Name: הדמיה וכימות של TGFβ/BMP/SMAD איתות בתנאי לחץ שונים של גיסת נוזלים באמצעות קרבה-קשירה-אסאי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
Description: למד הדמיה וכימות של מורכבי SMAD בתאי אנדותל תחת תנאי לחץ שונים באמצעות קרבה-קשירה-אסאי. פרוטוקול זה משפר את ההבנה של ביולוגיית כלי הדם והשפעת לחץ הגזירה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר מריה רייכנבך ולט"ר כריסטיאן הייפן על תמיכתם במערכת הזרימה ואלינור פוקס ויוניון שיאו על שקראו את כתב היד בביקורתיות. P-L.M. מומן על ידי בית הספר הבינלאומי מקס פלאנק מחקר IMPRS-ביולוגיה וחישוב (IMPRS-BAC). PK קיבלה מימון על ידי DFG-SFB1444. איור 1 נוצר באמצעות BioRender.

1. תרבית התא וחשיפה ללחץ גזל
הערה: ECs וריד טבור אנושי (HUVECs) שימשו כדוגמה לחקר אינטראקציה המושרה SS של SMADs. ניתן להחיל את הפרוטוקול המתואר להלן על כל סוג תא רספונסיבי של SS.
<ol><li>מעיל שקופית 6 ערוצים עם 0.1% ג'לטין עור חזירי PBS במשך 30 דקות ב 37 °C (7 °F).</li>
	<li>זרע HUVECs בשקופיות 6 ערוצים מצופות מראש בצפיפות של 2.5 x 106 תאים למ"ל ב- 30 μL של M199 בינוני מלא. הערה: לקבלת מידע נוסף אודות אופן הזרימה של תאים בשקופית הזרימה, ראה reference24.</li>
	<li>תן לתאים לדבוק במשך 1 שעות ב 37 °C בחממה לחה.</li>
	<li>הוסף 60 μL של M199 בינוני מלא מחומם מראש לכל אחד מהמאגרים.</li>
	<li>תרבות במשך יומיים, עם חילופי בינוני עדין פעם ביום, ב 37 °C (50 °F) בחממה לחה.<ol>
<li>שאפו את המאגרים לחלוטין, הוסיפו 120 מיקרו-אל של M199 בינוני מלא התחמם מראש באחד המאגרים, ושאפו מהצד השני.</li>
		<li>הוסף 60 μL של M199 בינוני מלא מחומם מראש לשני המאגרים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הרכב והתחל את הגדרת הזרימה כמפורט בהפניה25.<ol>
<li>הר צינורות על יחידות נוזלים. כאן, צינורות סיליקון בקוטר של 0.8 מ"מ ו 1.6 מ"מ משמשים כדי להחיל מתח גיהה של 1 דיין / cm2 ו 30 ין / cm2, בהתאמה. הערה: החומר ואורך הצינורות צריכים להישאר קבועים, שכן שינויים יכולים להשפיע על הלחץ הגומרי הנובע מכך. באופן כללי, שילובים אחרים של מערכות משאבה צינורות ניתן להשתמש, כל עוד הלחץ הגיאה וכתוצאה מכך ידוע, ואת המשאבה יוצרת זרימת למינאר יציבה.</li>
		<li>מלאו את המאגרים בכמות מתאימה של M199 בינוני מלא (מינימום 10 מ"ל).</li>
		<li>חבר יחידות נוזליות עם הצינורות למערכת המשאבה ובצע ריצה מוקדמת ללא תאים כדי שיווי משקל המדיום ולהסיר את כל האוויר הנותר 25.</li>
		<li>חבר באופן סדרתי את הערוצים הבודדים בשקופית בת 6 הערוצים זה לזה באמצעות צינורות חיבור סידוריים. הערוץ הראשון והאחרון בשקופית יתחברו לצינורות שהורכבו ב- 1.6.1 (ראה איור 1A לקבלת ערכה). היזהר לא להכניס כל אוויר לתוך המערכת כמו זה יכול לפגוע קשות בתאים. מידע נוסף על החיבור הסידורי ניתן למצוא בהפניה26.</li>
		<li>לחשיפת תאים לרמות גבוהות של לחץ גזוז (>20 דיס/ס"מ2), יש להשתמש בשלב הרמפה, כלומר להגביר את הלחץ הגזוז בשלבי הסתגלות. ניתן להגדיר את השלבים במרווחים של 5 דקה/cm2 ל-30 דקות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. קיבעון
<ol><li>נתק שקופיות מהמשאבות לאחר חשיפת ה-SS הנוזלי. השתמש מלחציים על הצינורות בעת ניתוק, כדי למנוע לשפוך בינוני באינקובטור.</li>
	<li>העבר מיד שקופיות זרימה על קרח, בעוד הצינורות הנותרים מנותקים ברצף. בעת הסרת הצינורות ממאגרים, המאגר בצד השני צריך להישמר סגור עם אצבע כדי למנוע לכידת בועות אוויר בערוץ. הדבר עלול להפריע לשלבי הקיבעון.</li>
	<li>שמירה על התאים על קרח, לשאוף למדיום בזהירות מן המאגרים אבל לא מן הערוץ שבו התאים שוכנים. לאחר מכן, לשטוף דגימות עם PBS סטרילי קר (4 °C) עם שלוש פעמים נפח הערוץ (90 μL). הוסיפו PBS למאגר אחד ושאפו בזהירות מהמאגר השני. חזור על שלב זה בכל אחד מ- 6 הערוצים לכל שקופית. הערה: עבור כל שלבי הכביסה והדגירה הפתרון המתאים מתווסף באחד המאגרים המוביל לחילופי פתרונות בערוץ. כדי לאפשר החלפה מלאה של פתרונות בערוץ, הפתרון העודף הוא שאיפה אז מן המאגר האחר. הפתרון בחלק העליון של התאים בערוץ אינו מוסר. תאים לא צריכים להתייבש בכל עת. לכן, חשוב לשטוף בזהירות ללא כל החדרת בועת אוויר לתוך השקופיות.</li>
	<li>תקן את התאים על ידי הוספת 90 μL של פתרון PFA 4% במאגר שבו ה- PBS נוספה מראש ושאף באופן דומה את הנוזל מהמאגר האחר. חזור על שלב זה בכל ערוץ בכל שקופית. לאחר הוספת פתרון PFA, להעביר את הדגימות מקרח לטמפרטורת החדר (RT) ודגרה במשך 20 דקות. זהירות: PFA רעיל ויש לטפל בו בזהירות. השתמש בכפפות ועבוד מתחת למכסה המנוע.</li>
	<li>לשטוף תאים 3x עם PBS (RT) על ידי הוספתו במאגר אחד ושאיפה בזהירות מן המאגר השני. רוקן רק את המאגרים, והבטיח לא לייבש את הערוץ. חזור על שלב זה עבור כל אחד מ- 6 הערוצים בכל שקופית.</li>
	<li>להרוות את קיבעון PFA על ידי הוספת 90 μL של כלוריד אמוניום 50 מ"מ הסביבה ב- PBS באחד המאגרים. שאפו פתרון עודף מהמאגר השני. חזור על הפעולה עבור כל ערוץ בשקופית. לדגור על הדגימות במשך 10 דקות ב RT.</li>
