פריסת AAV של מבני ביטוי מבוססי משפר in vivo במוח עכבר

פרוטוקול זה משמעותי משום שהוא מאפשר הדמיה לא רק אם רצף משפר יכול להניע ביטוי, אלא היכן הוא יכול להניע ביטוי בחלק מסוים של הגוף. זה מהיר. ההזרקות נמשכות פחות מ-10 דקות, והאם והיכן מתבטא גן מדווח ניתן לראות תוך ימים ספורים בלבד מאיסוף הדגימה.

כדי להתחיל את השיבוט, בחר או עצב מבנה של כתב. המבנה המשמש כאן ממקם את מועמד המשפר בשלושת האזורים הראשוניים הלא מתורגמים של גן כתב EGFP המתבטא תחת שליטתו של מקדם המינימום hsp68. כדי לתכנן את פריימרי ה-PCR להגברת רצף של עניין ושיבוט לתוך הווקטור, הוסיפו את זרוע ההומולוגיה המתאימה לשיבוט גיבסון לחמשת הקצוות הראשוניים של הפריימרים.

באמצעות הפריימרים המתוכננים, בצע PCR מדגימת DNA. לעכל 1 עד 10 מיקרוגרם של דנ"א וקטורי באמצעות Pac1 ו- Asc1, בהתאם למספר הרצוי של תגובות השיבוט הנדרשות. על ידי שימוש באלקטרופורזה של 0.7 עד 1% ג'ל למשך 30 עד 60 דקות ב-100 וולט, יש להפריד את שברי ההגבלה.

חלצו את הרצועה עבור הווקטור הליניארי, וטהרו אותה באמצעות ערכת מיצוי ג'ל מסחרית. לאחר השלמת השיבוט והטרנספורמציה של התאים על ידי גיבסון, צלחת את התאים על מדיה סלקטיבית, ודגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר אימות השיבוט המוצלח של מבנה הכתב, יש לחסן חמישה מיליליטרים של תרבית המתנע באמצעות מלאי הגליצרול.

לגדל את התרבית במשך שמונה עד 16 שעות באינקובטור רועד בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ו-180 סיבובים לדקה. כאשר המרק הופך מעונן, לדלל את תרבית המתנע 1, 000x ב 250 עד 300 מיליליטר של מרק LB סלקטיבי טרי, ולדגור אותו לילה באינקובטור רועד ב 30 מעלות צלזיוס ו 180 סיבובים לדקה. באמצעות ערכת פלסמיד מקסי מסחרית, טהרו את הפלסמיד.

כדי לבדוק את הרקומבינציה של ה- ITR, בצע עיכול Xma1. דמיינו את הלהקות. ודא שהתקציר שלך מציג את מספר הרצועות הצפוי.

רקומבינציה תביא לפחות להקות מהצפוי. הכינו תערובת רקומביננטית AAV למשלוח. אם משווים את דפוסי הביטוי של מספר וירוסים משפרים, דיללו כל וירוס כדי להשוות את הווירוס לנגיף הכי פחות מרוכז.

ערבבו את נגיף המדווח המשפר ואת נגיף המדווח המבוטאת באופן מכונן ביחס של שניים לאחד או שלושה לאחד. הוסיפו כמות קטנה של צבע ירוק מהיר בריכוז סופי של 0.06% שברו את קצהו של פיפטה מזכוכית משוכה העשויה מצינורית נימים בגימור מיקרוליטר על ידי ניקוב עדין למגבון עדין ונטול מוך. הכנס את הפיפטה למכלול אספירטור עם מכשיר להפעלת לחץ המחובר לאטם גומי להחזקת פיפטה מיקרו-קפילרית.

למשוך נפח קטן של כ 0.2 עד 0.5 microliters של שמן מינרלי לתוך פיפטה על ידי הפעלת לחץ שלילי דרך השואף. שומרים את מכלול השואף בצד, ומניחים את הנגיף על הקרח עד שהוא מוכן להזרקה. לאחר הרדמת הקריו-הרדמה של עכברי היילודים, הפעילו לחץ שלילי באמצעות מכלול השואף, ומשכו את תערובת הנגיף לתוך פיפטה הזכוכית הנמשכת עד שהמניסקוס עובר את סימן הקרציות של שני מיקרוליטר.

קח את העכבר הרחק מהתא הקר, והנח אותו על הספסל. אתר את אתרי ההזרקה הדו-צדדיים באמצע הדרך בין למבדה לברגמה, כמו גם את התפר הסגיטלי וכל עין. יש לחטא אותם באמצעות מגבון אלכוהול.

