Name: שחזור רטינובלסטומה אנושית במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: למד שיטה לשחזור רטינובלסטומה אנושית במבחנה באמצעות תאי גזע עובריים עם מוטציות בגן RB1. פרוטוקול זה מאפשר יצירת קווי תאים לחקר מחלת העין השכיחה בילדות ופיתוח טיפולים חדשים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לצוות 502 על כל העזרה. עבודה זו נתמכת בחלקה על ידי הקרן העירונית למדעי הטבע של בייג'ינג (Z200014) ותוכנית המו"פ הלאומית של סין (2017YFA0105300).

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בית החולים בייג'ינג טונגרן, האוניברסיטה הרפואית קפיטל. H9 hESCs מתקבלים ממכון המחקר WiCell.
1. דור של RB1 מוטציה hESC
<ol><li>וקטור מיקוד CRISPR/Cas9 עבור הנוקאאוט (KO) של RB1.
	<ol><li>תכננו זוג sgRNA. עבור אבלציה של RB1, לכוון את האקסון הראשון של הגן הזה. רצף הפריימר הקדמי הוא CACCGCGGTGGGGCGGGTTTTTCGG, ורצף הפריימר ההפוך הוא AAACCCGAAAAACGGCGCCGC. הערה: עבור מוטציית RB1 הספציפית, נדרשת גם תבנית מתוקנת. בפרוטוקול זה, קו התא RB1-KO משמש כדוגמה.</li>
		<li>יש לעכל 1 מיקרוגרם של pX330-U6-Chimeric BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro עם אנזימי הגבלת BbsI (ראו טבלת חומרים) למשך 30 דקות בטמפרטורה של 37°C על ידי ביצוע הוראות היצרן.</li>
		<li>לטהר את הפלסמידים המעוכלים באמצעות ערכת טיהור על פי הוראות היצרן. הערה: ניתן לנקות תגובות אנזימטיות ישירות ללא ג'ל אגרוז באמצעות ערכת הטיהור (ראו טבלת חומרים).</li>
		<li>זרחן ואנליל כל זוג אוליגוס משתמש בפולינוקלאוטיד קינאז T4 (PNK) (טבלת חומרים) עם התגובה הכוללת 1 μL של אוליגו1 (100 μM), 1 μL של אוליגו2 (100 μM), 1 μL של 10x T4 Ligation Buffer, 6.5 μL של ddH2O, ו 0.5 μL של T4 PNK. הערה: הפריימרים קדימה ואחורה בשלב 1.1.1 הם זוג אוליגוס. זרחן ו anneal אוליגוס ב thermocycler באמצעות הפרמטרים הבאים: 37 °C במשך 30 דקות; 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; עלו ל-25 מעלות צלזיוס ב-5 מעלות צלזיוס לדקה.</li>
		<li>דלל את האוליגוס הזרחני והחישול 200 פעמים על ידי הוספת 1 μL של ריאגנט אוליגו ל-199 μL של מים נטולי נוקלאז בטמפרטורת החדר (RT).</li>
		<li>הגדר את תגובת הקשירה ודגרה ב- RT למשך 10 דקות על ידי ערבוב הדברים הבאים: 50 ננוגרם של פלסמיד מעוכל Bbs1 משלב 1.1.3, 1 μL של דופלקס אוליגו משלב 1.1.5, 5 μL של 2x חיץ ליגציה, 1 μL של ליגאז, ולמעלה עד 10 μL באמצעות מים ללא נוקלאז.</li>
		<li>הפכו את תערובת הקשירה וריצפו את המושבות החיוביות לשלב הבא. הערה: השתמש בפריימר U6 קדימה או אחורה לריצוף.<ol><li>להפשיר את התאים המוכשרים על קרח.</li>
			<li>קח 50 μL של התאים המוסמכים בצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.</li>
			<li>הוסף 1 μL של תערובת קשירת משלב 1.1.6 לתוך התאים המתאימים.</li>
			<li>מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה של הצינור שלוש פעמים. הערה: אין לערבל.</li>
			<li>מניחים את התערובת על קרח למשך 30 דקות.</li>
			<li>הלם חום התערובת ב 42 מעלות צלזיוס במשך 90 שניות.</li>
			<li>יש להוסיף לצינור 950 מיקרוגרם של מרק לוריא-ברטני (LB) בטמפרטורת החדר ללא אנטיביוטיקה.</li>
			<li>מניחים את הצינור בשייקר ב-300 סל"ד ב-37°C למשך 60 דקות.</li>
			<li>חממו את צלחות ה-LB (פפטון, פפטון מקזאין, נתרן כלורי, אגר-אגר ואמפיצילין) ל-37 מעלות צלזיוס מראש.</li>
			<li>מורחים 50-100 μL של התאים ותערובת קשירה על הצלחות ב- RT.</li>
			<li>דגירה של הצלחות למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס.</li>
			<li>לאסוף 12 מושבות מהצלחת ולהעביר אותם למדיום LB עם אמפיצילין. הניחו את המדיום על שייקר ב-300 סל"ד למשך 60 דקות.</li>
			<li>השתמש ב- 1 μL מתמיסת החיידקים (משלב 1.1.7.12) כתבנית עבור PCR ובחר את המושבות החיוביות.</li>
			<li>רצף את המושבות החיוביות על ידי פריימרים U6, להשתמש במושבה עם רצפי sgRNA מתוכנן בשלב הבא.</li>
		</ol></li>
		<li>חלצו את הפלסמיד באמצעות ערכת מידי (ראו טבלת חומרים). הערה: האיכות והכמות של הפלסמיד באמצעות ערכת מיני אינן מספיקות לניסוי הנוקלאופקציה הבא. ערכת מידי או מקסי מתאימה יותר מהמיני קיט.</li>
	</ol></li>
	<li>תרבית HESC ונוקלאופקציה. הערה: חממו את כל הריאגנטים ל-RT.<ol><li>להפשיר 1 x 10 6תאי H9 לתוך צלחת מצופה מראש 6 בארות עם 10 μM Y-27632 (מעכב ROCK) ו 2 מ"ל של מדיום תרבית ncEpic-hiPSC / hESC טרי. הערה: מצפים את צלחת 6 הבארות במטריצת קרום מרתף מופחתת במקדם גדילה של 1% למשך 30 דקות לפחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.</li>