	<li>לשטוף כמתואר בשלב 2.5. הערה: בשלב זה, הדגימות עשויות להיות מאוחסנות ב 4 °C (4 °F) לילה, או הפרוטוקול ניתן להמשיך מיד עם חסימה ודגורת נוגדנים ראשונית (ראה שלב 3).</li>
</ol>3. חסימה ודגרת נוגדנים ראשונית
<ol><li>כדי לחלחל לתאים, הוסף 90 μL של 0.3% טריטון-X-100 ב- PBS במאגר ריק, ושאף מהמאגר השני עבור כל ערוץ. דגירה במשך 10 דקות ב RT.</li>
	<li>לשטוף כמתואר בשלב 2.5.</li>
	<li>הוסף 90 μL של פתרון חסימת PLA סטרילי במאגר אחד של ערוץ ושאף מהצד השני. חזור על שלב זה עבור כל ערוץ. לחסום במשך 1 שעות ב 37 °C (50 °F) בתא לח.<ol>
<li>כדי להפוך תא לח, להשתמש צלחת 10 ס"מ עם רקמה רטובה אטומה עם סרט שעווה ומניחים את המנה באינקובטור. לחלופין, ניתן להשתמש בפורמטים אחרים של תאי לחות המספקים אווירה לחה. הערה: לחלופין, פתרון חסימה מתוצרת עצמית ניתן להשתמש (למשל, 3% (w/v) BSA ב- PBS, סינון סטרילי).</li>
	</ol>
</li>
	<li>הכן נוגדנים ראשוניים (1:100) בדילול נוגדנים PLA. הכן 30 μL של הפתרון לכל ערוץ. מוסיפים את שני הנוגדנים העיקריים בו זמנית ואת המערבולת. הערה: לחלופין, ניתן להשתמש בדלל נוגדנים מתוצרת עצמית (למשל, 1% (w/v) BSA ב- PBS). נוגדנים המשמשים כאן הם שילובים של SMAD1-SMAD2/3, SMAD2/3-SMAD4 ופוספו-SMAD1/5-SMAD4. מידע מפורט ניתן למצוא בטבלת החומרים.</li>
	<li>לפני היישום של נוגדנים ראשוניים, לשאוף את פתרון חסימה מן המאגרים, וגם, בזהירות מן הערוץ. Pipette 30 μL של פתרון הנוגדנים העיקרי מיד לתוך הערוץ הריק על ידי הטיית הערוץ תוך הוספת הפתרון. הערה: בצע את הסרת פתרון החסימה ותוספת של ערוץ אחר ערוץ פתרון נוגדנים כדי להבטיח שתאים לא יתייבשו ביניהם.</li>
	<li>דגימות דגירה עם הנוגדנים העיקריים לילה בתאים לחים ב 4 °C (50 °F). הערה: הדגירה יכולה להתבצע גם במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר, אם מעוניין להמשיך עם השלבים הבאים באותו יום.</li>
</ol>4. דגירה של גשושית PLA
הערה: עבור כל השלבים בסעיף 4.1-7.3, מאגרי הכביסה A ו- B מאוחסנים ב 4 °C (7 °F) ויש לחמם אותם ל- RT לפני השימוש.
<ol><li>לדלל PLA-בדיקות (+)-עכבר ו --)ארנב ל 1:5 ב PLA נוגדן דילול (או 1% BSA) פתרון. הכן 30 μL לערוץ.</li>
	<li>לשטוף דגימות 2x במשך 5 דקות באמצעות 90 μL של חוצץ לשטוף A ב RT על ידי הוספת אותו באחד המאגרים ושאיפה בזהירות מן המאגר השני. חזור על שלב זה עבור כל אחד מ- 6 הערוצים בכל שקופית.</li>
	<li>שאפו את מאגר הכביסה בזהירות והוסיפו 30 μL של פתרון בדיקה PLA (מוכן בשלב 4.1), בדומה לתוספת של נוגדנים ראשוניים בשלב 3.5.</li>
	<li>דגימות דגירה עבור 1 שעה ב 37 °C (50 °F) בתא לח.</li>
</ol>5. קשירה
<ol><li>לשטוף דגימות 2x במשך 5 דקות באמצעות 90 μL של חוצץ לשטוף A ב RT, כמתואר 4.2.</li>
	<li>הכן דילול 1:5 של מאגר הקשירה במים דה-יעומת. השתמש במאגר זה כדי לדלל את האנזים ליגאז ל 1:40 (על קרח). השתמש ב- 30 μL לערוץ.</li>
	<li>שאפו את מאגר הכביסה A לחלוטין והוסיפו את תמסת קשירה כמתואר ב-3.5.</li>
	<li>דגימות דגירה במשך 30 דקות ב 37 °C (50 °F) בתא לח.</li>
</ol>6. הגברה
<ol><li>לשטוף דגימות 2x במשך 2 דקות באמצעות 90 μL של חוצץ לשטוף A ב RT, כמתואר 4.2.</li>
	<li>הכן את מאגר ההגברה על ידי דילולו 1:5 במים דה-יונים והשתמש בו כדי לדלל את האנזים פולימראז ל-1:80 (על הקרח). הגן מפני אור. הכן 30 μL לערוץ.</li>
	<li>שאפו את מאגר הכביסה A הוסיפו באופן מלא ומיידי את פתרון ההגברה המוכן לערוץ הריק, כמתואר ב-3.5. דגימות דגירה במשך 100 דקות ב 37 °C (50 °F) בתא לח.</li>
</ol>7. הרכבה
<ol><li>לשטוף דגימות 2x במשך 10 דקות באמצעות 90 μL של לשטוף חוצץ B ב RT כמתואר 4.2. הוסף DAPI (1:500) מפתרון מלאי מ"ג /מ"ל אחד (במים דה-יושפזים) בשטיפה הראשונה כדי להכתים גרעינים. אין לייבש את הערוץ.</li>
	<li>לדלל את חוצץ לשטוף B במים deionized (1:10) ולשטוף 1x עם 90 μL של 0.1x חוצץ B פתרון כמתואר 4.2.</li>
	<li>שואפים את חוצץ הכביסה B לחלוטין ומיד להוסיף 2-3 טיפות של נוזל הרכבה בינונית למאגר אחד. פזר אותו בערוץ על-ידי הטיית השקופית. יש לאחסן דגימות במהירות של 4 °C (7%), בסביבה לחה עד להדמיה.</li>
</ol>8. רכישת תמונות
<ol><li>השג תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. ודא כי המסננים המתאימים לבדיקות PLA פלואורסצנטיות זמינים. הערה: זה מועיל לעשות שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי, אם אפשר, כמו כתמי PLA שהושגו מוגדרים יותר. הדבר תומך גם בעיבוד תמונה נוסף וניתוח נתונים.</li>
</ol>9. ניתוח וכימות תמונה באמצעות ImageJ/FIJI
<ol><li>עבד תמונות מיוצאות (.tiff) עם תוכנית לעיבוד תמונה, כגון ImageJ27. הערה: כל התסריטים המשמשים במחקר זה והם נחוצים לספירה אוטומטית של תאיים, גרעיניים וכל אירועי PLA (לכל תא) ניתן למצוא במאגר GitHub: https://github.com/Habacef/Proximity-Ligation-Assay-analysis. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות כל תוכנית או כלי מתאימים.</li>
</ol>

