השתלת חלון גולגולת להדמיה חוזרת ונשנית In Vivo בעכברים ערים

מוצג כאן פרוטוקול להשתלת חלון גולגולתי כרוני להדמיה אורכית של תאי מוח בעכברים ערים ומרוסנים ראש.

הפרוטוקול מתאר כיצד לבצע זריקות ויראליות ולהשתיל חלון גולגולתי להדמיה של תאי מוח בעכברים ערים ומרוסנים בראש. היתרון של שיטה זו הוא שניתן לדמות שוב ושוב את המבנה והפעילות של נוירונים ואסטרוציטים במשך מספר הפעלות. ניתן להשתמש בגישה זו כדי לקבוע כיצד תאים עצביים משתנים במודלים של הפרעות נוירו-התפתחותיות, או נוירודגנרטיביות, או אם פלסטיות תלוית ניסיון נפגעת.

התחל על ידי אבטחת עכבר מורדם למסגרת סטריאוטקסית באמצעות מהדק החוטם ומוטות האוזניים. באמצעות כלים כירורגיים סטריליים, חותכים ומסירים את העור מהתפרים הקדמיים לברגמא לברגמא לגבדה. באמצעות להב כירורגי סטרילי בגודל 11 פלדת פחמן, לגרד בעדינות את כל רקמת החיבור מהגולגולת.

בעזרת מקדחה דנטלית, קודחים בהדרגה את עצם הגולגולת לאורך קווי המתאר של הפתח במעגלים קונצנטריים כדי להקל אפילו על דילול העצם. לאחר כל מעבר קונצנטרי, הוסיפו טיפה, או שתיים של מי מלח לאזור שנקדח, ואפשרו למלח לשבת לפחות 10 שניות לפני חידוש הקידוח. לחץ בעדינות על האזור המרכזי של עצם הגולגולת עם מלקחיים עדינים כדי לבדוק שהגולגולת מדוללת כראוי ונעה.

ודא כי כלי הדם הבסיסי שבו התרחש הקידוח הוא שלם, וכי העצם אינה סדוקה. הכניסו בזהירות להב מחודד מיניאטורי של 15 מעלות לתוך העצם הדלילה וחתכו והשתמשו בקצף הג'ל הספוג במי מלח כדי לעצור את כל הדימומים שעלולים להתרחש. באמצעות מלקחיים, בזהירות להרים ולהסיר את העצם, תוך הקפדה לא לפגוע במטר הדורה.

לצורך ההזרקה, מלאו פיפטת זכוכית משופעת סטרילית עם קצה של 20 מיקרומטר עם תערובת הנגיף. לאחר מכן הנמיכו את הפיפטה כדי לגעת במשטח המוח, והמשיכו להוריד למשך 200 עד 300 מיקרומטר נוספים לזריקות שכבה 2/3. באמצעות מערכת מיקרו-אינטגרטיבית תוך-תאית, הלחץ להזריק את המערכת 12 עד 15 פעמים במשך שתי דקות.

עבור השתלת חלון הגולגולת, הניחו את זכוכית הכיסוי מעל הפתח בגולגולת. השתמשו במלקחיים כדי לוודא שהזכוכית נשטפת מעל הפתח. כדי לאטום את קצוות חלון הזכוכית לגולגולת, יש למרוח ג'ל דבק ציאנואקרילט סביב היקף משטח הזכוכית.

מעל ג'ל ההדבקה, יש למרוח שכבת דבק. לאחר מכן מוסיפים שכבה של נוזל מלט דנטלי. כאשר מלט דנטלי מתקשה, יש למרוח שכבה דקה של דבק סביב הפתח המרכזי של לוחית הראש מסוג מסוק, ולהניח את לוחית הראש מסוג מסוק בגודל המתאים מעל זכוכית הכיסוי.

אפשרו לדבק להתייבש. הוסיפו אבקת צמנט דנטלית בצינור מיקרופוג' של 1.5 מיליליטר עד ל-0.1 מיליליטר. יש לערבב שבע עד שמונה טיפות של דבק אינסטנט מהיר לאבקה, ולמשוך את התערובת המתקבלת למזרק של מיליליטר אחד עם מחט של 19 מדים שנחתכה כדי ליצור פתח גדול יותר.

הזריקו את תערובת האבקה דרך החורים הצדדיים של מוט המסוק עד שהיא מחלחלת משני הצדדים. יש למרוח את תערובת דבק המלט הדנטלי על שאר הגולגולת החשופה כדי להדק את צלחת הראש לגולגולת. עוטפים את העכבר בבד, מהדקים אותו באמצעות צלחת הראש שלו לזרוע הקיבועית של הכלוב הביתי המוטס, ואז משאירים את הכלוב הביתי חשוף לאור.

לאחר זמן הרגלה של 15 דקות, הסר את העכבר מהכלוב הביתי. באמצעות מצב השדה הרחב של המיקרוסקופ, בחר שניים עד שלושה מיקומים של כלי דם הניתנים לזיהוי בקלות. שמור את התמונות של כלי הדם, ורשם את הקואורדינטות x ו- y המופיעות בבקר המנוע.

דמיין את המבנים הסינפטיים של נוירונים, ואת פעילות GCaMP6f באסטרוציטים. בניתוח הייצוגי, איכות חלון הגולגולת הוערכה באמצעות הדמיה חוזרת ונשנית של דנדריטים ואסטרוציטים המבטאים GCaMP6f לאורך ימים. בחלון טוב, המבנים העצביים נראו חדים עם קוצים דנדריטיים גלויים בבירור.

שני קוצים חדשים הופיעו ביום השני של ההדמיה. רק עמוד שדרה אחד התמיד ונראה ביום החמישי. פעילות הסידן נחקרה באסטרוציטים המבטאים GCaMP6f בנקודות זמן שונות.

אירוע עולמי שהקיף את התא כולו נצפה במהלך התקף תנועה. שני השלבים הקריטיים של פרוטוקול זה הם שיש לדלל את העצם כראוי לפני הסרת העצם, ואת המיקום הנכון של זכוכית הכיסוי מעל הפתח. הדמיה יכולה להיות משולבת עם ניתוח התנהגותי, במהלך הדמיה, או לאחר התנהגות, כגון למידת מיומנות מוטורית חדשה, כדי לקבוע כיצד המבנה והתפקוד של נוירונים ואסטרוציטים מווסתים על ידי למידה.