		<li>למחרת, הסר את הסופרנטנט, שטף את התאים עם 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Salline (DPBS), ולאחר מכן הוסף 2 מ"ל של מדיום תרבית ncEpic-hiPSC/hESC טרי.</li>
		<li>החלף את המדיום מדי יום עם 2 מ"ל של תרבית ncEpic-hiPSC/hESC טרי ב-3-5 הימים הבאים עד שהתאים יגדלו למפגש של כ-80%.</li>
		<li>מעבר פעם או פעמיים כדי להתאים את מצב hESC. הערה: הדרך הקלה ביותר לזהות את מצב ה-hESC היא המורפולוגיה.</li>
		<li>תרבית את תאי H9 הלא מובחנים בצלחת של 6 בארות עד שהם מגיעים למפגש של 80%.</li>
		<li>החלף את המדיום שעתיים לפני הגרעין עם 2 מ"ל של מדיום תרבית ncEpic-hiPSC/hESC טרי מעורבב עם 10 מיקרומטר של Y-27632 וצפה מראש באר אחת של צלחת 12 באר באמצעות מטריצת קרום מרתף מופחתת 1% גורם גדילה.</li>
		<li>שאפו את המדיום ושטפו עם 1 מ"ל של DPBS שחומם מראש.</li>
		<li>הסר את ה-DPBS ודגירה עם 1 מ"ל של אנזים דיסוציאציה של תאים (ראו טבלת חומרים) למשך 3.5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>הוסיפו 1 מ"ל של תרבית ncEpic-hiPSC/hESC טרייה לתאים ופיפטה פעמיים כדי להפוך את תאי H9 לתרחיף של תא יחיד.</li>
		<li>הוציאו 100 מיקרוליטר מהתערובת לספירת תאים והעבירו את הנותרים לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל המכיל עוד 2 מ"ל של מדיום תרבית ncEpic-hiPSC/hESC בפנים.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט ושלח כ-2 x 106 תאים לנפח תגובה של 100 μL. על פי פרוטוקול היצרן, לייעל את נפח עבור תאים, פלסמידים, nucleofector, ותנאי תגובה. ראה טבלת חומרים עבור מערכת הגרעין המשמשת בפרוטוקול זה. הערה: בדרך כלל, בועות אינן מותרות במהלך הנוקלאופקציה.</li>
		<li>לאחר הטרנספקציה, להעביר את התאים לצלחת 12-well מצופה מראש, להשלים עם 1.5 מ"ל של ncEpic-hiPSC / hESC תרבית בינוני ו 10 μM של Y-27632, ולאחר מכן תרבית את התאים באינקובטור 37 °C, 5% CO2 .</li>
		<li>שנה את המדיום מדי יום. לאחר 48 שעות, יש להוסיף 2 מיקרוגרם/מ"ל של פורומיצין לבחירת תאים כשבוע. הערה: תאים רבים מתים במהלך 3 הימים הראשונים. התאים הנותרים עשויים להתרבות וליצור מושבות בשבוע שלאחר מכן לאחר בחירת הפורומיצין. בשבוע הבחירה, ודא כי המדיום תמיד מכיל 2 מיקרוגרם / מ"ל של puromycin.</li>
		<li>בחר את המושבות באופן ידני תחת מיקרוסקופ. הערה: המורפולוגיה של המושבה זהה למושבת hES. חותכים את המושבות לחתיכות (2-6 חתיכות למושבה) עם קצה פיפטה לבן/רגיל של 10 μL במדיום ומעבירים מושבה אחת לבאר אחת מצופה מראש של צלחת בת 12 בארות.</li>
		<li>ראשית, זהה את המוטציות של RB1 ואת המצבים מחוץ למטרה (טבלה 1), ולאחר מכן פלוריפוטנטיות כדי לאפיין את קו התאים H9 של הנוקאאוט RB1 . הערה: זהה את המוטציות של RB1 ואת המצבים מחוץ למטרה באמצעות ריצוף PCR וסנגר. זהה את סמני הפלוריפוטנטיות על ידי RT-PCR ואימונופלואורסצנציה.</li>
	</ol></li>
</ol>2. דור של רטינובלסטומה אנושית
<ol><li>תחזוקה של RB1-KO hESC.<ol><li>תרבית את תאי H9 שעברו עריכה גנטית בגורם גדילה מופחתת מטריצת קרום המרתף המצופה בצלחת 6 בארות עם 2 מ"ל של מדיום תרבית ncEpic-hiPSC/hESC ושינוי המדיום מדי יום.</li>
		<li>מעבר באמצעות מאגר EDTA למשך 3.5 דקות ב-37 מעלות צלזיוס או 5 דקות ב-RT. הערה: חיץ EDTA הוא תערובת של 1x DPBS, 5 mM EDTA ו-0.9 מ"ג/מ"ל של NaCl.</li>
	</ol></li>
	<li>התמיינות תאי הרשתית. הערה: הכן את מדיום I לפני ההבחנה. כדי להכין את מדיום I, יש לערבב 24.5 מ"ל של תערובת הנשר המהונדס (DMEM)/תערובת החומרים המזינים F-12(F12)-גלוטמין (1x), 24.5 מ"ל של המדיום הבסיסי העצבי, 250 μL של תוסף A פי 100, 500 μL של תוסף B פי 50, 0.1 mM ß-mercaptoethanol, ו-250 μL של 100x L-גלוטמין. יש לחמם את כל התערובות ל-RT לפני השימוש.<ol><li>הגדל את RB1-KO hESC למפגש של 80% בבאר אחת של צלחת 6 בארות.</li>
		<li>הסר את המדיום ושטוף את התאים עם 1 מ"ל של 1x DPBS.</li>
		<li>הרם את מושבות התאים באמצעות 1 מ"ל של חיץ דיספאזי (ראו טבלת חומרים) למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הערה: בדוק את מושבות התאים תחת מיקרוסקופ. בדרך כלל, זה לוקח 5 דקות עבור קצה המושבות להתגלגל החוצה.</li>
		<li>שאפו את חיץ הפסולת ושטפו בעדינות את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל של DPBS אחד.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של בינוני I לתוך הבאר.</li>
