Name: מיצוי והדמיה של אגרגטים חלבון לאחר טיפול של Escherichia coli עם מתח פרוטאוטוקסי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-29T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: חקור מיצוי והדמיה של אגרגטים חלבון ב-Escherichia coli לאחר טיפול במתח פרוטאוטוקסי. פרוטוקול זה מאפשר השוואה איכותנית בין זני חיידקים שונים וניתוח השפעת מחיקות גנים ותרכובות פרוטאוטוקסיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי קרנות הסטארט-אפ של בית הספר למדעי הביולוגיה של אוניברסיטת אילינוי, מענק יוזמת הפקולטה החדשה של אוניברסיטת אילינוי, ומענק NIAID R15AI164585 (ל- J.-U. D.). G.M.A. נתמך על ידי תוכנית התמיכה במחקר לתואר ראשון באוניברסיטת אילינוי (ל- G.M.A.). K. P. H. נתמך על ידי מלגת RISE שסופקה על ידי שירות חילופי האקדמיה הגרמנית (DAAD). המחברים מודים לד"ר אוו לנדאו וד"ר קרסטן מאייר מ-Largentech Vertriebs GmbH על אספקת אבקת AGXX. איור 3 , איור 4 ואיור 5 נוצרו עם Biorender.

1. טיפול בלחץ של זני E. coli MG1655 ו- CFT073
<ol><li>לחסן 5 מ"ל של מרק ליזוגני (LB) בינוני עם מושבה אחת של זן E. coli commensal MG1655 ו זן E. coli (UPEC) זן uropathogenic (UPEC), בהתאמה, ודגרה עבור 14-16 שעות (לילה) ב 37 °C (7 °F) ו 300 סל"ד. הערה: Escherichia coli CFT073 הוא פתוגן אנושי. הטיפול ב- CFT073 חייב להתבצע עם אמצעי בטיחות ביולוגית מתאימים במעבדה מוסמכת ברמת בטיחות ביולוגית 2.</li>
	<li>לדלל כל זן לתוך בקבוקון 500 מ"ל המכיל 70 מ"ל של 3-(N-morpholino)propanesulfonic חומצה פרופנסולפונית (MOPS)-גלוקוז (MOPS-g) (טבלה 1) בינוני לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר (OD600) ערךשל 0.1. דגירה ב 37 °C (300 סל"ד עד לשלב אמצע היומן הוא הגיע (OD600 = 0.5-0.55).</li>
	<li>העבר 20 מ"ל מכל תרבות לשלושה צלוחיות 125 מ"ל לפני המלחמה ודגרה ב 37 °C (7 °F) ו 300 סל"ד במשך 2 דקות. הערה: כאשר נדרש עיבוד בזמן של הדגימות, לטפל לא יותר מ 6 תרבויות בכל פעם.</li>
	<li>הכן פתרון תרכובת מיקרוביאלית ב MOPS-g בינוני בריכוז של 2 מ"ג/ מ"ל. הוסף את האנטי מיקרוביאלית לכל תרבות כדי להגיע לריכוזים שצוינו. עבור הפקד שלא טופל, הוסף את אמצעי האחסון הנדרש של אמצעי MOPS-g. הערה: מערבולת פתרון 2 מ"ג / מ"ל מיקרוביאלית כדי לאפשר הפצה שווה של החלקיקים המורכבים ולהימנע משקעים.</li>
	<li>לדגור על התרבויות במשך 45 דקות ב 37 °C (7 °F) ו 300 סל"ד.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig01.jpg"> איור 1: טיפול הלחץ של אשריצ'יה קולי. תרביות חיידקים גדלות ב- MOPS-g ומטופלות בריכוזים המצוינים של האנטי מיקרוביאלית המכילה כסף-רותניום כאשר מגיעים לשלב אמצע היומן. קיצורים: LB = מרק ליסוגניה; Ag-Ru = כסף-רותניום; MOPS-g = 3-(N-morpholino)חומצה פרופנסולפונית (MOPS)-גלוקוז. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62628/62628fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
2. איסוף דגימות תאי חיידקים
<ol><li>לאחר 45 דקות של טיפול בלחץ, לקבוע את OD600 של כל תרבות. עבור כל מדגם, תאי קציר שווה ערך 4 מ"ל של OD600 = 1 ב 15 mL צינורות צנטריפוגה על ידי צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 3,000 × גרם ו 4 °C (5 °F).</li>
	<li>הסר לחלוטין את supernatant ו resuspend כדורי התא ב 50 μL של חיץ תמה קר כקרח(טבלה 1). לדגור את הדגימות במשך 30 דקות על קרח. הערה: שלב תמוגה זה משפיל את שכבת הפפטידוגיקן. השתמש תמיד במאגר תמיסת מוכן טרי.</li>
	<li>העבר את הדגימות לתוך 1.7 מ"ל צינורות microcentrifuge. יש להקפיא ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig02.jpg"> איור 2: אוסף דגימות חיידקים. דגימות תאים נקצרים על ידי צנטריפוגה ו resuspended במאגר תמוגה ואחריו אחסון ב -80 °C.please <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62628/62628fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
3. חילוץ אגרגטים של חלבונים מסיסים
<ol><li>להפשיר דגימות על קרח. הערה: מחזור הפשרת ההקפאה תורם לתסיסת תאים.</li>
	<li>הוסף 360 μL של חוצץ קר כקרח A (טבלה 1) ומערבבים בעדינות על ידי pipetting. הערה: ההלם האוסמוטי יתרום גם לתסיסת תאים.</li>
	<li>העבר את המדגם לצינור microcentrifuge 2 מ"ל המכיל ~ 200 μL של חרוזי זכוכית 0.5 מ"מ. דגירה במשך 30 דקות ב 8 °C (8 °F) תרמומיקסר עם רועד ב 1,400 סל"ד. הערה: שלב זה גורם להפרעה הפיזית של התא. מעכב פרוטאז יכול לשמש כדי למזער את השפלת החלבון. ההפרעה יכולה להתבצע ב 4 °C (5 °F). שים לב כי השימוש חרוזי זכוכית דווח כדי לגרום לצבירה של תת קבוצה קטנה של חלבונים שמרים19.</li>
	<li>דגירה במשך 5 דקות על קרח מבלי לרעוד כדי ליישב את חרוזי הזכוכית. העבר 200 μL של lysate התא לתוך 1.7 מ"ל צינורות microcentrifuge. הערה: הימנע מהעברת חרוזי הזכוכית.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 16,000 × גרם ו 4 °C (50 °F) במשך 20 דקות. אסוף את supernatant, אשר מכיל חלבונים מסיסים, ולהמשיך סעיף 4.</li>
	<li>resuspend הכדור ב 200 μL של חוצץ קר כקרח A (טבלה 1) באמצעות pipette. צנטריפוגה ב 16,000 × גרם ו 4 °C (50 °F) במשך 20 דקות. הסר בזהירות את סופר-טבעי לגמרי.</li>
	<li>הוסף 200 μL של חוצץ קר כקרח B (ראה טבלה 1 ואת טבלת החומרים) בזהירות respened הכדור על ידי pipetting. הערה: חומר הניקוי הלא-יוני סולוביליזה של חלבון הממברנה.</li>
	<li>חזור על צנטריפוגה ב 16,000 × גרם ו 4 °C (50 °F) במשך 20 דקות. הסר בזהירות את סופר-טבעי.</li>
	<li>resuspend הכדור ב 200 μL של חוצץ קר A (טבלה 1) על ידי pipetting. צנטריפוגה ב 16,000 × גרם ו 4 °C (50 °F) במשך 20 דקות. הסר לחלוטין את סופר-טבעי.</li>
	<li>Resuspend הכדור ב 100 μL של 1x הפחתת SDS חוצץ מדגם(טבלה 1)ולהרתיח במשך 5 דקות ב 95 °C (5 °F) תרמומיקסר.</li>
	<li>יש לאחסן את המדגם ב- -20 °C כדי להמשיך מאוחר יותר או לטעון מיד על ג'ל פוליאקרילמיד SDS להפרדה.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig03.jpg"> איור 3: הפקת אגרגטים של חלבונים מסיסים. הפקת אגרגטים של חלבונים כרוכה בשורה של צעדים כולל הפרעה לתאים, הפרדת צבירי חלבון מחלבונים מסיסים, סולוביליזציה של חלבונים ממברנה, ושטיפה. קיצור: SDS = נתרן דודסיל סולפט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62628/62628fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
4. הכנת דגימת חלבון מסיס
<ol><li>יש לערבב נפח אחד של 100% חומצה טריכלורואצטית (TCA) עם 4 כרכים של דגימת חלבון מסיס משלב 3.6. הערה: טיפול ב- TCA דורש מכסה מנוע אדים וציוד מגן אישי והליך סילוק פסולת מאושר.</li>