<ol><li>Yadin, D., Knaus, P., Mueller, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+BMP+receptors%3A+Specificity%2C+activation+and+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+and+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">Structural insights into BMP receptors: Specificity, activation and inhibition.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 27, 13-34 (2016).</li>
<li>Sieber, C., Kopf, J., Hiepen, C., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+BMP+receptor+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cytokine+and+Growth+Factor+Reviews%22%5BJournal%5D)">Recent advances in BMP receptor signaling.</a> Cytokine and Growth Factor Reviews. 20 (5-6), 343-355 (2009).</li>
<li>Hiepen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMPR2+acts+as+a+gatekeeper+to+protect+endothelial+cells+from+increased+TGF%CE%B2+responses+and+altered+cell+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">BMPR2 acts as a gatekeeper to protect endothelial cells from increased TGFβ responses and altered cell mechanics.</a> PLoS Biology. 17 (12), 3000557(2019).</li>
<li>Hildebrandt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ActivinA+induced+SMAD1%2F5+Signaling+in+an+iPSC+derived+EC+model+of+Fibrodysplasia+Ossificans+Progressiva+%28FOP%29+can+be+rescued+by+the+drug+candidate+saracatinib%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">ActivinA induced SMAD1/5 Signaling in an iPSC derived EC model of Fibrodysplasia Ossificans Progressiva (FOP) can be rescued by the drug candidate saracatinib.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , (2021).</li>
<li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+the+activation+state+of+the+endothelium+via+two+distinct+TGF-beta+type+I+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Balancing the activation state of the endothelium via two distinct TGF-beta type I receptors.</a> The EMBO Journal. 21 (7), 1743-1753 (2002).</li>
<li>Goumans, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+receptor-like+kinase+%28ALK%291+is+an+antagonistic+mediator+of+lateral+TGFbeta%2FALK5+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Activin receptor-like kinase (ALK)1 is an antagonistic mediator of lateral TGFbeta/ALK5 signaling.</a> Molecular Cell. 12 (4), 817-828 (2003).</li>
<li>Daly, A. C., Randall, R. A., Hill, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transforming+growth+factor+beta-induced+Smad1%2F5+phosphorylation+in+epithelial+cells+is+mediated+by+novel+receptor+complexes+and+is+essential+for+anchorage-independent+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transforming growth factor beta-induced Smad1/5 phosphorylation in epithelial cells is mediated by novel receptor complexes and is essential for anchorage-independent growth.</a> Molecular and Cellular Biology. 28 (22), 6889-6902 (2008).</li>
<li>Ramachandran, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-%CE%B2+uses+a+novel+mode+of+receptor+activation+to+phosphorylate+SMAD1%2F5+and+induce+epithelial-to-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">TGF-β uses a novel mode of receptor activation to phosphorylate SMAD1/5 and induce epithelial-to-mesenchymal transition.</a> eLife. 7, 31756(2018).</li>
<li>Flanders, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brightfield+proximity+ligation+assay+reveals+both+canonical+and+mixed+transforming+growth+factor-%CE%B2%2Fbone+morphogenetic+protein+Smad+signaling+complexes+in+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry+%3A+The+Official+Journal+of+The+Histochemistry+Society%22%5BJournal%5D)">Brightfield proximity ligation assay reveals both canonical and mixed transforming growth factor-β/bone morphogenetic protein Smad signaling complexes in tissue sections.</a> The Journal of Histochemistry and Cytochemistry : The Official Journal of The Histochemistry Society. 62 (12), 846-863 (2014).</li>
<li>Miyazono, K., Maeda, S., Imamura, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMiyazono%2C+K+%22Smad+Signal+Transduction%3A+Smads+in+Proliferation%2C+Differentiation+and+Disease%22">Smad Signal Transduction: Smads in Proliferation, Differentiation and Disease</a>. Dijke, P. T., Heldin, C. -H. , Springer Netherlands. Dordrecht. 277-293 (2006).</li>
<li>Goumans, M. J., Zwijsen, A., Ten Dijke, P., Bailly, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+proteins+in+vascular+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic proteins in vascular homeostasis and disease.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (2), 031989(2018).</li>
<li>Cai, J., Pardali, E., Sánchez-Duffhues, G., ten Dijke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+in+vascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">BMP signaling in vascular diseases.</a> FEBS Letters. 586 (14), 1993-2002 (2012).</li>
<li>Cunha, S. I., Magnusson, P. U., Dejana, E., Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deregulated+TGF-%CE%B2%2FBMP+signaling+in+vascular+malformations%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+research%22%5BJournal%5D)">Deregulated TGF-β/BMP signaling in vascular malformations.</a> Circulation research. 121 (8), 981-999 (2017).</li>
<li>MacCarrick, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loeys-Dietz+syndrome%3A+a+primer+for+diagnosis+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics+in+Medicine+%3A+An+Official+Journal+of+the+American+College+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loeys-Dietz syndrome: a primer for diagnosis and management.</a> Genetics in Medicine : An Official Journal of the American College of Medical Genetics. 16 (8), 576-587 (2014).</li>
<li>Baeyens, N., Bandyopadhyay, C., Coon, B. G., Yun, S., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+fluid+shear+stress+sensing+in+vascular+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Endothelial fluid shear stress sensing in vascular health and disease.</a> The Journal of Clinical Investigation. 126 (3), 821-828 (2016).</li>
<li>Min, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+Smad+2%2F3+signaling+by+low+shear+stress+mediates+artery+inward+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Activation of Smad 2/3 signaling by low shear stress mediates artery inward remodeling.</a> bioRxiv. , 691980(2019).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+receptor-integrin+interaction+mediates+responses+of+vascular+endothelial+Smad1%2F5+and+proliferation+to+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thrombosis+and+Haemostasis%22%5BJournal%5D)">BMP receptor-integrin interaction mediates responses of vascular endothelial Smad1/5 and proliferation to disturbed flow.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 741-755 (2013).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force-specific+activation+of+Smad1%2F5+regulates+vascular+endothelial+cell+cycle+progression+in+response+to+disturbed+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Force-specific activation of Smad1/5 regulates vascular endothelial cell cycle progression in response to disturbed flow.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (20), 7770-7775 (2012).</li>
<li>van Dijk, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+TGF-%CE%B2+and+BMP+signaling+in+human+atherosclerosis%3A+A+histological+evaluation+based+on+Smad+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Visualizing TGF-β and BMP signaling in human atherosclerosis: A histological evaluation based on Smad activation.</a> Histology and Histopathology. 27 (3), 387-396 (2012).</li>
<li>Derwall, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+bone+morphogenetic+protein+signaling+reduces+vascular+calcification+and+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Arteriosclerosis%2C+Thrombosis%2C+and+Vascular+Biology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of bone morphogenetic protein signaling reduces vascular calcification and atherosclerosis.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 32 (3), 613-622 (2012).</li>
<li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
<li>Alam, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+Ligation+Assay+%28PLA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Proximity Ligation Assay (PLA).</a> Current Protocols in Immunology. 123 (1), 58(2018).</li>
<li>Application Note 03: Growing Cells in µ-Channels. ibidi. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN03_Growing_cells.pdf</a> (2012).</li>
<li>Application Note 13: HUVECs under perfusion. ibidi. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf">https://ibidi.com/img/cms/support/AN/AN13_HUVECs_under_perfusion.pdf</a> (2019).</li>
<li>ibidi. Application Note 31: Instructions µ-Slide VI 0.4. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ibidi%22">ibidi</a>. , (2013).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Reichenbach, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+impact+of+fluid+shear+stress+and+YAP%2FTAZ+on+BMP%2FTGF-%CE%B2+induced+osteogenic+target+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Biology%22%5BJournal%5D)">Differential impact of fluid shear stress and YAP/TAZ on BMP/TGF-β induced osteogenic target genes.</a> Advanced Biology. 5 (2), 2000051(2021).</li>
<li>Hiepen, C., Mendez, P. L., Knaus, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((It+takes+two+to+tango%3A+Endothelial+TGF%CE%B2%2FBMP+signaling+crosstalk+with+mechanobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">It takes two to tango: Endothelial TGFβ/BMP signaling crosstalk with mechanobiology.</a> Cells. 9 (9), 1965(2020).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין ניגוד אינטרסים.