		<li>חותכים את המושבות לחתיכות (6-9 חתיכות למושבה) עם קצה פיפטה לבן / רגיל של 10 μL במדיום. הערה: באופן כללי, כ-60%-70% מהתאים מתנתקים מהבאר. השתמש במגרד תאים כדי לגרד את התאים הנותרים במדיום.</li>
		<li>קציר כל התאים על ידי צנטריפוגה בצינור 15 מ"ל ב 200 x גרם במשך 5 דקות.</li>
		<li>השאירו כ-50 μL של הסופר-נאטנט כדי לפזר את התאים בתווך, ולאחר מכן ערבבו את התאים עם מטריצת קרום מרתף מופחתת של פקטור גדילה על ידי תסיסה עדינה. הערה: יש לשמור את מטריצת קרום המרתף המופחתת של גורם הגדילה בטמפרטורה של 4°C או על הקרח לפני השימוש. אם הוא מצוטט ומאוחסן ב-20°C-, הנח אותו ב-4 °C למשך הלילה או לפחות שעה אחת לפני השימוש.</li>
		<li>שמור את צינור 15 מ"ל עם התאים המרחפים לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הערה: ודא שהתאים ומטריצת קרום המרתף המופחתת של גורם הגדילה יוצרים ג'ל מוצק.</li>
		<li>הוסף 1 מ"ל של Medium I לתוך צינור 15 מ"ל, ולאחר מכן פיפט קלות את הג'ל מוצק פעמיים עד שלוש פעמים כדי לפזר את הגוש עם פיפטה 1 מ"ל.</li>
		<li>הוסיפו 9 מ"ל של Medium I והעבירו את מתלה התאים לצלחת תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ.</li>
		<li>מעבירים את המנה לחממה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 ומגדירים את היום כיום 0.</li>
		<li>בחנו את התאים באמצעות מיקרוסקופ ביום הראשון. הערה: ניתן היה לראות אלפי ציסטות חלולות בצלחת. בממוצע, 3 עד 4 ציסטות הם נצפו חתיכה אחת של ג'ל.</li>
		<li>שנה את המדיום ביום 5. לאסוף את supernatant לתוך צינור 15 מ"ל, לחכות ציסטות לשקוע לתחתית, ולאחר מכן להסיר את המדיום ולהחליף אותו עם Medium I טרי. הערה: אם המדיום הופך לצהוב ביום 4, שנה את המדיום ביום 4, אחרת ביום 5. הוסיפו 10 מ"ל של מדיום I טרי למנה המקורית. מאות ציסטות כבר נקשרו למשטח התרבית; לשמור אותם שם.</li>
		<li>מפזרים את הציסטות בצינור לשני כלים של 10 ס"מ. הערה: ודא שלפחות 300 ציסטות נמצאות בצלחת. אם הציסטות אינן מפגשות, אין להפריד את הציסטות למנות אחרות; החזירו אותם למנה המקורית בקוטר 10 ס"מ.</li>
		<li>ביום השביעי, רוב הציסטות (מעל 95%) נצמדות לצלחת, מתפזרות ויוצרות מושבות דבקות. הערה: כבר ביום השלישי ניתן לצפות במושבות החסידות.</li>
		<li>ביום 10, החליפו את המדיום במדיום טרי I. וודאו שכל הציסטות מחוברות למנה.</li>
		<li>יש להכין את Medium II לפני השלב הבא על-ידי ערבוב: 36 מ"ל של DMEM, 12 מ"ל של F12, 2% של תוסף B (v/v), 0.1 mM MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA).</li>
		<li>ודא שהתאים מפוזרים לפי יום 13-17. בצע את השלב הבא ביום 15 כאשר התאים מפוזרים אך לא מתקשרים עם המושבות השכנות.</li>
		<li>שטפו את התאים פעם אחת עם 1 מ"ל של DPBS והוסיפו 1 מ"ל של תמיסה פנויה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. הערה: תוך 5 דקות, קצה התאים מתרומם.</li>
		<li>הסר את מאגר dispase ולשטוף בעדינות את התרביות עם 1 מ"ל של 1x DPBS.</li>
		<li>הוסף 10 מ"ל של בינוני II לכל צלחת ותרבית של 10 ס"מ בחממה של 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 .</li>
		<li>התרביות הדבקות מתנתקות באופן ספונטני לאחר 24 שעות ומתכנסות לאורגנואידים ברשתית. הערה: תאים רבים שאינם יוצרים את האורגנואידים ימותו ביומיים הבאים.</li>
		<li>שלושה ימים לאחר הניתוק, אספו את התאים מצלחת תרבית התאים ואפשרו לאורגנואידים להתיישב בצינור של 15 מ"ל.</li>
		<li>מוציאים את הסופרנטנט מהצינור ומעבירים את האורגנואידים לצלחת חדשה שאינה דבקה (צלחת פטרי) עם 10 מ"ל של Medium II למשך ארבעת הימים הבאים.</li>
		<li>יש להכין את Medium III על-ידי ערבוב DMEM: F12 ביחס של 3:1 (v/v), תוסף B (v/v) של 2%, תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות של 0.1 mM MEM (NEAA), סרום בקר עוברי (FBS) (v/v), 100 מיקרומטר טאורין ו-2 mM גלוטמין.</li>
		<li>שבוע לאחר הניתוק, שנה את המדיום למדיום III.</li>
		<li>מיום זה ואילך, תרבו את האורגנואידים במדיום III ורעננו את המדיום פעמיים בשבוע.</li>
	</ol></li>
	<li>הקמת קו תא RB. הערה: כל הריאגנטים מחוממים מראש ב-RT.<ol><li>ביום ה-90, ה-RBs (80%-90%) מקיפים את האורגנואידים ברשתית. לכן, בחר את האורגנואידים RB 90 יום עבור הדור של קו התאים RB.</li>
		<li>הכן את המדיום 1640 על ידי ערבוב מכון הזיכרון של רוזוול פארק (RPMI)-1640 בינוני עם 10% FBS.</li>