	<li>דגירה במשך 10 דקות ב 4 °C (5 °F) כדי לאפשר משקעים חלבון. הערה: משקעים לבנים יופיעו בקרוב מאוד.</li>
	<li>צנטריפוגה כדי לזרז ב 21,000 × גרם ו 4 °C (5 °F) במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. לשטוף את הכדור עם 200 μL של אצטון קר כקרח כדי להסיר פסולת הסלולר. צנטריפוגה ב 21,000 × גרם ו 4 °C (5 °F) במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant. חזור על פעולות אלה בשלב 4.3 בסך הכל שלוש פעמים.</li>
	<li>מניחים את צינורות microcentrifuge עם מכסים פתוחים תרמומיקסר ב 37 °C (37 °F) כדי להסיר את האצטון הנותר מן הכדור. הערה: דגירה של יותר מ 5 דקות עשוי להפחית את המסיסות של כדורי חלבון.</li>
	<li>הוסף 100 μL של 1x הפחתת מאגר SDS (טבלה 1) ולהמיס לחלוטין את הכדור. מרתיחים את המדגם במשך 5 דקות ב 95 °C (70 °F).</li>
	<li>יש לאחסן דגימה ב- -20 °C כדי להמשיך מאוחר יותר או לטעון מיד על ג'ל פולאקרילמיד SDS להפרדה.</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig04.jpg"> איור 4: הכנת חלבונים מסיסים. הכנת חלבון מסיס כרוכה צעד משקעים עם חומצה טריכלורואצטית ושטיפה חוזרת ונשנית עם אצטון קר כקרח. קיצורים: TCA = חומצה טריכלורואצטית; SDS = נתרן דודסיל סולפט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62628/62628fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
5. הפרדה והדמיה של אגרגטים של חלבונים שחולצו באמצעות SDS-PAGE
<ol><li>הכינו ג'ל SDS-polyacrylamide 12%.<ol>
<li>עבור שני ג'לים מפרידים, pipette 5.1 מ"ל של מים מזוקקים כפולים (ddH2O), 3.75 מ"ל של Tris-HCl (pH 8.8), 7.5 מ"ל של 20% (w/v) SDS, 6 מ"ל של 30% אקרילאמיד/ביסאקרילמיד (29:1) פתרון, 75 מ"ל של 10% w/v אמוניום אסולפט, ו-10 מ"ל של טטרמתילאתיל-דיאמין (TEMED) לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל ומערבבים בעדינות מבלי להכניס בועות אוויר. יוצקים את הג'ל באמצעות צינור 1 מ"ל בתוך לוחות הזכוכית, משאיר את העליון 2 ס"מ ללא התערובת. מוסיפים 70% אתנול על גבי הג'ל המפריד ומאפשרים ממשק אחיד בין שתי השכבות.</li>
		<li>לאחר פילמור של ג'ל ההפרדה, להכין את ג'ל לערום על ידי pipetting 1.535 מ"ל של ddH2O, 625 מ"ל של פתרון Tris-HCl (pH 6.8), 12.5 מ"ל של 20% (w /v) SDS, 335 מ"ל של 30% אקרילאמיד / ביסאקרילמיד (29:1) פתרון, 12.5 מ"ל של 10% w / v אמוניום persulfate, ו 2.5 מ"ל של TEMED. הסר את האתנול מן הג'לים המפרידים ולהוסיף את פתרון ג'ל לערום. הכנס מסרק עם מספר הכיסים הרצוי מבלי להציג בועות אוויר. אפשר פילמור במשך 20-30 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>טען 4 μL של כל דגימה וסולם חלבונים לתוך בארות נפרדות ולהפעיל את הג'ל (ים) חוצץ ריצה טריס-גליצין(טבלה 1)ב 144 V במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: עצור את הג'ל כאשר הלהקה bromophenol עומד לנדוד מתוך הג'ל.</li>
	<li>מכתים את הג'ל בפתרון פיירבנקס מחמם מראש A(טבלה 1)למשך 30 דקות על רוקר.</li>
	<li>צבע את הג'ל בפתרון פיירבנקס מחמם מראש D(טבלה 1)עד לרקע הרצוי (למשל, בן לילה) על רוקר.</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig05.jpg"> איור 5: הפרדת חלבונים והדמיה. הדגימות מופרדות על-ידי SDS-PAGE ומומזות על-ידי כתמי קומאסי. קיצור: SDS-PAGE = נתרן דודסיל סולפט-פוליאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62628/62628fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<ol><li>Dahl, J. -U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HdeB+functions+as+an+acid-protective+chaperone+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">HdeB functions as an acid-protective chaperone in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (1), 65-75 (2015).</li>
<li>Foit, L., George, J. S., Zhang, B. W., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+activation+by+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chaperone activation by unfolding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 1254-1262 (2013).</li>
<li>Sultana, S., Foti, A., Dahl, J. -U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+defense+systems+against+the+neutrophilic+oxidant+hypochlorous+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Bacterial defense systems against the neutrophilic oxidant hypochlorous acid.</a> Infection and Immunity. 88 (7), 00964(2020).</li>
<li>Dahl, J. -U., Gray, M. J., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quality+control+under+oxidative+stress+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein quality control under oxidative stress conditions.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (7), 1549-1563 (2015).</li>
<li>Groitl, B., Dahl, J. -U., Schroeder, J. W., Jakob, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+defense+systems+against+microbicidal+oxidants%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa defense systems against microbicidal oxidants.</a> Molecular Microbiology. 106 (3), 335-350 (2017).</li>
<li>Casadevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+restriction+as+an+antimicrobial+function+of+fever%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Thermal restriction as an antimicrobial function of fever.</a> PLoS Pathogens. 12 (5), 1005577(2016).</li>
<li>Richter, K., Haslbeck, M., Buchner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heat+shock+response%3A+life+on+the+verge+of+death%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">The heat shock response: life on the verge of death.</a> Molecular Cell. 40 (2), 253-266 (2010).</li>
<li>Van Loi, V., Busche, T., Preuß, T., Kalinowski, J., Bernhardt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AGXX+%C2%AE+antimicrobial+coating+causes+a+thiol-specific+oxidative+stress+response+and+protein+S-bacillithiolation+in+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The AGXX ® antimicrobial coating causes a thiol-specific oxidative stress response and protein S-bacillithiolation in Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 3037(2018).</li>
<li>Anfinsen, C. B., Scheraga, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+and+theoretical+aspects+of+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Protein+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Experimental and theoretical aspects of protein folding.</a> Advances in Protein Chemistry. 29, 205-300 (1975).</li>