הפרוטוקול מבוסס PLA המתואר כאן מציע דרך יעילה לקבוע קרבה של שני חלבונים (למשל, האינטראקציה הישירה שלהם) ב- ECs החשופים ללחץ גיסת עם רזולוציה כמותית ומרחבית. באמצעות שקופיות זרימה עם ערוצים מקבילים מרובים, ניתן לבחון מספר אינטראקציות חלבון שונות בו זמנית בתאים בתנאים מכניים זהים. לעומת זאת, מערכות תא זרימה בהתאמה אישית עושות לעתים קרובות שימוש בערוץ יחיד הבנוי סביב כיסוי זכוכית, מה שיאפשר ניסוי PLA יחיד בלבד ללא הפקדים הדרושים לכל שקופית ומשאבה. למרות פרוטוקול זה מתמקד בזיהוי של אינטראקציות SMAD, זה יכול להיות מותאם כדי ל...

חלבונים של גורמי גדילה משתנים בטא (TGFβ) superfamily הם ציטוקינים pleiotropic עם מגוון רחב של חברים, כולל TGFβs, חלבונים מורפוגנטיים עצם (BMPs), ו Activins1,2. כריכת ליגנד גורמת להיווצרות של אוליגומרים קולטנים המובילים לזרחן, ובכך, הפעלה של SMAD רגולטורי ציטוטולי (R-SMAD). בהתאם למשפחת המשנה של ליגנדים, R-SMADs שונים מופעלים1,2. בעוד TGFβs ו Activins בעיקר לגרום זרחן של SMAD2/3, BMPs לגרום SMAD1/5/8 זרחן. עם זאת, ישנן עדויות מצטברות כי BMPs ו- TGFβs/Activins מפעילים גם R-SMADs של תת-המשפחה האחרת בהתאמה, בתהליך המכונה 'איתות לרוחב'3,4,5,6,7,8 וכי ישנם מתחמי SMAD מעורבים המורכבים משניהם, SMAD1/5 ו- SMAD2/3, חברים3,9 . שני R-SMADs מופעלים לאחר מכן יוצרים מתחמים טרימרים עם המתווך המשותף SMAD4. מתחמי גורמי שעתוק אלה מסוגלים לאחר מכן להעביר את ההקצאה לגרעין ולווסת את שעתוק הגנים היעד. SMADs יכול לקיים אינטראקציה עם מגוון של מפעילי שיתוף תעתיק שונים ומדכאים משותפים, מה שמוביל לגיוון האפשרויות לווסת את הגנים היעד10. הסרת הפיקוח על איתות SMAD יש השלכות חמורות במגוון מחלות. בהתאם לכך, איתות TGFβ/BMP לא מאוזן עלול להוביל לפתולוגיות כלי דם חמורות, כגון יתר לחץ דם בעורק הריאות, טלנגיקטזיה דימומית תורשתית, או טרשת עורקים3,11,12,13,14.
תאי אנדותל (ECs) יוצרים את השכבה הפנימית ביותר של כלי הדם ולכן הם חשופים ללחץ גזוז (SS), כוח חיכוך המופעל על ידי הזרימה הצמיגית של הדם. מעניין, ECs המתגוררים בחלקים של vasculature, אשר חשופים לרמות גבוהות של מדים, למינאר SS, נשמרים במצב הומיאוסטטי ורגיע. לעומת זאת, ECs שחווים SS נמוך, לא אחיד, למשל, ב bifurcations או עקמומיות פחותה של קשת אב העורקים, הם שגשוג ולהפעיל מסלולים דלקתיים15. בתורו, אתרים של ECs מתפקד נוטים לפתח טרשת עורקים. באופן מעניין, מחשבים אלקטרוניים באזורים אלה של אתראופרון מציגים רמות גבוהות באופן חריג של SMAD2/3 ו- SMAD1/516,17,18. בהקשר זה, איתות TGFβ/BMP משופר נמצא כאירוע מוקדם בהתפתחות נגעים טרשת עורקים19 והפרעה לאיתות BMP נמצאה כמפחיתה באופן משמעותי דלקת כלי דם, היווצרות אתראומה והסתיידות נלווית20.
קרבה קשירת Assay (PLA) היא טכניקה ביוכימית לחקר אינטראקציות חלבון חלבון במקום 21,22. הוא מסתמך על הספציפיות של נוגדנים של מינים שונים שיכולים לקשור חלבונים ממוקדים של עניין, ומאפשר זיהוי ספציפי מאוד של אינטראקציות חלבון אנדוגני ברמה של תא אחד. כאן, נוגדנים ראשוניים צריכים להיקשר לאפיטופ היעד שלהם במרחק של פחות מ -40 ננומטר כדי לאפשר את הגילוי23. לכן, PLA מועיל מאוד על גישות אימונו-immunoprecipitation מסורתיות, שבו כמה מיליוני תאים נדרשים כדי לזהות אינטראקציות חלבון אנדוגני. ב- PLA, נוגדנים משניים ספציפיים למינים, המקושרים באופן קוולנטי לרסיסי DNA (המכונים בדיקות פלוס ומינוס), קושרים את הנוגדנים העיקריים ואם חלבוני העניין מתקשרים, בדיקות פלוס ומינוס מגיעות בסמיכות. הדנ"א נקשר בשלב הבא והגברת המעגל המתגלגל של הדנ"א המעגלי מתאפשרת. במהלך ההגברה, oligonucleotides משלימים שכותרתו פלואורסצנטרית נקשרים לדנ"א המסונתז, ומאפשרים לאינטראקציות חלבון אלה להיות חזותיות על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונבנציונלית.
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר למדענים להשוות כמותית את מספר מתחמי שעתוק SMAD הפעילים בתנאי Atheroprotective ו atheroprone SS במבחנה באמצעות PLA. SS נוצר באמצעות מערכת משאבה פנאומטית ניתנת לתכנות המסוגלת ליצור זרימה חד-כיוונית למינארית של רמות מוגדרות ומאפשרת עלייה צעדים של קצבי הזרימה. שיטה זו מאפשרת זיהוי של אינטראקציות בין SMAD1/5 או SMAD2/3 עם SMAD4, כמו גם מתחמי R-SMAD מעורבים. ניתן להרחיב אותו בקלות כדי לנתח אינטראקציות של SMADs עם רגולטורים משותפים תמלול או כדי לתמלול גורמים מתחמים אחרים מלבד SMADs. איור 1 מציג את השלבים העיקריים של הפרוטוקול המוצג להלן.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62608/62608fig01.