		<li>חותכים את ה-RB לחתיכות (20-25 חתיכות ל-RB) בעזרת סכין מיקרו-כירורגית מתחת למיקרוסקופ במדיום RPMI-1640.</li>
		<li>הסר את המדיום RPMI-1640 וטפל בחלקים עם 0.25% טריפסין / EDTA במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>הוסף את מדיום RPMI-1640 כדי לסיים את התגובה והצנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות.</li>
		<li>הסר את הסופרנטנט והושיע מחדש את התאים במדיום 1640 בצלחת שאינה דבקה.</li>
		<li>קו תאי RB הוא תרבית צפה. שנה את המדיום פעמיים בשבוע ועבר את תאי ה- RB תוך שבועיים. הערה: קצב ההתרבות של תאי RB ראשוניים הוא איטי למדי.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+organoid+retinoblastoma+reveals+a+cancerous+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).</li>
<li>Singh, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage-specific+proliferation+and+retinoblastoma+genesis+in+RB-deficient+human+but+not+mouse+cone+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 9391-9400 (2018).</li>
<li>Xu, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb+suppresses+human+cone-precursor-derived+retinoblastoma+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rb suppresses human cone-precursor-derived retinoblastoma tumours.</a> Nature. 514 (7522), 385-388 (2014).</li>
<li>Mendoza, P. R., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">The biology of retinoblastoma.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 503-516 (2015).</li>
<li>Benavente, C. A., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+epigenetics+of+human+retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Genetics and epigenetics of human retinoblastoma.</a> Annual Review of Pathology. 10, 547-562 (2015).</li>
<li>Wu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+MYCN-driven+retinoblastoma+reveals+MYCN-independent+tumor+reemergence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A mouse model of MYCN-driven retinoblastoma reveals MYCN-independent tumor reemergence.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (3), 888-898 (2017).</li>
<li>Boucherie, C., Sowden, J. C., Ali, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology+for+generating+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors.</a> Regenerative Medicine. 6 (4), 469-479 (2011).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+adhesion-dependent+cell+survival+and+rock-regulated+actomyosin-driven+forces+mediate+self-formation+of+a+retinal+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Intercellular adhesion-dependent cell survival and rock-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid.</a> Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).</li>
<li>Zheng, C., Schneider, J. W., Hsieh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+RB1+in+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of RB1 in human embryonic stem cell-derived retinal organoids.</a> Developmental Biology. 462 (2), 197-207 (2020).</li>
<li>Dimaras, H., Corson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma%2C+the+visible+CNS+tumor%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma, the visible CNS tumor: A review.</a> Journal of Neuroscience Research. 97 (1), 29-44 (2019).</li>
<li>Xu, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma+has+properties+of+a+cone+precursor+tumor+and+depends+upon+cone-specific+MDM2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma has properties of a cone precursor tumor and depends upon cone-specific MDM2 signaling.</a> Cell. 137 (6), 1018-1031 (2009).</li>
<li>Qi, D. L., Cobrinik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDM2+but+not+MDM4+promotes+retinoblastoma+cell+proliferation+through+p53-independent+regulation+of+MYCN+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MDM2 but not MDM4 promotes retinoblastoma cell proliferation through p53-independent regulation of MYCN translation.</a> Oncogene. 36 (13), 1760-1769 (2017).</li>
</ol>