<li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation in bacteria.</a> FEMS Microbiology Reviews. 44 (1), 54-72 (2020).</li>
<li>Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+the+roles+of+chaperones+and+proteases+in+protein+folding+and+degradation+in+the+Escherichia+coli+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol.</a> Molecular Microbiology. 40 (2), 397-413 (2001).</li>
<li>Gray, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphate+is+a+primordial+chaperone%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Polyphosphate is a primordial chaperone.</a> Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).</li>
<li>Weids, A. J., Ibstedt, S., Tamás, M. J., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+stress+conditions+result+in+aggregation+of+proteins+with+similar+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Distinct stress conditions result in aggregation of proteins with similar properties.</a> Scientific Reports. 6, 24554(2016).</li>
<li>Mogk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+thermolabile+Escherichia+coli+proteins%3A+prevention+and+reversion+of+aggregation+by+DnaK+and+ClpB%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB.</a> EMBO Journal. 18 (24), 6934-6949 (1999).</li>
<li>Fay, A., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+nonredundant+role+for+mycobacterial+DnaK+in+native+protein+folding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">An essential nonredundant role for mycobacterial DnaK in native protein folding.</a> PLoS Genetics. 10 (7), 1004516(2014).</li>
<li>Schramm, F. D., Heinrich, K., Thüring, M., Bernhardt, J., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+regulatory+function+of+the+DnaK+chaperone+dictates+the+decision+between+proliferation+and+maintenance+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">An essential regulatory function of the DnaK chaperone dictates the decision between proliferation and maintenance in Caulobacter crescentus.</a> PLoS Genetics. 13 (12), 1007148(2017).</li>
<li>Maisonneuve, E., Fraysse, L., Moinier, D., Dukan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Existence+of+abnormal+protein+aggregates+in+healthy+Escherichia+coli+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Existence of abnormal protein aggregates in healthy Escherichia coli cells.</a> Journal of Bacteriology. 190 (3), 887-893 (2008).</li>
<li>Heiss, A., Freisinger, B., Held-Föhn, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+antibacterial+activity+of+silver-ruthenium+coated+hollow+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biointerphases%22%5BJournal%5D)">Enhanced antibacterial activity of silver-ruthenium coated hollow microparticles.</a> Biointerphases. 12 (5), (2017).</li>
<li>Papnayotou, I., Sun, B., Roth, A. F., Davis, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+induced+during+glass+bead+lysis+of+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation induced during glass bead lysis of yeast.</a> Yeast. 27 (10), 801-816 (2010).</li>
<li>Chuang, S. E., Blattner, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+twenty-six+new+heat+shock+genes+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Characterization of twenty-six new heat shock genes of Escherichia coli.</a> Journal of Bacteriology. 175 (16), 5242-5252 (1993).</li>
<li>Imlay, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+mechanisms+and+physiological+consequences+of+oxidative+stress%3A+Lessons+from+a+model+bacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: Lessons from a model bacterium.</a> Nature Reviews Microbiology. 11 (7), 443-454 (2013).</li>
<li>Mühlhofer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heat+shock+response+in+yeast+maintains+protein+homeostasis+by+chaperoning+and+replenishing+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">The heat shock response in yeast maintains protein homeostasis by chaperoning and replenishing proteins.</a> Cell Reports. 29 (13), 4593-4607 (2019).</li>
<li>Chandrangsu, P., Rensing, C., Helmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metal+homeostasis+and+resistance+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Metal homeostasis and resistance in bacteria.</a> Nature Reviews Microbiology. 15, 338-350 (2017).</li>
<li>Stevens, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSP60%2F10+chaperonin+systems+are+inhibited+by+a+variety+of+approved+drugs%2C+natural+products%2C+and+known+bioactive+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+and+Medicinal+Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">HSP60/10 chaperonin systems are inhibited by a variety of approved drugs, natural products, and known bioactive molecules.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 29 (9), 1106-1112 (2019).</li>
<li>Schramm, F. D., Schroeder, K., Alvelid, J., Testa, I., Jonas, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth-driven+displacement+of+protein+aggregates+along+the+cell+length+ensures+partitioning+to+both+daughter+cells+in+Caulobacter+crescentus%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Growth-driven displacement of protein aggregates along the cell length ensures partitioning to both daughter cells in Caulobacter crescentus.</a> Molecular Microbiology. 111 (6), 1430-1448 (2019).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה ממוטבת לניתוח היווצרות צבירה של חלבונים לאחר טיפול בזני E. coli שונים עם מיקרוביאלית פרוטאוטוקסית. הפרוטוקול מאפשר מיצוי סימולטני של שברי חלבון בלתי מסיסים ותאי E. coli מטופלים ולא מטופלים. בהשוואה לפרוטוקולים הקיימים לבידוד צבירה של חלבונים מתאים14,15,16,20, לשיטה זו יש מספר יתרונות: (i) רק כרכים של תרבית קטנה (4-8 מ"ל) נדרשים; (ii)</e...