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של הפרוטוקול המתואר. (A) תאים הנזרעים בשקופיות של 6 ערוצים חשופים ללחץ גניסיה עם מערכת משאבה פנאומטית. (B) תאים קבועים משמשים לניסוי PLA או לתנאי בקרה. (C) תמונות של ניסויי PLA נרכשות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ומנותחות באמצעות תוכנת ניתוח ImageJ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62608/62608fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td>&micro;-Slide VI 0.4</td><td>ibidi</td><td>80606</td><td>שקופית 6 ערוצים</td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד</td><td>קארל רוט</td><td>K298.1</td><td>מרווה</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>קארל רוט</td><td>8076.4</td><td>חסימת</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>D9542</td><td>כתם DNA/גרעינים</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-53500</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Duolink In ריאגנטים לזיהוי באתר: Green</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>DUO92014</td><td>ערכת PLA המכילה ליגאז, מאגר קשירה, פולימראז ומאגר הגברה (עם תווית ירוקה אוליגונוקלאוטידים)</td></tr> <tr><td>Duolink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS</td><td>Sigma Aldrich/ Merck</td><td>DUO92004</td><td>MINUS בדיקה</td></tr><tr><td>Duolink באתרה בדיקת PLA אנטי-ארנב PLUS</td><td>סיגמא אולדריץ'/ Merck</td><td>DUO92002</td><td>PLUS בדיקה</td></tr><tr><td>Duolink במאגרי שטיפה באתר, מאגרי שטיפה פלואורסצנטיים</td><td>סיגמא אולדריץ' / Merck</td><td>DUO82049</td><td>PLA תוסף</td></tr><tr><td>צמיחת תאי אנדותל</td> תוסף <td>קורנינג</td><td></td><td>לבינוני (ECGS)</td></tr> <tr><td>תוסף</td>סרום <td></td><td></td><td>עגל עוברי</td></tr><tr>לבינוני<td>FIJI</td><td></td><td></td><td>תוכנת ניתוח תמונה</td></tr><tr><td>פורמלדהיד 4% מאגר</td><td>KLINIPATH / VWR</td><td>VWRK4186. BO1</td><td>PFA</td></tr><tr><td>בינוני מלא</td><td></td><td></td><td>M199 בינוני בסיסי +20% FCS +1% P/S + 2 ננומטר L-Glu +&nbsp; 25 ומיקרו; גר/מ"ל Hep +&nbsp; &nbsp; 50 ומיקרו; g/mL ECGS</td></tr><tr><td>ג'לטין מעור חזיר, סוג A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G2500</td><td>השתמש ב-0.1% ב-PBS לציפוי תעלות זרימה</td></tr><tr><td>GraphPad Prism v.7</td><td>GarphPad</td><td></td><td>תוכנית סטטיסטית המשמשת לעלילות וחישובים סטטיסטיים</td></tr><tr><td>מלח נתרן הפרין מרירית המעי חזיר</td><td>תוסף Sigma Aldrich</td><td>H4784-250MG</td> עבור HUVECs <td>בינוניים</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>(Hep)</td></tr><tr><td>ibidi הרכבה בינונית</td><td>ibidi</td><td>50001</td><td>הרכבה נוזלית בינונית</td></tr><tr><td>ibidi מערכת משאבות</td><td>ibidi</td><td>10902</td><td>משאבה פנאומטית</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8</td><td>Leica</td><td></td><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td></tr><tr><td>L-Glutamin 200mM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>תוסף לבינוני (L-Glu)</td></tr> <tr><td>בינוני 199</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M2154</td><td>בסיס בינוני</td></tr><tr><td>עכבר נגד SMAD1 נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab53745</td><td>מתאים לעכבר PLA</td></tr><tr><td>אנטי-SMAD2/3 נוגדן</td><td>BD Bioscience</td><td>610843</td><td>לא מתאים ל-PLA בשילוב עם CST 9515</td></tr><tr><td>mousee anti- SMAD4 נוגדן</td><td>Sanata Cruz Biotechnology</td><td>sc-7966</td><td>מתאים ל-PLA</td></tr><tr><td>פניצילין 10.000U/ml /Streptomycin 10mg/ml</td><td>PAN Biotech</td><td>P06-07100</td><td>תוסף לבינוני (P/ S)</td></tr> <tr><td>סט זלוף לבן</td><td>ibidi</td><td>10963</td><td>צינורות המשמשים ל 1 dyn / cm2</td></tr><tr><td>סט זלוף צהוב וירוק</td><td>ibidi</td><td>10964</td><td>צינורות המשמשים ל 30 dyn/cm2</td></tr><tr><td>rabbit אנטי פוספו SMAD1/5 טכנולוגיות</td><td>איתות תאי</td> נוגדנים <td>9516</td><td>מתאים ל PLA</td></tr><tr><td>ארנב אנטי- SMAD2/3 XP</td><td>טכנולוגיות איתות תאי</td> נוגדנים <td>8685</td><td>מתאים עבור PLA</td></tr><tr><td>ארנב אנטי- SMAD4 נוגדן</td><td>תאי איתות טכנולוגיות</td><td>9515</td><td>לא מתאים ל- PLA בשילוב עם BD 610843</td></tr><tr><td>מחבר טורי עבור &micro;-Slides</td><td>ibidi</td><td>10830</td><td>צינורות חיבור טוריים</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>קארל רוט</td><td>6683.1</td><td>חדירות</td></tr></tbody></table>