למחברים לא ידוע על זיקות, חברות, מימון או אחזקות כספיות שעשויים להשפיע על האובייקטיביות של מחקר זה.

רטינובלסטומה אנושית (RB) נגרמת על ידי השבתה של RB1 ותפקוד לקוי של חלבון Rb. בפרוטוקול זה, RB1-KO hESC הוא השלב המרכזי ליצירת RB בצלחת. בעוד שאפילו עם RB1-/- hESC, ייתכן שאין היווצרות RB עקב השיטות של הבחנה אורגנואידית ברשתית10. בפרוטוקול זה, המעבר מתרבות דבק לתרבות צפה הוא חיוני בתהליך ההבחנה. צפיפות הציסטות, סוגי תאי הגזע הפלוריפוטנטיים וקצב ההתרבות הם כל המשתנים שישפיעו על תזמון הניתוק. רצוי לנתק את התאים כאשר הם מורחבים אך לא מתקשרים על ידי מושבות שכנות<sup...

רטינובלסטומה אנושית (RB) היא גידול נדיר וקטלני שמקורו במבשרי חרוט הרשתית 1,2,3, הוא הסוג הנפוץ ביותר של ממאירות תוך עינית בילדות 4. השתקה הומוזיגוטית של הגן RB1 היא הנגע הגנטי היוזם ב- RB5. עם זאת, עכברים עם מוטציות RB1 לא מצליחים ליצור את הגידול ברשתית2. למרות שגידולי העכברים יכולים להיווצר עם שילוב של מוטציות Rb1 ושינויים גנטיים אחרים, הם עדיין חסרים את התכונות של RB6 אנושי. הודות לפיתוח של התמיינות אורגנואידית ברשתית, ניתן היה להשיג את ה- RB שמקורו ב- hESC, המציג את הדמויות של RB1 אנושי.
פרוטוקולים רבים להבחנה אורגנואידית ברשתית נקבעו בעשור האחרון, כולל 2D7, 3D8, ושילוב של 2D ו- 3D9. השיטה המשמשת כאן ליצירת RB האנושי היא איחוד של תרבות דבק ותרבות צפה9. על ידי הבחנה בין ה-hESC שעבר מוטציה ב-RB1 לאורגנואידים ברשתית, היווצרות ה-RB מתגלה בסביבות היום ה-45, ואז היא מתפשטת במהירות בסביבות היום ה-60. ביום 90, בידוד של RBs, ויצירת קו התאים RB אפשרי; יתר על כן, RB מקיף כמעט את כל האורגנואידים ברשתית ביום 120.
RB שמקורו ב-hESC הוא מודל חדשני לחקר המקור, הגידול והטיפולים ב-RB. בפרוטוקול זה, הדור של עריכת גנים hESC, ההבחנה של RB, ואפיון עבור RB מתוארים בפירוט.

<table><tbody><tr><td>2-מרקפטואתנול</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>אנטי-ARR3</td><td>סיגמא</td><td>HPA063129</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>נגד CRX (M02)</td><td>Abnove</td><td>ABN-H00001406-M02</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>נגד Ki67</td><td>Abcam</td><td>&nbsp; ab15580</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>אנטי-Syk (D3Z1E)</td> <td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>13198</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>BbsI</td><td>NEB</td><td>R3539S</td><td>אנזימי הגבלה</td></tr><tr><td>Dispase (1U/mL)</td> <td>טכנולוגיות תאי גזע</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>DMEM בסיסי</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12-GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C141905005BT</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS), מוסמך לתאי גזע עובריים אנושיים</td><td>התעשייה הביולוגית</td><td>04-002-1A</td><td></td></tr><tr><td>גלוטמין</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>תערובת התזונה F-12 של חזיר (Hams F12)</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות (100X)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>נוירובזאלי בינוני</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>P3 תא ראשוני 4D-Nucleofector X Kit S</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td>ערכת נוקלאופקציה</td></tr><tr><td>עט Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>פעולת גן</td><td>Puromycin</td><td>ISY1130- 0025MG</td><td></td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR QIAquick</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>ncEpic-hiPSC/hESC מדיום תרבית</td><td>Nuwacell</td><td>RP01001</td><td>ncמדיום תרבית Epic-hiPSC/hESC ב-1.2.1</td></tr><tr><td>גורם גדילה מופחת מטריצת קרום הבסיס</td><td>BD</td><td>356231</td><td>Matrigel ב-1.2.1</td></tr><tr><td>אנזים דיסוציאציה של תאים</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>TrypLE Express ב-1.2.8</td></tr><tr><td>RNeasy Midi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>75144</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>תוסף A</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td>N-2 תוסף (100X), נוזלי, גמיש במדום I</td></tr><tr><td>תוסף B</td><td>Life Technologies</td><td>17105-041</td><td>תוסף B-27 (50X), נוזלי, גמיש במדום I,II,III</td></tr><tr><td>T4 פולינוקלאוטיד קינאז</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>EK0032</td><td></td></tr><tr><td>טאורין</td><td>סיגמא</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 2HCl</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>pX330-U6- כימרי BB-CBh-hSpCas9-2A-Puro</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 4D</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R0883-500ML</td><td></td></tr></tbody></table>