חיידקים חשופים באופן בלתי נמנע לאינספור לחצים סביבתיים, כולל רמת כוח נמוכה (למשל, בקיבה היונקית)1,2, מינים תגובתיים של חמצן וכלור (ROS/RCS) (למשל, במהלך התפרצות חמצונית בפגוציטים)3,4,5, טמפרטורות גבוהות (למשל, במעיינות חמים או במהלך הלם חום)6,7, וכמה מיקרוביאלים חזקים (למשל, AGXX המשמש בפרוטוקול זה)8. חלבונים פגיעים במיוחד לכל אחד מגורשי הלחץ האלה, וחשיפה יכולה לעורר חלבון un-/misfolding כי אז צבירת זרעים. כל האורגניזמים משתמשים במערכות הגנה המאפשרות להם להתמודד עם תקלות חלבון9. עם זאת, מתח חמור יכול להציף את מכונות בקרת איכות החלבון ולשבש את המבנה המשני ו /או שלישוני של חלבונים, אשר בסופו של דבר מנטרל חלבונים. כתוצאה מכך, אגרגטים של חלבונים עלולים לפגוע קשות בתפקודים תאיים קריטיים הנדרשים לצמיחה והישרדות חיידקים, עמידות ללחץ וארס10. לכן, מחקר המתמקד בצבירה של חלבונים והשלכותיו בחיידקים הוא נושא רלוונטי בשל השפעתו הפוטנציאלית על בקרת מחלות זיהומיות.
חלבון המושרה בחום מתפתח וצבירה הם לעתים קרובות הפיכים7. לעומת זאת, לחצים פרוטאוטוקסיים אחרים, כגון עקה חמצונית, יכולים לגרום לשינויים בלתי הפיכים בחלבון באמצעות חמצון של שרשראות צד ספציפיות של חומצות אמינו וכתוצאה מכך חלבון un-/misfolding, ובסופו של דבר, צבירת חלבון4. היווצרות הנגרמת על ידי מתח של אגרגטים חלבון מסיס נחקר בהרחבה בהקשר של מלווים מולקולריים ותפקודי המגן שלהם שמרים וחיידקים11,12,13. כמה פרוטוקולים פורסמו המשתמשים במגוון טכניקות ביוכימיות לבידוד וניתוח של אגרגטים חלבון מסיסים14,15,16,17. הפרוטוקולים הקיימים שימשו בעיקר לחקר צבירת חלבונים חיידקיים על הלם חום ו / או זיהוי של מלווים מולקולריים. בעוד פרוטוקולים אלה בהחלט היו התקדמות לתחום, יש כמה אי נוחות גדולה בהליכים הניסיוניים כי הם דורשים (i) נפח תרבית חיידקים גדולה של עד 10 L14,17, (ii) תהליכי שיבוש פיזיים מסובכים, כולל שימוש משבשי תאים, עיתונות צרפתית, ו / או sonication14,15,17, או (iii) זמן רב חוזר שטיפה ודגרה שלבים15,16,17.
מאמר זה מתאר פרוטוקול שונה שמטרתו לטפל במגבלות הגישות הקודמות ומאפשר ניתוח של כמות אגרגלי החלבון שנוצרו בשני זני קולי שונים של Escherichia לאחר טיפול בציפוי משטח מיקרוביאלי פרוטאוטוקסי. הציפוי מורכב מתכת כסף (Ag) ורותניום (Ru) מותנה בחומצה אסקורבית, ופעילותו מיקרוביאלית מושגת על ידי הדור של מיני חמצן תגובתי8,18. להלן תיאור מפורט של הכנת תרבית החיידקים לאחר הטיפול בתרכובת האנטי מיקרוביאלית והשוואה של מצב צבירת החלבון עם חשיפה של שני זני E. coli עם פרופילי רגישות ברורים להגברת הריכוז של מיקרוביאלית. השיטה המתוארת היא זולה, מהירה וניתן לשחזור וניתן להשתמש בה כדי לחקור צבירת חלבונים בנוכחות תרכובות פרוטאוטוקסיות אחרות. בנוסף, ניתן לשנות את הפרוטוקול כדי לנתח את ההשפעה שיש למחיקות גנים ספציפיות על צבירת חלבונים במגוון חיידקים שונים.

