יישום הפרעות CRISPR (CRISPRi) להשתקת גנים במינים פתוגניים של לפטוספירה

שמי ג'רלט נלי, ואני חלק מצוות המחקר כאן במרכז הלאומי למחלות בעלי חיים באיימס, איווה, ואנחנו עובדים על לפטוספירוזיס. לפטוספירוזיס היא מחלה מוזנחת. זו מחלה עולמית.

ובאמת, יש לנו הבנה מוגבלת מאוד של איך קבוצה ייחודית זו של חיידקים לגרום לזיהום. אז המצגת של היום היא על מתן סקירה כללית של כלי חדש זמין כדי להקל על הערכה של מנגנונים פתוגניים של לפטוספירוזיס על ידי השתקת גנים ספציפיים במפורש לידי ביטוי על ידי לפטוספירה, באמצעות טכניקה הנקראת הפרעות CRISPR. עם זאת, היכולת לבחור מושבות ניוטון תלויה מאוד במתן מדיה הצמיחה הטובה ביותר עבור לפטוספירות בררניות אלה.

אז קודם כל, אנחנו הולכים להכיר לכם את ריק הורנסבי, שהציג בקצרה מדיה חדשה כדי להפיץ את החיידקים הערמומיים האלה. ואז נכיר לכם את לואיס פרננדז, שידבר על מתודולוגיית ההפרעה CRISPR להשתיק גנים ממוקדים בתוך לפטוספירה. היי, אני ריק הורנסבי.

מאז זיהוים על ידי Anada לפני למעלה מ -100 שנה, לפטוספירות בדרך כלל היו מבודדות ומופצות ב -29 מעלות צלזיוס, טמפרטורה המשקפת לא את הסביבה ולא את טמפרטורת הגוף המארח של היונקים. לפני 10 שנים, USDA ERS החל לחקור שיפורים על מדיה לפטוספירה ומתוך המחקר הזה, הורנסבי-Alt-Nally מדיה פותחה. באמצעות מדיה זו, רופאים וחוקרים הצליחו לבודד ולהפיץ במהירות רבה יותר לפטוספירות ממקרי שדה ובמחקר במבחנה בטמפרטורה ובסביבה המחקה באופן הדוק יותר את פונדק היונקים.

אנו ממשיכים לייעל את המדיה הזו, אך כפי שהיא עומדת, HAN הוכיחה פוטנציאל לשפר באופן משמעותי בידודים קליניים וטרינריים ואנושיים במחקר חוץ גופי ופיתוח חיסונים יעילות יותר למניעת לפטוספירוזיס. היי, אני לואיס פרננדז. עד כה, הפתוגנזה של לפטוספירוזיס נשארה נחקרה, בעיקר בשל היעדר יעיל וקל לביצוע צינורות גנטיים.

כאן נתאר טכניקה חדשה שנקראת הפרעות CRISPR או CRISPRi. והטכניקה הזו פשוטה מאוד כי אנחנו צריכים לבטא רק שני מרכיבים, חלבון מחייב דנ"א אחד שנקרא Cas9 מת, או dCas9, ומולקולת RNA כימרית שנקראת RNA בעל מדריך יחיד. וה-dCas9 המורכב וה-RNA המנחה יהפכו את זיווג הבסיס לגן המטרה שלנו ולכן יפחיתו או אפילו יחסום את שעתוק.

כמו כן, באמצעות התקשורת החדשה של HAN שתוארה, נוכל להקטין באופן דרסטי את זמן היווצרות המושבה להחלמה מוטנטית. השלב הראשון הוא הגדרת הפרוטו-ספייסבר שייכלל ב-RNA של המדריך. רצף זה כולל 20 נוקלאוטידים שיגדירו את זיווג הבסיס ליעדי הגנים הרצויים.

שלח רצף נוקלאוטיד לשרת האינטרנט CHOPCHOP, עם פרמטרים המוגדרים עבור פיגנס סטרפטוקוקוס, Cas9 ומוטיב סמוך protospacer, NGG. בהתבסס על התוצאות, בחר protospacers עם הציונים הטובים ביותר בתוך מגמת המינוס. מוטיב NGG לא ייכלל ברצף הסופי.

השתמשנו במקדם lipL32 להבעת הרנ"א בעל המדריך הבודד, שיכיל את המשתנה 20 נוקלאוטידים בחמישה פריים בפיגום dCas9 שמור. לאחר קבלת הקלטת היא יורדת ל-PMaOri. dCas9 plasmid באתר ההגבלה של חג המולד1.

עבור הטיות תאי לפטוספירה גדלים ב 29 או 37 מעלות צלזיוס במדיה HAN. יום אחד לפני ההטיה, תאים שוורים תורם גדלים מדיה LB בתוספת חומצה diaminopimelic, DAP, ו spectinomycin. לאחר מכן, ביום ההטיות גריל את תרבויות E.coli הרווי ב LB בתוספת DAP.