שחזור רטינובלסטומה אנושית במבחנה

Reconstruct Human Retinoblastoma In Vitro

RB אנושי הוא סרטן ילדים, שהוא קטלני אם לא ניתן טיפול. מכיוון שמקורו של RB במבשרי חרוטים, דבר נדיר יחסית במודלים של מכרסמים, בינתיים לגבי ההבדלים הבין-מיניים בין בני אדם למכרסמים, מודל מחלה שמקורו בבני אדם מועיל יותר לחשיפת המנגנונים של RB אנושי ולחיפוש אחר מטרות הטיפול. כאן, הפרוטוקול מתאר יצירת שני קווי hESC שעברו עריכה גנטית עם מוטציה דו-אלילית של נקודת RB1 (RB1 Mut/Mut) ומוטציית נוקאאוט RB1 (RB1-/-), בהתאמה. במהלך תהליך התפתחות הרשתית, היווצרות של RB הוא ציין. קווי תאי RB נקבעים גם על ידי הפרדה מהאורגנואידים של RB. בסך הכל, על ידי הבחנה בין קווי hESC שעברו עריכה גנטית לאורגנואידים ברשתית באמצעות פרוטוקול התמיינות משולב דו-ממדי ותלת-ממדי, הצלחנו לשחזר את ה-RB האנושי בצלחת ולזהות את מקורו החרוט המבשר. הוא יספק מודל מחלה מועיל להתבוננות בראשית הרטינובלסטומה, התפשטותה וצמיחתה, כמו גם פיתוח נוסף של חומרים טיפוליים חדשניים.

הפרוצדורה של יצירת RB מובהרת באיור 1, המשלב את התרבות הדבק והתרבית הצפה. ניתן היה לקצור את ה-RB האנושי מ-RB1-KO hESC, ולקבל את קו תאי ה-RB על ידי בידוד האורגנואידים של RB.
כאן, הפרוטוקול מספק את פרטי ההבחנה בשלבים שונים (איור 2). כדורים חלולים נוצרים בשלושת הימים הראשונים שמתחברים לפני השטח של התרבית ואז מתרחבים (איור 2A-E). מהיום ה-15 ואילך, התאים מוגבהים ומתרבים בתרחיף (<strong...

אנו מתארים שיטה ליצירת רטינובלסטומה אנושית (RB) על ידי החדרת מוטציות RB1 ביאליליות בתאי גזע עובריים אנושיים (hESC). קווי תאי RB יכולים גם להיות בתרבית בהצלחה באמצעות RB מבודד בצלחת.

Human RB is pediatric cancer, which is lethal if no treatment is administered. As RB originates from cone precursors, which is relatively rare in rodent ...

