בדיקת הפעלת בזופיל לאבחון אלרגיה

בדיקת ההפעלה הבזופילית היא בדיקת אבחון חוץ-גופית משלימה להערכת תגובות אלרגיות בתיווך IgE שהוכחו כמועילות לתגובות המושרות על ידי תרופות, מזון או ממסים נדיפים, כמו גם בצורות מסוימות של אורטיקריה כרונית. בדיקה זו מבוססת על קביעת תגובה בזופילית לאלרגן או להפעלת IgE צולבת של תרופה באמצעות מדידת סמני הפעלה על ידי ציטומטריה של זרימה. בדיקת ההפעלה הבזופילית יכולה להיות כלי שימושי ומחמיא כדי להימנע מבדיקות אתגר מבוקרות כדי לאשר אבחנה של אלרגיה, במיוחד בנבדקים שחווים תגובות מסכנות חיים חמורות.

יתר על כן, בדיקה זו יש את היתרון של היכולת לנתח את התגובה נגד כל תרופה או אלרגן לעומת שיטות אחרות in vitro כי הם זמינים רק עבור כמה תרופות ואלרגנים. המגבלות העיקריות של הבדיקה קשורות לרגישות לא אופטימלית, במיוחד באלרגיה לסמים. הצורך לבצע את הבדיקה לא יותר מ 24 שעות לאחר מיצוי הדגימה וחוסר סטנדרטיזציה בין מעבדות ואלגוריתמים אבחון.

התחל על ידי איסוף דם היקפי בצינורות הפרינים של תשעה מיליליטר, והנח את הדגימות ברוטור כדי לשמור עליהן בטמפרטורת החדר עד שהן נדרשות לפרוטוקול הניסוי. תייג שני צינורות ציטומטר חמישה מיליליטר כל אחד לשליטה שלילית ושליטה חיובית. כמו כן, יש לסמן שפופרת אחת כל אחת עבור ריכוזי האלרגנים או התרופות השונים הנבדקים.

לאחר מכן מניחים את הצינורות במדף כך שהצינורות יתאימו בצורה מושלמת מבלי להחליק. לקבלת הבקרה החיובית הראשונה, הכינו תמיסת ארבעה מיקרומולרים של N-פורמיל-מתיוניל לאוציל-פנילאלנין או fMLP ב-0.05% PBS-T כדי לאשר את איכות הבזופילים. לקבלת הבקרה החיובית השנייה, הכן תמיסת אנטי-IgE של 0.05 מיליגרם למיליליטר באמצעות PBS-T.

הכינו את תערובת הצביעה על ידי הוספת מיקרוליטר אחד לכל אחד מנוגדני CCR3-APC, CD203c-PE ו-CD63-FITC לכל 20 מיקרוליטרים של מאגר הגירוי. לאחר מכן הוסף 23 מיקרוליטר של תערובת מכתים זו לכל צינור. הוסף 100 מיקרוליטרים של PBS-T לצינורות הבקרה השלילית.

הוסף 100 מיקרוליטרים של fMLP לאחד מצינורות הבקרה החיוביים והוסף 100 מיקרוליטרים של אנטי-IgE E לשני לשאר הצינורות. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של ריכוזי האלרגנים או התרופות השונים ודוגרים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. לאחר הדגירה, להוסיף 100 microliters של דם לכל צינור בעדינות כדי למנוע המוליזה.

ואז בעדינות מערבל את הצינורות לדגור אותם במשך 25 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט תרמוסטטי עם תסיסה בינונית. שמור את הצינורות על ארבע מעלות צלזיוס לפחות חמש דקות כדי לעצור את degranulation. לכל צינור, להוסיף שני מיליליטר של חיץ lysing כדי lyse את אריתרוציטים.

מערבלים כל צינור ולאחר מכן דגירה של הצינורות במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. צנטריפוגה את הצינורות ב 300 גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. לאחר מכן הפכו את המדף לתוך הכיור כדי לרוקן את הסופר-נטנט בזמן שהתאים נשארים בתחתית הצינורות.

הוסף שלושה מיליליטר של PBS-T לכל צינור כדי לשטוף את התאים ולמערבל את הצינורות. בצע סיבוב שני של צנטריפוגה באמצעות אותה קבוצה של פרמטרים, ונטרל את הסופרנטנט על ידי הפיכת המדף לכיור. לאחר מכן שמור את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס מוגנות מפני אור עד ציטומטריית זרימה.

חבר את ציטומטר הזרימה לתוכנת המחשב והמתן עד שהציטומטר יהיה מוכן. טען את הגדרות התבנית והמכשיר כמתואר בכתב היד של הטקסט. התחל את תהליך רכישת המדגם.

כדי לבחור בזופילים פעילים, ראשית, שער את הלימפוציטים מן העלילה פיזור צד קדימה. לאחר מכן שער את הבזופילים מאוכלוסיית הלימפוציטים כתאי CCR3+CD203c+ורכוש לפחות 500 בזופילים לכל צינור. הגדר את סף CD63 לכ-2.5% באמצעות צינורות הבקרה השלילית ונתח את הדגימות.

תגובות רגישות יתר תלויות IgE נחקרו על ידי ביצוע בדיקת הפעלה בזופילית, או BAT, באמצעות אלרגנים ותרופות. רגישות בזופיל נותחה על ידי מדידת התגובה בריכוזי אלרגנים יורדים מרובים המסייעים לקבוע את הריכוז האלרגי שגורם לתגובה של 50% בזופילים או EC50. ראשית, לימפוציטים היו מגודרים מן הצד פיזור קדימה העלילה לפזור.

לאחר מכן בזופילים היו מגודרים מאוכלוסיית הלימפוציטים כתאי CCR3+CD203c+. לאחר מכן נעשה שימוש בעלילת CCR3-CD63 לניתוח הפעלת בזופיל באמצעות CD63 כסמן הפעלה לשתי תרופות וריכוזים שונים של אלרגן. הבדיקה מבוצעת עם דם שלם טרי ויש לבצע אותה לא יותר מ 24 שעות לאחר מיצוי הדם.

הגירוי המשמש בבדיקה לא צריך לכלול כל excipients ואת המאפיינים הכימיים של התרופות צריך להיחשב. שיטות נוספות אחרות במבחנה לאבחון תגובות אלרגיות בתיווך IgE, או קביעת sIgE, או בדיקת שחרור היסטמין.