<table><tbody><tr><td><חזק>כימיקלים/ריאגנטים</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>67-64-1</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת 30% אקרילאמיד/ביסקרילאמיד 29:1</td><td>Bio-Rad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>Millipore Sigma</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>בנזונאז נוקלאז</td><td>סיגמא</td><td>E1014-5KU</td><td></td></tr><tr><td>סולם חלבון Bluestain 2, 5-245 kDa</td><td>GoldBio</td><td>P008-500</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-מרקפטואתנול</td><td>Millipore Sigma</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול</td><td>GoldBio</td><td>B-092-25</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>821616</td><td></td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-סוכרוז</td><td>Acros Organics</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediamine tetra acetic acid (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBT9686</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית</td><td>Millipore Sigma</td><td>ARK2183-1L</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול, 99%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>GoldBio</td><td>G-630-1</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית, מגיב ACS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320331-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופנול (2-פרופנול)</td><td>Sigma</td><td>402893-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>מרק LB (מילר)</td><td>Millipore Sigma</td><td>L3522-1KG</td><td></td></tr><tr><td>מרק LB עם אגר (מילר)</td><td>Millipore Sigma</td><td>L2897-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>GoldBio</td><td>L-040-25</td><td></td></tr><tr><td>10x MOPS Buffer</td><td>Teknova</td><td>M2101</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40</td><td>תומאס סיינטיפיק</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט, דו-בסיסי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786-1KG</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט, monobasic</td><td>Acros Organics</td><td>7778-77-0</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Millipore Sigma</td><td>T9281-50ML</td><td></td></tr><tr><td>תיאמין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T4625-100G</td><td></td></tr><tr><td>100% חומצה טריכלורואצטית</td><td>Millipore Sigma</td><td>T6399-100G</td><td></td></tr><tr><td>בסיס טריס</td><td>GoldBio</td><td>T-400-1</td><td></td></tr><tr><td><חזק>חומר/ציוד</צינורות ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה חזקים (15 מ"ל)</td><td>Alkali Scientific</td><td>JABG-1019</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק ארלנמאייר (125 מ"ל)</td><td>בקבוק קרולינה</td><td>726686</td><td></td></tr><tr><td>ארלנמאייר (500 מ"ל)</td><td>מקפיא קרולינה</td><td>726694</td><td></td></tr><tr><td>: -80 & deg; C</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית (0.5 מ"מ)</td><td>BioSpec Products</td><td>1107-9105</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>הרמל</td><td>Z216MK</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריגוג (1.7 מ"ל)</td><td>VWR International</td><td>87003-294</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריגוג (2.0 מ"ל)</td><td>Axygen Maxiclear Microtubes</td><td>MCT-200-C</td><td></td></tr><tr><td>קובטות</td> <td>פלסטיקFischer Scientific</td><td>14-377-012</td><td></td></tr><tr><td>ספק כוח</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>EC105</td><td></td></tr><tr><td>Rocker</td><td>Alkali Scientific</td><td>RS7235</td><td></td></tr><tr><td>חממת טלטול (37 & deg; ג)</td> <td>בנצ'מרק סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr><tr><td>צלחת זכוכית קטנה</td><td>Bio-Rad</td><td>1653311</td><td></td></tr><tr><td>לוחות מרווח (1 מ"מ)</td> <td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>צנטריפוגה 3339053</td><td></td><td></td>Thermoscientific</tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית לצינורות צנטריפוגה 15 מ"ל</td><td>בקמן-קולטר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תא אלקטרופורזה ג'ל אנכי</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td>1658004</tr><tr><td>Vortexer</td><td>Fisher Vortex Genie 2</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000-HC</td><td></td></tr><tr><td>10 באר מסרק</td><td>Bio-Rad</td><td>1653359</td><td></td></tr></tbody></table>