רטינובלסטומה אנושית היא הסוג הנפוץ ביותר של סרטן תוך עיני בילדות. קשה להשיג דגימות קליניות ומודלים של עכברים אינם יכולים ליצור רטינובלסטומה. לכן, יצירת רטינובלסטומה במבחנה חיונית להתבוננות ביצירת רטינובלסטומה, שגשוגה וצמיחתה, ולפיתוח חומרים טיפוליים חדשניים.היעילות של פרוטוקול זה יכולה להגיע לכ-100% אם כי משך הזמן ליצירת רטינובלסטומה משתנה מיום 45 ליום 120. לצורך תחזוקה של רטינובלסטומה אחת או RB נוקאאוט אחד של תאי גזע עובריים אנושיים, תרבית הגן ערך את H תשעה תאים בצלחת שש באר מצופה במטריצת קרום מרתף מופחתת גורם גדילה ושינוי המדיום מדי יום. כדי להעביר את התאים, לדגור אותם במאגר EDTA במשך 3.5 דקות ב 37 מעלות צלזיוס או חמש דקות בטמפרטורת החדר.תרבית את התאים עד שהם מגיעים למפגש של 80%. לאחר מכן, כדי ליזום התמיינות תאי הרשתית, להסיר את המדיום ולשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של DPBS. לאחר מכן, העלו את מושבות התאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של חיץ Dispase ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות.התבונן במושבות התאים תחת מיקרוסקופ. ברגע שהקצוות של המושבות מתחילים להתגלגל החוצה, לשאוף את חיץ Dispase בעדינות לשטוף את התאים פעם אחת עם מיליליטר אחד של DPBS. לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של אחד בינוני לתוך הבאר באמצעות קצה פיפטה סטנדרטי של 10 מיקרוליטר, חותכים את המושבות לחתיכות.השתמש במגרד תאים כדי לגרד את התאים הנותרים במדיום. קציר התאים על ידי צנטריפוגה בצינור 15 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה, השאירו כ-50 מיקרוליטרים של הסופר-נטנט כדי לפזר את התאים בתווך.לאחר מכן מוסיפים 250 מיקרוליטרים של מטריצת קרום מרתף מופחתת גורם גדילה ומערבבים על ידי תסיסה עדינה. לאחר ערבוב, מניחים את צינור 15 מיליליטר עם התאים המרחפים לתוך אינקובטור 37 מעלות צלזיוס. לאחר דגירה של 20 דקות, התאים ומטריצת קרום המרתף המופחתת של גורם הגדילה צריכים ליצור ג'ל מוצק.לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של אחד בינוני לצינור 15 מיליליטר. באמצעות פיפטה של מיליליטר אחד, פיפטה את הג'ל המתמצק פעמיים עד שלוש פעמים כדי לפזר את הגוש. לאחר מכן מוסיפים עוד תשעה מיליליטר של בינוני אחד ומעבירים את מתלה התא לתוך צלחת תרבית תאים של 10 סנטימטרים.לדגור על המנה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. זה נחשב יום אפס. ביום הראשון, בחנו את התאים באמצעות מיקרוסקופ.בממוצע, שלוש עד ארבע ציסטות נצפות בחתיכה אחת של ג'ל. ביום החמישי, לשנות את המדיום על ידי איסוף supernatant לתוך צינור 15 מיליליטר, המאפשר ציסטות להתיישב בתחתית ולהחליף את supernatant עם אחד בינוני טרי. מפזרים את הציסטות בצינור לשני כלים של 10 סנטימטרים, ומבטיחים לפחות 300 ציסטות בכל מנה.ביום השביעי, רוב הציסטות המחוברות לצלחת מתפשטות ויוצרות מושבות דבקות. ביום 10, לשנות את המדיום עם אחד בינוני טרי, להבטיח כי כל ציסטות להישאר מחובר המנה. התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ מימים 13 עד 17 כדי לוודא שהתאים מתפשטים.ביום 15, לאחר שטיפת התאים פעם אחת עם מיליליטר אחד של DPBS, להוסיף מיליליטר אחד של תמיסת Dispase לדגור ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר חמש דקות, הסר את חיץ Dispase ולשטוף בעדינות את התרביות עם מיליליטר אחד של DPBS. לאחר מכן מוסיפים 10 מיליליטר של בינוני שניים לכל צלחת 10 ס"מ ודוגרים בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני.לאחר 24 שעות, תרבויות דבקות מתנתקות באופן ספונטני ומתכנסות לאורגנואידים ברשתית. שלושה ימים לאחר הניתוק, לאסוף את התאים מן צלחת תרבית התאים בצינור 15 מיליליטר. כאשר האורגנואידים מתיישבים, מוציאים את הסופרנאטנט מהצינור ומעבירים את האורגנואידים לצלחת פטרי חדשה שאינה דבקה עם 10 מיליליטר של בינוני שתיים במשך ארבעת הימים הבאים.שבוע לאחר הניתוק, החליפו את המדיום למדיום לבינוני שלוש ומהיום ואילך, תרבו את האורגנואידים בבינוני שלוש. ביום ה-27 של תרבות האורגנואיד ברשתית, ארכיטקטורת השלפוחית האופטית ניכרת וכ-90% מהאורגנואידים מציגים מבנה זה. הגילוי הראשון של רטינובלסטומה מתרחש ביום 45 והוא הופך מוחשי ביום 50.כאשר הוא גדל עד יום 90, מבני השלפוחית האופטית מקופלים בעיקר על ידי רטינובלסטומה. כיום ניתן לבודד את הרטינובלסטומה ולתרגם אותה בתרבית נוספת כקו תאים. ביום ה-105, יותר מ-80% מהאורגנואידים ברשתית עטופים במלואם ברטינובלסטומה.אורגנואידים אלה מבטאים מאוד את סמן ההתפשטות Ki67 ואת סמן האונקוגן SYK בהשוואה לאורגנואידים ברשתית שמקורם ב-H, מה שמעיד על גידולים סרטניים. בנוסף, ביטוי גבוה של סמן מבשר החרוט ARR3 וסמן מבשר הפוטורצפטור CRX באורגנואידים של רטינובלסטומה מדגים כי מקורם בתאים מבשרי חרוט. תוצאות נחותות ומעולות במהלך שלושת השלבים המורפולוגיים של יצירת רטינובלסטומה מתוארות כאן.ניתן להבחין בקלות בין תאי גזע עובריים אנושיים מובחנים ובלתי מובחנים על סמך המורפולוגיה שלהם. התאים הלא מובחנים נבחרים להיווצרות רטינובלסטומה. ביום החמישי, הכדור שנוצר צריך להיות חלול ולא מוצק.הרטינובלסטומה נגזרת מהאורגנואידים ברשתית המציגים ארכיטקטורת שלפוחית אופטית. לא נוצרת רטינובלסטומה מהאורגנואידים הנחותים. בעת ביצוע ההליך, כל הטיפים צריכים להיות מקוררים ואת מטריצת קרום המרתף צריך להיות מומס בארבע מעלות לפני הוספת אותו לתוך הצינור.זהו שלב מפתח בפרוטוקול בידול זה.

reconstruct-human-retinoblastoma-in-vitro

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

השיטה מתוארת להפיץ גידולים אנושיים בעכברים רטינובלסטומה. תאים סרטניים הם מוזרק ישירות לתוך עיניו של עכברים חסר החיסונית. גידולים משניים הוקמו בהצלחה הן באמצעות תאים שנקטפו ישירות גידולים אנושיים tumorspheres תרבותי.