הדמיה וכימות של tgfβ/bmp/smad איתות בתנאי לחץ שונים של גיסת נוזלים באמצעות קרבה-קשירה-אסאי

Visualization and Quantification of TGF&#946;/BMP/SMAD Signaling under Different Fluid Shear Stress Conditions using Proximity-Ligation-Assay

שינוי גורם גדילה β (TGFβ)/חלבון מורפוגנטי עצם (BMP) איתות מוסדר ומאוזן היטב במהלך הפיתוח וההומאוסטזיס של מערכת כלי הדם ולכן, הסרת הפיקוח במסלול איתות זה גורמת לפתולוגיות כלי דם חמורות, כגון יתר לחץ דם בעורק הריאות, טלנגיקטזיה דימומית תורשתית וטרשת עורקים. תאי אנדותל (ECs), כמו השכבה הפנימית ביותר של כלי הדם, חשופים כל הזמן ללחץ גיסת נוזלים (SS). דפוסים חריגים של SS נוזל הוכחו כדי לשפר את זהות TGFβ/BMP, אשר, יחד עם גירויים אחרים, לגרום טרוגנזה. ביחס לכך, atheroprone, למינאר נמוך SS נמצא כדי לשפר את זהות TGFβ / BMP בעוד SS atheroprotective, למינר גבוה, מפחית איתות זה. כדי לנתח ביעילות את ההפעלה של מסלולים אלה, עיצבנו זרימת עבודה כדי לחקור את היווצרות מתחמי גורם התמלול תחת SS למינאר נמוך ותנאי SS למינאר גבוהים באמצעות מערכת משאבה פנאומטית זמינה מסחרית ובוח קשירת קרבה (PLA).
איתות TGFβ/BMP פעיל דורש היווצרות מתחמי SMAD טרימרים המורכבים משני SMAD רגולטוריים (R-SMAD); SMAD2/3 ו- SMAD1/5/8 עבור איתות TGFβ ו- BMP, בהתאמה) עם מתווך נפוץ SMAD (SMAD משותף; SMAD4). באמצעות PLA מיקוד subunits שונים של קומפלקס SMAD טרימר, כלומר, או R-SMAD / co-SMAD או R-SMAD / R-SMAD / R-SMAD, היווצרות של מתחמי גורם שעתוק SMAD פעיל ניתן למדוד כמותית מרחבית באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
השימוש בשקופיות זרימה עם 6 ערוצים מקבילים קטנים, שניתן לחבר בסדרה, מאפשר לחקור את גורם התמלול היווצרות מורכבת והכלה של פקדים נחוצים. 
זרימת העבודה המוסברת כאן יכולה להיות מותאמת בקלות למחקרים המתמקדים בקרבה של SMADs לגורמי שעתוק אחרים או למתחמי גורם תמלול שאינם SMADs, בתנאי SS זורמים שונים. זרימת העבודה המוצגת כאן מציגה דרך מהירה ויעילה ללמוד את האיתות TGFβ/BMP המושרה ב- SS הנוזלי ב- ECs, הן כמותית והן מרחבית.

השתמשנו בעבר PLA כדי לזהות אינטראקציות של חלבוני SMAD שונים3 וניתחנו שינויים המושרה מתח גיזה בזרחן SMAD28.
כאן, שתי השיטות שולבו עם הפרוטוקול שתואר לעיל. HUVECs היו נתונים ללחץ גיסת של 1 גוון / cm2 ו 30 גוון / cm2 ונותחו עבור אינטראקציות של גורמי שעתוק SMAD. אנו מראים כי בהשוואה ללחץ הגיסה הגבוה (30 גוון/cm2), מתח הגיסה הנמוך (1 גוון/cm2) מוביל לעלייה משמעותית באינטראקציות SMAD1-SMAD2/3, מה שנקרא מתחמי ...

כאן, אנו מקימים פרוטוקול כדי לדמיין ולנתח בו זמנית מתחמי SMAD מרובים באמצעות בדיקת קשירת קרבה (PLA) בתאי אנדותל החשופים לתנאי לחץ גזיר נוזלים פתולוגיים ופיזיולוגיים.

הדמיה וכימות של TGFβ/BMP/SMAD איתות בתנאי לחץ שונים של גיסת נוזלים באמצעות קרבה-קשירה-אסאי

Transforming Growth Factor &#946; (TGF&#946;)/Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling is tightly regulated and balanced during the development and ...