מיצוי והדמיה של אגרגטים חלבון לאחר טיפול של escherichia coli עם מתח פרוטאוטוקסי

Extraction and Visualization of Protein Aggregates after Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor

החשיפה של אורגניזמים חיים ללחצים סביבתיים ותאיים גורמת לעתים קרובות לשיבושים בהומאוסטזיס של חלבונים ויכולה לגרום לצבירה של חלבונים. הצטברות של אגרגטים חלבון בתאי חיידקים יכול להוביל לשינויים משמעותיים בהתנהגות פנוטיפית הסלולר, כולל ירידה בשיעורי הצמיחה, עמידות ללחץ, וארס. קיימים מספר הליכים ניסיוניים לבדיקת פנוטיפים אלה בתיווך הלחץ. מאמר זה מתאר בדיקה ממוטבת להפקה והדמיה של חלבונים מצטברים ומסיסים מזני קולי שונים של אשריצ'יה לאחר טיפול במיקרוביאלית המכילה כסף-רותניום. תרכובת זו ידועה לייצר מינים חמצן תגובתי וגורם צבירת חלבון נרחבת. 
השיטה משלבת הפרדה מבוססת צנטריפוגה של אגרגטים של חלבונים וחלבונים מסיסים מתאים מטופלים ולא מטופלים עם הפרדה והדמיה לאחר מכן על ידי נתרן דודזיל סולפט-פוליאקרילמיד ג'ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) וכתמים קומאסי. גישה זו פשוטה, מהירה, ומאפשרת השוואה איכותית של היווצרות צבירה של חלבונים בזני E. coli שונים. למתודולוגיה מגוון רחב של יישומים, כולל האפשרות לחקור את ההשפעה של מיקרוביאלים פרוטאוטוקסיים אחרים על צבירת חלבון ויו במגוון רחב של חיידקים. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש כדי לזהות גנים התורמים עמידות מוגברת לחומרים פרוטאוטוקסיים. רצועות ג'ל יכולות לשמש לזיהוי מאוחר יותר של חלבונים הנוטים במיוחד לצבירה.

<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62628/62628fig06.jpg"> איור 6: תוצאות מייצגות של צבירת חלבונים הנגרמת על ידי מיקרוביאלית בזן קולי Escherichia commensal MG1655 וזן UPEC CFT073. זני E. coli MG1655 ו- CFT073 גדלו ב 37 °C ו 300 סל"ד כדי OD600= 0.5-0.55 במדיה MOPS-g לפני שהם טופלו עם הריכוזים המצוינים (-, 0 מ"ג / מ"ל; +, 175 מ"ג / מ"ל; ++, 200 מ"ג / מ"ל) של מיקרוביאלית במשך 45 דקות. דגימות...

פרוטוקול זה מתאר את החילוץ והדמיון של חלבונים מצטברים ומסיסים מ Escherichia coli לאחר טיפול עם מיקרוביאלית פרוטאוטוקסית. בעקבות הליך זה מאפשרת השוואה איכותית של היווצרות צבירה של חלבון ב- vivo בזני חיידקים שונים ו/או בין טיפולים.

מיצוי והדמיה של אגרגטים חלבון לאחר טיפול של Escherichia coli עם מתח פרוטאוטוקסי

The exposure of living organisms to environmental and cellular stresses often causes disruptions in protein homeostasis and can result in protein ...