הקמה התפשטות של גידולים רטינובלסטומה האדם עכברים החיסון לקויה

רשתית עצבית של עכבר בגילים 8 ימים היא על גבי בלוק ג'לטין 4%. לאחר הבידוד של שכבת קולטי האור (200 מיקרומטר) על ידי vibratome, הקולטניים האור הם זורעים לאחר ניתוק מכאני והאנזימטית לתרבות. שכבת קולטי האור יכולה לשמש ל, ניתוחים ביוכימיים מולקולריים או השתלה.

Vibratome חתך רשתית העכבר להכין תרבויות קולטי אור

פרוטוקול זה מתאר שיטה לנתח, ניסוי לתפעל וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. תרבויות explant הן שימושיות כאשר שיעור הצלחה גבוהה, יעילות ושחזור יש צורך לבדוק את ההשפעות של פלסמידים לelectroporation ו / או חומרים מגיב, כלומר, מעכבים האנזימטית.

Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב

תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית יכול לשמש כטיפול חלופי תא עבור הטופס מתקדם של ניוון מקולרי הקשור לגיל יבש. פרוטוקול זה מתאר את הדור של מודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית והשתלות את subretinal של תאי אפיתל כנגד האדם מתחלקים נגזר תאי הפיגמנט ברשתית לתוך מודל זה של המחלה.

השתלת subretinal של תאי גזע עובריים אנושיים לתאי האפיתל של פיגמנט הרשתית נגזר למודל גדול-עיניים של אטרופיה גיאוגרפית

אנו מתארים שיטה להנדס רקמת רשתית מורכב של תאים אפיתל הפיגמנט ברשתית שמקורם בתאי גזע pluripotent אנושית ותרבותית על גבי קרום מי השפיר האנושי והכנה שלו הרכבה במודלים של בעלי חיים.

הנדסת רקמות אפיתל הפיגמנט ברשתית השתלת-מתאים נגזר תאי גזע עובריים

אנו מציגים מודל במבחנה כדי להעריך חוש הריח ensheathing גליה (OEG) יכולת נוירו-רגנרטיבית, לאחר פגיעה עצבית. הוא מבוסס על קוקולטורה של נוירונים גנגליון רשתית למבוגרים אקסוטומיים (RGN) על מונוליירים OEG ומחקר עוקב של התחדשות אקסון, על ידי ניתוח סמנים אקסונליים וסמטודנדריטיים RGN.

Coculture של נוירונים רשתית עכברוש אקסוטומי עם חוש הריח Ensheathing גליה, כמודל במבחנה של התחדשות אקסון למבוגרים

מחקר זה נועד לפתח מודל תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית חדשנית (HORC) המונעת פגיעה בשלמות הרשתית במהלך טיפול בהסבר. זה מושגת על ידי פולחן הרשתית עם הזגוזית יתר על המידה ואת אפיתל הפיגמנט ברשתית הבסיסית-choroid (RPE-choroid) ו sclera.

אפיון טכניקה חדשנית של תרבות רשתית אורגניוטיפית אנושית

באמצעות שיטת התארגנות עצמית, אנו מפתחים פרוטוקול עם תוספת של COCO שיכול להגדיל באופן משמעותי את יצירת הפוטורצפטורים.

אינדוקציה מכוונת של אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

הפרימט הלא אנושי (NHP) הוא מודל אידיאלי לחקר טיפולי תאי רשתית אנושית בשל הדמיון האנטומי והגנטי. כתב יד זה מתאר שיטה להשתלה תת-עינית של תאי אפיתל פיגמנט רשתית בעין NHP ואסטרטגיות למניעת סיבוכים תוך ניתוחיים הקשורים למניפולציה מקולרית.

השתלת אפיתל פיגמנט רשתית במודל פרימטים לא אנושי למחלות רשתית ניוונית

ההומור המימי הוא ביופסיה נוזלית בעלת תפוקה גבוהה לרטינובלסטומה, סרטן תוך עיני שלא ניתן לבצע ביופסיה in vivo בשל הסיכון להתפשטות חוץ-עינית. כאן מוצגת שיטה למיצוי בטוח של הומור מימי באמצעות פרצנטזיס קרנית שקוף ושלבים לניתוח גנומי לזיהוי סמנים ביולוגיים פרוגנוסטיים.

הומור מימי כביופסיה נוזלית לרטינובלסטומה: פרצנטזיס קרנית שקופה וניתוח גנומי

למד שיטה לשחזור רטינובלסטומה אנושית במבחנה באמצעות תאי גזע עובריים עם מוטציות בגן RB1. פרוטוקול זה מאפשר יצירת קווי תאים לחקר מחלת העין השכיחה בילדות ופיתוח טיפולים חדשים.

שחזור רטינובלסטומה אנושית במבחנה

גלה סרטונים נוספים