בתוך מכסה מנוע בטיחות ביולוגי, הרכיב את מנגנון הסינון על ידי הצבת מסנן הממברנה על גבי בסיס הזכוכית, ואחריו משפך זכוכית 15 ML. שני החלקים מוחזקים יחד על ידי מהדק האביב הזה. לאחר מכן חברו את הזכוכית למשאבת ואקום, הוסיפו חמישה מ"ל של תרביות לפטוספירה למשפך.

לאחר מכן, להוסיף את זן בטא E.Coli 2163 המכיל plasmid של עניין. הנפח ישתנה בהתאם לצפיפות האופטית של התרבות. אנחנו מכוונים לתחכון תא אחד על אחד.

סובבו את משאבת הוואקום, עכשיו נוזלים נעבור דרך הממברנה והתאים יתרכזו בה. קח את המסנן והנח אותו על צלחת EMJH בתוספת DAP, צד דו-קולי למעלה. לדגור על הצלחות ב 29 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות.

ואז לשחזר את המסננים מן הצלחות ומניחים אותו לתוך צינור חרוט 50 ML. השתמש ML אחד של מדיה HAN נוזלית כדי לשחזר את התאים מהמסנן על ידי pipetting. דמיין את התאים המוחזרים באמצעות מיקרוסקופיית שדה כהה.

בשלב זה ניתן לראות מספרים שווים של E.coli ו לפטוספירות. 100 עד 200 מיקרוליטרים משמשים להפצת החיידקים על לוחות HAN המכילים ספקטינומיצין. בשלב זה, DAP מושמט ו- E.coli לא יגדל.

הצלחות דוגרות ב-37 מעלות צלזיוס ו-3%CO2. מושבות צריכות להיות גלויות בין שמונה לעשרה ימים. מושבות הבין-רוגנים של לפטוספירה קצת מסובכות לדמיין.

כאן אנו מראים מושבות מגודלות כדי להקל על לראות אותן. הוסף 100 מיקרוליטרים של HAN נוזלי, לצינורות 1.5 ML לשחזור המוטנטים. מומלץ לקחת לפחות שלוש מושבות מכל צלחת.

באמצעות קצה פיפטה, מושבות בודדות יוחזרו מהצלחות. אגר צפוי להילקח לבד. מושבות יש לקחת מלוחות בקרה המכילים MTP PMaOri.

dCas9 plasmid. וצלחות עם לפטוספירות המכילות פלסמיד עם dCas9 ו- RNA מדריך המיועד לגן היעד. התאים התאוששו עכשיו ניתן לדמיין תחת מיקרוסקופיה שדה כהה כדי לאשר את נוכחותם של leptospiras קיימא לעזוב.

לאחר הדמיה של leptospiras לעזוב, להעביר תאים למדיה HAN נוזלי המכיל ספקטינומיצין. לאחר צמיחת תרבית, תאים ניתן לשחזר כעת עבור השתקת אישור והערכה פנוטיפ. אם נוגדנים נגד חלבוני היעד זמינים אימונובלט היא מתודולוגיה ישר קדימה כדי להעריך השתקה.

לפטוספירות המכילות pMAOri. dCas9 לבד, או עם המדריך RNA Cas מוערכים על ידי PCR, פריימרים אגף עץ. DMT plasmid יגרום להקה של כ 300 זוג בסיסים רק סוג של סביב 700 מושגת כאשר קלטת RNA המדריך קיים.

אימונובלוטים באמצעות תמציות תאים שלמים מבוצעים לאישור השתקה, ביטוי חלבון lipL32 מבוטל בתאים המכילים פלסמידים המבוטאים ב- dCas9 ומנחים RNA המתמקד בגן זה. וגם קישור a וגם קישור B נעדרים בתאים המכילים את הרנ"א המדריך, הוא ספציפי לשני הגנים. ניתן לראות את שפת הבקרהL41 בכל הנתיבים.

אז השתמשנו בהפרעות CRISPR על אינטררוגנים לפטוספירה, השתמשנו בו גם על כמה מינים פתוגניים נוספים של לפטוספירה. השתמשנו בו כדי להשתיק גנים ספציפיים, כמו גם להשתיק את הביטוי של RNAs קטנים שאינם קידוד. עניין המחקר שלנו הוא בהבנת מנגנונים פתוגניים של זיהום, ולכן אנחנו בדרך כלל מחפשים לזהות גורמי שונות, אבל ברור שאתה יכול להשתיק את הגן שלך של בחירה ועל פי תחום המחקר שלך.

לדוגמה, זה יכול להיות תנועתיות או הבנה איך לפטוספירות להתמיד בסביבה, או חילוף החומרים. בכל מקרה, אתה אמור להיות מסוגל ליצור מוטציה ספציפית שתאפשר לך לבצע גנומיקה תפקודית ולהבין את המשמעות הביולוגית של הגן המדובר. אז מכולנו כאן במרכז הלאומי למחלות בעלי חיים, אנו מאחלים לכם בהצלחה רבה עם המחקר שלכם.