חשיפה ללחץ עלולה לגרום לצבירה של חלבונים ולגרום לשינויים משמעותיים בהתנהגות הפנוטיפית של חיידקים. ההליך המתואר בסרטון זה מאפשר מיצוי והדמיה של אגרגטים חלבון לאחר טיפול מתח. בניגוד לנהלים אחרים שפורסמו, פרוטוקול זה דורש מספרי תאים נמוכים יותר ונמנע מתהליכי שיבוש פיזיים מסובכים, כמו גם צעדי כביסה ודגורה הגוזלים זמן רב.פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר צבירת חלבונים במגוון רחב של חיידקים גרם שלילי ו גרם חיובי. אתה יכול גם לנתח את ההשפעה של מחיקות גנים או להשוות את היעילות של תרכובות פרוטאוטוקסיות. התחל על ידי חנק מושבה אחת של זן E.coli MG1655 ו זן E.coli אורופתיגני CFT073, כל אחד לחמישה מיליליטרים של ציר ליזוגניה, או LB, בינוני.לדגור על שתי תרביות המרק ב 37 מעלות צלזיוס ו 300 סל"ד במשך 14 עד 16 שעות. לדלל כל זן לצפיפות אופטית ב 600 ננומטר, או OD600, של 0.1 לתוך בקבוק 500 מיליליטר המכיל 70 מיליליטר של MOPS-g בינוני. לדגור את הבקבוקונים ב 37 מעלות ו 300 סל"ד עד לשלב אמצע היומן הוא הגיע.לאחר הדגירה, מעבירים 20 מיליליטר של כל תרבות לשלושה צלוחיות 125 מיליליטר מחוממות מראש, ודגר אותם ב-37 מעלות צלזיוס ו-300 סל"ד לשתי דקות. הכן פתרון תרכובת מיקרוביאלית של שני מיליגרם למיליליטר במדיום MOPS-g. הוסף פתרון זה לכל תרבות כדי להגיע לריכוזים הרצויים, והוסף את הנפח הנדרש של מדיום MOPS-g עבור השליטה הלא מטופלת.לקבוע את OD600 של כל תרבות לאחר 45 דקות של טיפול בלחץ. עבור כל מדגם, aliquot ארבעה מיליליטר של תרבות עם OD600 של אחד לתוך צינורות צנטריפוגות 15 מיליליטר. resuspend כדורי התא ב 50 microliters של חוצץ תמיסת קר כקרח.לדגור על הדגימות במשך 30 דקות על קרח. הוסיפו לדגימות 360 מיקרוליטרים של חוצץ קר כקרח A, וערבבו בעדינות על-ידי צנרת. העבר את הדגימות לתוך שני מיליליטר צינורות microcentrifuge עם סביב 200 microliters של חרוזי זכוכית 0.5 מ"מ.לדגור על הצינורות במשך 30 דקות בשמונה מעלות צלזיוס בתרמומיקסר עם רועד ב 1400 סל"ד. לדגור את הצינורות על הקרח במשך חמש דקות בלי לרעוד כדי ליישב את חרוזי הזכוכית. לאחר מכן להעביר 200 microliters של התא ליסייט לתוך צינורות microcentrifuge 1.7 מיליליטר.צנטריפוגות התא lysate במשך 20 דקות ב 16, 000 פעמים g ו 4 מעלות צלזיוס. לאסוף את supernatant, אשר ישמש דגימת חלבון מסיס מאוחר יותר. השתמש פיפטה כדי resuspend הכדור ב 200 microliters של חוצץ קר כקרח A.Centrifuge של הצינורות ב 16, 000 פעמים g ו 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.ואז בזהירות להסיר את supernatant לגמרי. השתמש פיפטה כדי בזהירות resuspend הכדור ב 200 microliters של חוצץ קר כקרח B.Centrifuge הצינורות שוב, ולהסיר בזהירות את supernatant. לאחר מכן לחזור על לשטוף עם חוצץ A.Resuspend הכדור ב 100 microliters של 1x הפחתת SDS חוצץ מדגם, ולהרתיח אותו במשך חמש דקות ThermoMixer ב 95 מעלות צלזיוס.מערבבים נפח אחד של 100% TCA עם ארבעה כרכים של דגימת החלבון המסיס שנאספו קודם לכן, ודגר במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס למכשכי חלבון. צנטריפוגה הדגימה ב 21, 000 פעמים g ו 4 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי להשיג את המשקעים, ולהסיר את supernatant. השתמש 200 microliters של אצטון קר כקרח לשטוף את הכדור, כדי להסיר פסולת הסלולר.צנטריפוגה המדגם שוב כדי להשיג את המשקעים, ולהסיר את supernatant. כדי להסיר את האצטון הנותר מן הכדורים, לשמור על צינורות microcentrifuge ב ThermoMixer ב 37 מעלות צלזיוס עם המכסים שלהם פתוחים. לאחר מכן להוסיף 100 microliters של 1x הפחתת SDS חוצץ כדי להמיס לחלוטין את הכדור, ולהרתיח את המדגם ב 95 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.מיד לטעון את המדגם על ג'ל polyacrylamide SDS להפרדה, או לאחסן את המדגם במינוס 20 מעלות צלזיוס להמשיך מאוחר יותר. הכן שני ג'לים מפרידים כמתואר בכתב היד של הטקסט. יוצקים את הג'ל בין לוחות הזכוכית באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד, ומבטיחים ששני הסנטימטרים העליונים יהיו חופשיים מהתערובת.מוסיפים 70% אתנול על גבי הג'ל המפריד, ויוצרים ממשק אחיד בין שתי השכבות. לאחר הג'לים המפרידים יש פולימר, להכין את ג'ל הערימה באמצעות הוראות בכתב היד הטקסט. לאחר מכן להסיר את האתנול מן הג'לים המפרידים, ולהוסיף את פתרון ג'ל לערום.בזהירות להכניס מסרק עם מספר הכיסים הרצוי מבלי להציג בועות אוויר, ולאפשר ג'ל פילמור במשך 20 עד 30 דקות. טען ארבעה מיקרוליטרים של כל דגימה, כמו גם סולם החלבון, לבארות נפרדות. לאחר מכן להפעיל את הג'ל ב חוצץ ריצה טריז גליצין ב 144 וולט במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.השתמש בפתרון פיירבנקס מחומם מראש A כדי להכתים את הג'לים על רוקר במשך 30 דקות ופתרון פיירבנקס מחמם מראש D כדי לדכא את הצבע של הג'לים על רוקר עד שהרקע הרצוי מושג. עלייה נצפתה בכמות צבירה של חלבון שנוצר כאשר תאים טופלו עם 175 מיקרוגרם למיליליטר ו 200 מיקרוגרם למיליליטר של מיקרוביאלית, בהשוואה לתאים לא מטופלים. העלייה בשבר החלבון המסיס הייתה בולטת יותר בזן MG1655 הרגיש יותר.נצפתה ירידה בכמות החלבונים המסיסים כאשר תאים טופלו עם 175 מיקרוגרם למיליליטר ו 200 מיקרוגרם למיליליטר של מיקרוביאלית, בהשוואה לתאים לא מטופלים. כאשר מנסים פרוטוקול זה, יש לזכור כי נורמליזציה לצפיפות האופטית ב 600 ננומטר חשוב להשוואה של היקף צבירת החלבון בדגימות.

extraction-visualization-protein-aggregates-after-treatment

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

טיהור זיקה של חלבונים מתויגים בשילוב עם ספקטרומטריית מסה (APMS) היא שיטה רבה עצמה למיפוי השיטתי של רשתות אינטראקצית חלבון ועל חקירת הבסיס המכאני של תהליכים ביולוגיים. כאן, אנו מתארים פפטיד הליך אופטימיזציה רציפת זיקה (SPA) APMS פתח...

זיהוי של קומפלקסי חלבונים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות טיהור זיקת פפטיד סדרתית בשילוב עם טנדם המוני ספקטרומטריית

שיטה לטיהור בקנה מידה גדולה של התחום התאי APP (AICD) מתוארת. גם אנו מתארים שיטה כדי...

