הדמיה וכימות של TGFβ/BMP/SMAD איתות בתנאי לחץ שונים של גיסת נוזלים באמצעות קרבה-קשירה-אסאי

פרוטוקול זה מאפשר למדענים להשוות כמותית את מספר מתחמי גורם התמלול בתנאי לחץ גיסת שונים, ויהיה מועיל למחקר בביולוגיה של כלי הדם. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא השימוש בערוצי זרימה מיקרופלואידיים המאפשרים חקירות של מספר זוגות נוגדנים, כולל הפקדים המתאימים בו זמנית. בתור התחלה, מצפים את שקופית שש הערוצים על ידי הוספת ג'לטין עור חזירי 0.1% שהוכן ב- PBS לערוצים במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

רוקן את הערוצים מפתרון הג'לטין וזרע Huvecs בשקופיות שש הערוצים המקודדות מראש בצפיפות של 2.5 כפול 10 עד התא השישי למיליליטר ב -30 מיקרוליטרים של M199 מדיום שלם. אפשר לתאים לדבוק במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לח. הוסף 60 מיקרוליטרים של M199 מדיום מלא שהוזהר מראש לכל אחד מהמאגרים.

תרבית התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך יומיים באינקובטור לח עם תחליף בינוני לאחר 24 שעות. הר צינורות סיליקון על יחידות הנוזלים, למלא את המאגרים עם מינימום של 10 מיליליטר של M199 הזהיר מראש מדיום מלא. חבר את היחידות הנוזליות עם צינורות למערכת המשאבה ולבצע את הריצה מראש ללא תאים לאי שוויון המדיום והסרת כל האוויר הנותר.

חבר את הערוצים הבודדים בשקופית ששת הערוצים באמצעות צינורות החיבור הסידורי. חבר את הערוץ הראשון והאחרון בשקופית לצינורות המותקנים ביחידת הנוזלים. לחשיפה של התאים לרמות גבוהות של מתח מוחלט, להגדיל את צעד הלחץ העצום חכם עם שלבי הסתגלות, הגדרת השלבים במרווחים של חמישה דינים לסנטימטר מרובע לכל 30 דקות.

השתמש בגושים על הצינורות כדי לנתק את השקופיות ממשאבות לאחר חשיפה ללחץ גיסת נוזלים, הימנעות משפיכה בינונית באינקובטור, והעברת שקופיות זרימה על קרח. בעת ניתוק הצינורות מהמאגרים, השתמש באצבע כדי לסגור את הצד השני של המאגר כדי למנוע לכידת בועות האוויר בערוץ. שמירה על שקופית הזרימה על קרח, שאפו את המדיום בזהירות מן המאגרים אבל לא מן הערוץ שבו התאים שוכנים.

לשטוף את הדגימות עם 90 microliters של PBS סטרילי קר על ידי הוספת PBS למאגר אחד ושאף בזהירות מן המאגר השני, ולאחר מכן לחזור על כל הערוצים. תקן את התאים על ידי הוספת 90 מיקרוליטרים של פתרון 4%PFA במאגר שבו נוספה ה- PBS ושאף את הנוזל מהמאגר האחר כפי שהוכח. לאחר תיקון התאים בכל ששת הערוצים, להעביר את הדגימות מקרח לטמפרטורת החדר, ודגרה במשך 20 דקות.

לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS על ידי הוספת PBS למאגר אחד ושאיפה אותו בזהירות מן המאגר השני בכל הערוצים, דואג לא לייבש את הערוצים. Quench גישה PFA על ידי הוספת 90 microliters של הסביבה 15 מילימום כלוריד מוכן PBS לאחד המאגרים. שאפו מהמאגר השני ודגרו את התאים במשך 10 דקות.

פרמז'יליזם את התאים על ידי הוספת 90 מיקרוליטרים של 0.3% טריטון X 100 שהוכנו ב- PBS במאגר הריק. שאפו מהמאגר השני לכל ערוץ ודגרו במשך 10 דקות, ואז שטפו שלוש פעמים עם PBS כפי שהודגם בעבר. ב 90 microliters של פתרון חסימת PLA סטרילי למאגר אחד.