פרוטוקול זה מאפשר למדענים להשוות כמותית את מספר מתחמי גורם התמלול בתנאי לחץ גיסת שונים, ויהיה מועיל למחקר בביולוגיה של כלי הדם. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא השימוש בערוצי זרימה מיקרופלואידיים המאפשרים חקירות של מספר זוגות נוגדנים, כולל הפקדים המתאימים בו זמנית. בתור התחלה, מצפים את שקופית שש הערוצים על ידי הוספת ג'לטין עור חזירי 0.1% שהוכן ב- PBS לערוצים במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.רוקן את הערוצים מפתרון הג'לטין וזרע Huvecs בשקופיות שש הערוצים המקודדות מראש בצפיפות של 2.5 כפול 10 עד התא השישי למיליליטר ב -30 מיקרוליטרים של M199 מדיום שלם. אפשר לתאים לדבוק במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח. הוסף 60 מיקרוליטרים של M199 מדיום מלא שהוזהר מראש לכל אחד מהמאגרים.תרבית התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך יומיים באינקובטור לח עם תחליף בינוני לאחר 24 שעות. הר צינורות סיליקון על יחידות הנוזלים, למלא את המאגרים עם מינימום של 10 מיליליטר של M199 הזהיר מראש מדיום מלא. חבר את היחידות הנוזליות עם צינורות למערכת המשאבה ולבצע את הריצה מראש ללא תאים לאי שוויון המדיום והסרת כל האוויר הנותר.חבר את הערוצים הבודדים בשקופית ששת הערוצים באמצעות צינורות החיבור הסידורי. חבר את הערוץ הראשון והאחרון בשקופית לצינורות המותקנים ביחידת הנוזלים. לחשיפה של התאים לרמות גבוהות של מתח מוחלט, להגדיל את צעד הלחץ העצום חכם עם שלבי הסתגלות, הגדרת השלבים במרווחים של חמישה דינים לסנטימטר מרובע לכל 30 דקות.השתמש בגושים על הצינורות כדי לנתק את השקופיות ממשאבות לאחר חשיפה ללחץ גיסת נוזלים, הימנעות משפיכה בינונית באינקובטור, והעברת שקופיות זרימה על קרח. בעת ניתוק הצינורות מהמאגרים, השתמש באצבע כדי לסגור את הצד השני של המאגר כדי למנוע לכידת בועות האוויר בערוץ. שמירה על שקופית הזרימה על קרח, שאפו את המדיום בזהירות מן המאגרים אבל לא מן הערוץ שבו התאים שוכנים.לשטוף את הדגימות עם 90 microliters של PBS סטרילי קר על ידי הוספת PBS למאגר אחד ושאף בזהירות מן המאגר השני, ולאחר מכן לחזור על כל הערוצים. תקן את התאים על ידי הוספת 90 מיקרוליטרים של פתרון 4%PFA במאגר שבו נוספה ה- PBS ושאף את הנוזל מהמאגר האחר כפי שהוכח. לאחר תיקון התאים בכל ששת הערוצים, להעביר את הדגימות מקרח לטמפרטורת החדר, ודגרה במשך 20 דקות.לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS על ידי הוספת PBS למאגר אחד ושאיפה אותו בזהירות מן המאגר השני בכל הערוצים, דואג לא לייבש את הערוצים. Quench גישה PFA על ידי הוספת 90 microliters של הסביבה 15 מילימום כלוריד מוכן PBS לאחד המאגרים. שאפו מהמאגר השני ודגרו את התאים במשך 10 דקות.פרמז'יליזם את התאים על ידי הוספת 90 מיקרוליטרים של 0.3% טריטון X 100 שהוכנו ב- PBS במאגר הריק. שאפו מהמאגר השני לכל ערוץ ודגרו במשך 10 דקות, ואז שטפו שלוש פעמים עם PBS כפי שהודגם בעבר. ב 90 microliters של פתרון חסימת PLA סטרילי למאגר אחד.שואפים מהצד השני לכל ערוץ ודגר במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס בתא לח. הוסף נוגדנים ראשוניים בדלל נוגדני PLA ומערבולת. שאפו בקפידה את פתרון החסימה מהמאגרים והתעלים.הוסף 30 מיקרוליטרים של פתרון הנוגדנים הראשי מיד לערוץ הריק על-ידי הטיית השקופית תוך הוספת הפתרון. חוזרים על הפעולה עבור כל הערוצים ודגרה בארבע מעלות צלזיוס בתא לח לילה או ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לדלל מינוס ארנב פלוס עכבר PLA בודק אחד עד חמישה בדלל נוגדן PLA.לשטוף את כל הערוצים פעמיים על ידי הוספת 90 microliters של חוצץ לשטוף A ושאיפה כפי שהוכח. לאחר שאיפת מאגר הכביסה, להוסיף 30 microliters של פתרון בדיקה PLA ודגורה בתא לח. לדלל את מאגר הקשירה אחד עד חמישה במים מיוננים D וללדול את האנזים ליגוס אחד עד 40 במאגר קשירה מדולל.לאחר שטיפת ושאיפה מוחלטת של חוצץ הכביסה A, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תמיסה לקשירה לערוצים הריקים תוך כדי הטיית השקופית, ודגרה בתא הלח. לדלל את מאגר ההגברה אחד עד חמישה במים deionized, ולאחר מכן לדלל את האנזים פולימראז אחד עד 80 במאגר הגברה מדולל על קרח. לאחר שטיפת ושאיפה מוחלטת של חוצץ הכביסה A, להוסיף 30 microliters של פתרון הגברה לערוצים הריקים תוך הטיית השקופית, ודגרה אותו בתא לח.לדלל את DAPI אחד עד 500 ב חוצץ לשטוף B ולשטוף את כל הערוצים פעם אחת על ידי הוספת 90 microliters של DAPI המכילים חוצץ לשטוף B, ושאיפה כפי שהוכח לאדות את הגרעינים. לאחר מכן לשטוף את כל הערוצים פעם אחת עם חוצץ לשטוף B ללא DAPI. לדלל את חוצץ לשטוף B אחד עד 10 במים deionized ולשטוף את כל הערוצים פעם אחת עם 90 microliters של חוצץ לשטוף מדולל B.לאחר שאיפה לשטוף חוצץ B, מיד להוסיף שתיים עד שלוש טיפות של נוזל הרכבה בינוני למאגר אחד, ולהטות את השקופית כדי להפיץ את המדיום הרכבה בכל הערוצים.לאחסן את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס בסביבה לחה עד הדמיה. Huvecs נחשפו ללחץ מוחלט גבוה ונמוך. הלחץ הגיסתי הנמוך הגביר את האינטראקציות של חלבון SMAD בציטוסול ובגרעין.בקרות נוגדנים בודדות הראו לא למעט מאוד אותות, מה שמוכיח את הצלחת הניסוי. ריכוז נוגדנים מוגבר הביא למספר גבוה יותר של אירועי PLA לתא, אך ההבדל באותות PLA בין תאים חשופים ללחץ גבוה ונמוך הופחת. מאגרים מתוצרת עצמית לחסימה ודילול נוגדנים יכולים לשמש כחלופה למאגרים מסחריים.הכימות של אירועי PLA עבור פתרונות דילול וחסימה מסחריים ובעצמאיים הראה את אותו דפוס של אותות PLA באזורים הציטוטוסוליים והגרעיניים. עם זאת, המספר הכולל של אירועי PLA לתא היה גבוה יותר עם פתרונות מסחריים. שילוב של SMAD שתיים/שלוש, נוגדני SMAD ארבעה שימש שבו נוגדן SMAD ארבע לא היה מתאים לניסויים אימונופלואורסצנטיים.לא היה הבדל באירועי PLA במצב הניסיוני לעומת הבקרה, המציין את החשיבות של בחירת שילוב הנוגדנים הנכון כדי לזהות את אירועי PLA. הפרוטוקול המתואר יכול להיות מותאם כדי לזהות את האינטראקציות של מתחמי גורם שעתוק שונים SMADs ולכן לעזור להבין ויסות גנים בתנאי הגנה אתרו ואתרו.