טיהור וצבירה של תחום החלבון המבשר עמילואיד התאי

סרטון זה מדגים טכניקת הפרדה מבוססת פוליאקרילאמיד דנטורינג עבור חלבונים. טכניקה זו מסייעת בזיהוי ראשוני של חלבונים על בסיס משקלם המולקולרי.

נתרן דודציל סולפט פוליאקרילאמיד ג'ל אלקטרופורזה לניתוח חלבונים: טכניקה להפריד ולדמיין חלבונים על בסיס משקל מולקולרי

בסרטון זה, אנו מדגימים בדיקת צבירת חלבונים מבוססת תאים באמצעות מעכבי פרוטאזום, אשר חוסמים את פעילות הפרוטאזום, ומונעים מחלבונים מוטנטיים שאינם מקופלים כהלכה, מאוחים לתווית פלואורסצנטית, לעבור פירוק פרוטאזומלי תלוי יוביקוויטין, המוביל להצטברותם בתוך הציטופלסמה של התא. לאחר מכן מדמיינים את צברי החלבונים ומכמתים אותם במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Protein Aggregate Formation Assay: שיטה לזיהוי וכימות צבירת חלבונים בתאים בתרבית עם אינדוקציה על ידי מעכב פרוטאזום

כדי לחקור את הקשר בין הומאוסטזיס חלבון, מתח והזדקנות, עקבנו אחר שינויים בקיפול החלבון על ידי מעקב אחר תפקוד לקוי של חלבון, לוקליזציה של חלבון בתא ויציבות החלבון ברמת האורגניזם, התא והחלבון, תוך שימוש במטזואן Caenorhabditis elegans הניתן לטיפול גנטי כמערכת מודל.

שימוש ב-Caenorhabditis elegans כמערכת מודל לחקר הומאוסטזיס חלבון באורגניזם רב-תאי

גישה יעילה לבדיקות סקר לאיתור הביטוי של חלבונים בממברנה רקומביננטי בcoli Escherichia מבוסס על היתוך לחלבון פלואורסצנטי ירוק מוצגת.

הקרנה ירוקה פלורסנט מבוסס חלבון ביטוי של החלבונים ממברנה ב<em&gt; Coli Escherichia</em

האמבות החברתיות Dictyostelium discoideum הוקמה לאחרונה כמערכת לחקר קיפול שגוי של חלבונים ופרוטאוסטזיס. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה חדשה מבוססת הדמיה לחקר צבירת חלבונים המושרה על ידי טמפרטורה ותגובת הלחץ התאית ב-D. discoideum.

לימוד חלבון מערכת בקרת איכות של<em&gt; D. discoideum</em&gt; שימוש הדמית תא חי בקרת טמפרטורה

ביולוגיה סינתטית מאפשר ההנדסה של חלבונים עם מאפיינים חסרת תקדים באמצעות החדרת חומצות אמינו קאנונית co-translational. . הנה, הצגנו איך spectrally אדום-העביר גרסה של fluorophore GFP-סוג עם מאפייני ספקטרוסקופיות הרומן פלורסצנטיות, הנקרא חלבון פלואורסצנטי "זהב" (GdFP), מופק ב e. coli באמצעות הלחץ הסלקטיבי ההתאגדות (SPI).

הנדסת קרינה פלואורסצנטית 'הזהב' על-ידי הלחץ הסלקטיבי התאגדות של חומצות אמינו קאנונית, אנליזת חלבונים באמצעות ספקטרומטר מסה, קרינה פלואורסצנטית

חלבון צבירת מעורר הסלולר סטרס חמצוני. פרוטוקול זה מתאר שיטה לניטור את המדינות amyloidogenic חלבונים תאיים סטרס חמצוני המשויכים אליהן, באמצעות cytometry זרימה. הגישה משמש כדי ללמוד על אופן הפעולה של גרסאות מסיסים ונוטה צבירת של פפטיד עמילואיד-β.

הערכת ההשפעה של חלבון צבירה על סטרס חמצוני הסלולר ב שמרים

פרוטוקול זה מדגים את פעילות המלווה של חלבון הלם חום 70 (Hsp70). תאי E. coli dnaK756 משמשים כמודל לבדיקה מכיוון שהם מכילים Hsp70 ילידי ולקוי תפקודית, מה שהופך אותם רגישים ללחץ חום. המבוא ההטרולוגי של Hsp70 פונקציונלי מציל את חוסר הצמיחה של התאים.

Escherichia coli -מבוסס בדיקת השלמה לחקר תפקוד המלווה של חלבון הלם חום 70

פרוטוקול זה מתאר שיטת חילוץ והשקעה מהירה וניתנת לשחזור מבוססת ממס אורגני לטיהור פוליפפטיד דמוי אלסטין (ELP) מ-Escherichia coli, ומספק חלופה ניתנת להרחבה פוטנציאלית לשיטות טיהור ELP קונבנציונליות.

טיהור יעיל של פוליפפטידים דמויי אלסטין (ELPs) מ-E. coli באמצעות שיטת חילוץ והשקעה מבוססת ממס אורגני

חקור מיצוי והדמיה של אגרגטים חלבון ב-Escherichia coli לאחר טיפול במתח פרוטאוטוקסי. פרוטוקול זה מאפשר השוואה איכותנית בין זני חיידקים שונים וניתוח השפעת מחיקות גנים ותרכובות פרוטאוטוקסיות.

מיצוי והדמיה של אגרגטים חלבון לאחר טיפול של Escherichia coli עם מתח פרוטאוטוקסי

גלה סרטונים נוספים