים לחישוב רגישות לאלרגנים של אבקת דשא, בקרב קבוצה של מטופלים מדרום סין עם נזלת אלרגית ו / או אסטמה.

גישה מאבחנת של רכיבים לחקר על אלרגנים של אבקת דשא בדרומים סיניים עם נזלת אלרגית ו / או אסטמה

מאמר זה מציג פרוטוקול לגילוי סרום ספציפי אימונוגלובולין E עם מערכת chemiluminescence המבוסס על מחסנית microfluidic והערכת תועלתו באיבחונים אלרגיה.

יישום של טכנולוגיה Microfluidic ביו-שבב על סרום לזהות אלרגן ספציפיים אימונוגלובולין E (sIgE)

כאן אנו מציגים את מבחנת שחרור המתווך, באמצעות קו תאי לוקמיה בוסופילי חולדה transfected עם קולטן IgE האנושי, כדי לדמות degranulation של תאים אפקטים שנצפו בדרך כלל בתגובות אלרגיות מסוג 1. שיטה זו חוקרת את הפעילות הביולוגית של אלרגנים באופן רגיש מאוד, ניתן לשחזור וניתן להתאמה אישית.

מגשר אנושי לשחרר את אסאי כהקראה עבור עוצמה אלרגן

מוצג פרוטוקול לביצוע אתגר במתקן תא חשיפה לאלרגנים (AEC). AECs הוכיחו את עצמם ככלים בטוחים ויעילים להשראת תסמינים אלרגיים או כנקודת קצה בבדיקת היעילות של אימונותרפיה לאלרגנים בשל יכולתם לשמור על ריכוזי חלקיקים יציבים ותנאי הסביבה.

הערכת תסמינים של חולים עם נזלת אלרגית באמצעות תא חשיפה לאלרגנים

למדו בדיקת הפעלת בזופיל לאבחון אלרגיות IgE-ממומנות באמצעות ציטומטריית זרימה. שיטה זו מסייעת לחוקרים לאבחן תגובות לתרופות, מזון וחומרים נשימתיים תוך הימנעות מבדיקות אתגר מבוקרות.

בדיקת הפעלת בזופיל לאבחון אלרגיה

גלה סרטונים נוספים