visualization-quantification-tgfbmpsmad-signaling-under-different

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

כאן אנו מראים כיצד להשתמש קשירת הסמיכות Assay (PLA), עם שילוב של נוגדנים לדמיין המוךפו"גנטי שהולך עצם חלבון (BMP) איתות תאים קבוע. טכניקה זו אפשרה לנו לעקוב אחר הצטברות הגרעין של BMP אנדוגני מופעל מפעיל, מתחמי ולכמת רמות שלהם לאורך זמן תחת גירוי BMP4.

איתור של מפעיל איתות, מתחמי Downstream של BMP4 שימוש באתרו PLA, Assay קשירת הסמיכות

Assay כדי למדוד כמותית הפיכת גורם הגדילה (TGF)-β-Induced הפלישה ב 3 מימדי ג'ל קולגן מתואר. Assay זו מנצלת את הסדרה MCF10A של שורות תאים, המייצגים שלבים שונים של התפתחות סרטן השד. שיטה זו יכולה להיות מאומץ לשימוש עם שורות תאים אחרים עשוי לשמש כדי לחקור activators פוטנציאליים אחרים או מעכבי הפלישה.

Assay Spheroid למדוד TGF-β-Induced Invasion

חדרי זרימת microfluidic חרוט על ידי photolithography מפוברק מ PDMS מוחלים לחקור התוצאות התפקודיות הקשורות בתפקוד EC ודלקת. בניסוי מייצג, את היכולת של מאמץ גזירה ההפרש לווסת הידבקות התא monocytic כדי הפעלת ציטוקינים EC monolayers באה לידי ביטוי.

על שבב phenotyping דלקתיות האנדותל

התמיינות תאים מוסדרת על ידי שורה של גורמי microenvironmental, כוללים שני תכונות חומר רכב מצע מטריקס. אנו מתארים כאן טכניקת ניצול microarrays תא בשיתוף עם מיקרוסקופ כוח המתיחה להעריך הן התמיינות תאי אינטראקציות תא-מצע ביומכנית כפונקציה של הקשר microenvironmental.

פלטפורמת Microarray Cell תפוקה גבוהה עבור ניתוח גומל של התמיינות תאי כוחות המתיחה

עבור במבחנה אינדוקציה של המעבר אנדותל-mesenchymal (EndMT), אשר הוא שימושי עבור חוקרים הסלולר איתות המסלולים מעורב EndMT, פרוטוקול המתואר. במודל זה ניסיוני, EndMT הנגרמת על ידי טיפול עם TGF-β בתאי האנדותל MS-1.

אנליזה מולקולרית של אנדותל-mesenchymal מעבר המושרה על ידי הפיכת גורם גידול-β איתות

כאן, אנו מציגים עבור תא חי הדמיה של TGF-β/Smad3 פעילות איתות באמצעות מערכת הכתב אדנו פרוטוקול. המערכת עוקבת אחר פעילות גנים ברמת השעתוק בזמן אמת, ניתן להחיל שני תאים בודדים במבחנה , החימודלים.

חיים תא הדמיה של TGF-β/Smad3 איתות לשביל במבחנה , In Vivo באמצעות מערכת הכתב אדנו

אנו מציגים את התפוקה הגבוהה כוח המתיחה שיטת המציא עם גומי סיליקון (PDMS). העיבוד החדשני הזה מתאים ללימוד שינויים פיזיים בתהליך ביולוגי ומחלות בתהליכים ביולוגיים וביורפואיים שונים. אנו מדגימים את כלי השירות של שיטה זו על-ידי מדידת העליה התלויה של TGF-β במהלך המעבר האפיתל-למסמצ'אל.

תפוקה גבוהה המתיחה כוח מיקרוסקופ באמצעות PDMS מגלה השפעות תלויי מינון של שינוי מקדם הצמיחה-β על המעבר אפיתל-to-מעבר משנה

מטרת הפרוטוקול הזה היא לבצע תרבות משותפת דינמית של מקרופאגים אנושיים ומיופיברובלסטים בפיגומי אלקטרו-ספון צינוריים כדי לחקור התחדשות רקמות מונחית חומרים, באמצעות ביו-ריאה המאפשרת ניתוק של לחץ גיסת ומתיחות מחזוריות.

ביו-ריאקטור רב-שלבי להערכת היכולת הדלקתית וההתחדשותית של ביו-חומרים תחת זרימה ומתיחות

אנו מתארים זרימת עבודה שיטתית כדי לחקור איתות TGF-β ו- EMT הנגרמת על ידי β TGF על ידי לימוד ביטוי החלבון והגנים המעורבים במסלול איתות זה. השיטות כוללות סופג מערבי, בדיקת כתב לוציפראז, qPCR, וכתמי כשל חיסוני.

לימוד TGF-β איתות ו TGF-β-induced אפיתל-ל-mesenchymal מעבר בסרטן השד ותאים נורמליים

מודל במבחנה של נישה וסקולרית של מח העצם נקבע על ידי זריעת תאים מזנכימליים ואנדותל על הידרוג'ל PEG תלת-ממדי יצוק מראש. רשתות האנדותל, רכיבי ECM ופעילות ALP של הנישות משתנים בהתאם לגורם הגדילה בו נעשה שימוש. הפלטפורמה יכולה לשמש למודלים מתקדמים של סרטן.

הקמה פשוטה של נישת מח עצם אוסטאוגנית וסקולרית באמצעות הידרוג'לים פוליאתילן גליקול (PEG) יצוקים מראש במיקרו-צלחת הדמיה

למד הדמיה וכימות של מורכבי SMAD בתאי אנדותל תחת תנאי לחץ שונים באמצעות קרבה-קשירה-אסאי. פרוטוקול זה משפר את ההבנה של ביולוגיית כלי הדם והשפעת לחץ הגזירה.

הדמיה וכימות של TGFβ/BMP/SMAD איתות בתנאי לחץ שונים של גיסת נוזלים באמצעות קרבה-קשירה-אסאי

גלה סרטונים נוספים