לנקב את גולגולתם של עכברי היילודים באמצעות פיפטה הזכוכית הנמשכת. כאשר המחט נכנסת לגולגולת, הפעל לחץ חיובי דרך מכלול השואף. מוציאים מיקרוליטר אחד של הנגיף לחדר הצדדי, ומושכים את הפיפטה.

הניחו את העכבר על כרית חימום או על תא חימום כדי להתאושש. החזירו את החיה לכלוב הביתי לאחר שהתעוררה. הקלט תמונות פלואורסצנטיות החוצות את מקטע המוח באמצעות עדשה סובייקטיבית 5x בהגדלה נמוכה.

על ידי איתור אתר ההזרקה, להעריך את היקף התמרת הנגיף, בהתאם לצפיפות ולעוצמה של תאים פלואורסצנטיים אדומים. השווה את בעלי החיים שהותמרו באופן דומה. הקלט תמונות פלואורסצנטיות עם עדשה אובייקטיבית להגדלה גבוהה יותר של יותר מפי 25.

לאחר מכן, פתח את תוכנת הניתוח, והחל מסנן חציוני של שלושה על שלושה כדי להפחית את הרעש. לחץ על תהליך בתפריט ולאחר מכן לחץ על רעש, ובחר באפשרות Despeckle. לאחר מכן, כדי להחסיר את פלואורסצנציית הרקע מהתמונות, התחילו בהפרדת הערוצים של תמונה רב-ערוצית.

לחץ על תמונה בתפריט ולאחר מכן לחץ על צבע ובחר באפשרות פצל ערוצים. בעזרת הכלי מלבן או עיגול, ציירו צורה קטנה באזור בתמונה ללא תאים פלואורסצנטיים. מדוד את עוצמת הפיקסלים הממוצעת של הרקע על ידי לחיצה על נתח ולאחר מכן מדוד, וחזור על הדגימה מספר פעמים.

ממוצע הערך האפור הממוצע מחמישה עד שמונה אזורי רקע, ושחרר את הערכים העשרוניים. הפחת את הערכים מכל פיקסל בתמונה על-ידי בחירה בתפריט 'תהליך', ולאחר מכן לחץ על 'מתמטיקה' ו'הפחת'. לאחר מכן, הזינו את ערך הרקע להפחתה, ולחצו על הלחצן 'אשר'. במידת הצורך, מזגו את הערוצים בחזרה לתמונה רב-ערוצית על-ידי בחירה בתפריט 'תמונה', ואחר כך לחצו על 'צבע' ובחרו 'מזג ערוצים'.

כדי לספור את מספר התאים הפלואורסצנטיים הירוקים, הסתירו את הערוץ הירוק וציירו צורה סביב אזור המוח המבטאת פלואורסצנטיות אדומה באמצעות כלי הבחירה החופשית. לחץ על הפונקציה Measure כדי למדוד את השטח, הצפיפות המשולבת והערך האפור הממוצע של הערוץ האדום באזור שנבחר. ספור את מספר התאים הירוקים באמצעות כלי בחירה מרובה נקודות, ונרמל את מספר התאים הירוקים לפי העוצמה המשולבת של הערוץ האדום.

לאחר התמרה של כתב המשפר שהעכבר הזריק תוך גולגולתי ב-P0 עם מבנה AAV חיובי הראה ביטוי EGFP מונע משפר בשכבות התחתונות האמצעיות של קליפת המוח 28 ימים לאחר ההזרקה. העכבר שהוזרק לו מבנה בקרה שלילי ב-P0 אינו מראה כל ביטוי של EGFP 28 יום לאחר ההזרקה, מה שמדגים כי האלמנטים המשפרים נמצאים כמניעים שעתוק של EGFP במוח העכבר. כדי להמחיש את האזור המומר בהצלחה ואת השליטה על השתנות פוטנציאלית, נבדקו ספריות כתבים של משפרים שנמסרו על ידי AAV של טיטרים שונים.

ספריית הטיטר הגבוהה של משפרי מועמדים מניעה ביטוי EGFP רחב ואילו ספריית הטיטר התחתונה של משפרי מועמדים מניעה ביטוי CGFP דליל במוח עכבר P7. חיוני לערבב את כתב המשפר AAV עם השליטה החיובית בכל זריקה על מנת להבחין בין משפרים ללא פעילות לבין משלוחים כושלים. ניתן לשלב הליך זה עם אימונוהיסטוכימיה, RNA FISH או ריצוף RNA חד-תאי כדי לקבוע באילו סוגי תאים המשפר פעיל.