שואפים מהצד השני לכל ערוץ ודגר במשך שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס בתא לח. הוסף נוגדנים ראשוניים בדלל נוגדני PLA ומערבולת. שאפו בקפידה את פתרון החסימה מהמאגרים והתעלים.

הוסף 30 מיקרוליטרים של פתרון הנוגדנים הראשי מיד לערוץ הריק על-ידי הטיית השקופית תוך הוספת הפתרון. חוזרים על הפעולה עבור כל הערוצים ודגרה בארבע מעלות צלזיוס בתא לח לילה או ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לדלל מינוס ארנב פלוס עכבר PLA בודק אחד עד חמישה בדלל נוגדן PLA.

לשטוף את כל הערוצים פעמיים על ידי הוספת 90 microliters של חוצץ לשטוף A ושאיפה כפי שהוכח. לאחר שאיפת מאגר הכביסה, להוסיף 30 microliters של פתרון בדיקה PLA ודגורה בתא לח. לדלל את מאגר הקשירה אחד עד חמישה במים מיוננים D וללדול את האנזים ליגוס אחד עד 40 במאגר קשירה מדולל.

לאחר שטיפת ושאיפה מוחלטת של חוצץ הכביסה A, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תמיסה לקשירה לערוצים הריקים תוך כדי הטיית השקופית, ודגרה בתא הלח. לדלל את מאגר ההגברה אחד עד חמישה במים deionized, ולאחר מכן לדלל את האנזים פולימראז אחד עד 80 במאגר הגברה מדולל על קרח. לאחר שטיפת ושאיפה מוחלטת של חוצץ הכביסה A, להוסיף 30 microliters של פתרון הגברה לערוצים הריקים תוך הטיית השקופית, ודגרה אותו בתא לח.

לדלל את DAPI אחד עד 500 ב חוצץ לשטוף B ולשטוף את כל הערוצים פעם אחת על ידי הוספת 90 microliters של DAPI המכילים חוצץ לשטוף B, ושאיפה כפי שהוכח לאדות את הגרעינים. לאחר מכן לשטוף את כל הערוצים פעם אחת עם חוצץ לשטוף B ללא DAPI. לדלל את חוצץ לשטוף B אחד עד 10 במים deionized ולשטוף את כל הערוצים פעם אחת עם 90 microliters של חוצץ לשטוף מדולל B.לאחר שאיפה לשטוף חוצץ B, מיד להוסיף שתיים עד שלוש טיפות של נוזל הרכבה בינוני למאגר אחד, ולהטות את השקופית כדי להפיץ את המדיום הרכבה בכל הערוצים.

לאחסן את הדגימות בארבע מעלות צלזיוס בסביבה לחה עד הדמיה. Huvecs נחשפו ללחץ מוחלט גבוה ונמוך. הלחץ הגיסתי הנמוך הגביר את האינטראקציות של חלבון SMAD בציטוסול ובגרעין.

בקרות נוגדנים בודדות הראו לא למעט מאוד אותות, מה שמוכיח את הצלחת הניסוי. ריכוז נוגדנים מוגבר הביא למספר גבוה יותר של אירועי PLA לתא, אך ההבדל באותות PLA בין תאים חשופים ללחץ גבוה ונמוך הופחת. מאגרים מתוצרת עצמית לחסימה ודילול נוגדנים יכולים לשמש כחלופה למאגרים מסחריים.

הכימות של אירועי PLA עבור פתרונות דילול וחסימה מסחריים ובעצמאיים הראה את אותו דפוס של אותות PLA באזורים הציטוטוסוליים והגרעיניים. עם זאת, המספר הכולל של אירועי PLA לתא היה גבוה יותר עם פתרונות מסחריים. שילוב של SMAD שתיים/שלוש, נוגדני SMAD ארבעה שימש שבו נוגדן SMAD ארבע לא היה מתאים לניסויים אימונופלואורסצנטיים.

לא היה הבדל באירועי PLA במצב הניסיוני לעומת הבקרה, המציין את החשיבות של בחירת שילוב הנוגדנים הנכון כדי לזהות את אירועי PLA. הפרוטוקול המתואר יכול להיות מותאם כדי לזהות את האינטראקציות של מתחמי גורם שעתוק שונים SMADs ולכן לעזור להבין ויסות גנים בתנאי הגנה אתרו ואתרו.