שיטה יעילה לאינדוקציה מכוונת של תאים דמויי הפטוציטים מתאי גזע עובריים אנושיים

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לבידול של תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) לתאים דמויי הפטוציטים תפקודיים (HLCs) על ידי השלמת Activin A ו- CHIR99021 באופן רציף במהלך בידול hESC לאנדודרם סופי (DE).

תאי גזע עובריים אנושיים שמקורם בהפטוציטים שימושיים במודלים של מחלות ובהקרנת תרופות. זוהי שיטה יעילה הניתנת לשחזור לגרימת הבידול היעיל של תאי גזע עובריים אנושיים לתאים דמויי הפטוציטים תפקודיים. מעמד לא מובחן ומכלול מתאים של תאי גזע עובריים אנושיים הם קריטיים לבידול מוצלח לתאים דמויי hepatocyte.

לתחזוקת תאי גזע, מעיל סטרילי שש באר רקמה תרבית מטופלים צלחות עם מיליליטר אחד של 1X תא גזע עוברי אנושי מוסמך Matrigel לכל באר, ולאחסן אותם בארבע מעלות צלזיוס לילה. השאירו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לפני השימוש. להפשיר את HESEs השתמר קריו באמבט מים 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות ללא רועד, ואז מיד להעביר את תאי הגזע על ידי צינור אותם לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר המכיל ארבעה מיליליטר של מראש מחומם, 37 מעלות צלזיוס mTESR בינוני.

צנטריפוגה HESEs ולשאוף את supernatant, ואז בעדינות להשעות מחדש את התאים במיליליטר אחד של מדיום mTESR. שאפת את מדיום ה-DMEM F-12 מהצלחת. זרע את התאים לתוך צלחת שש באר בצפיפות של 1 x 10 לתאים 5 בשני מיליליטר של mTESR, ואת הדגירה באינקובטור 5% פחמן דו חמצני.

שמור על התאים על ידי החלפת המדיום במדיום mTESR שחומם מראש מדי יום. מעבר התאים בערך 70 עד 80% מפגש, או כאשר מושבות התא מתחילות ליצור קשר. עבור תאים חולפים, לשאוף את המדיום דגירה התאים עם מיליליטר אחד לכל באר של פתרון אנזים במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

העבר את התאים על ידי צינור אותם לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר המכיל ארבעה מיליליטר של DMEM F-12 שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס. הכינו צלחות של 24 בארות על ידי ציפוין עם 250 מיקרוליטרים של מדיום Matrigel מוסמך 1X HESC. זרעי hESCs בצפיפות של 1 עד 1.5 פעמים 10 לתאים 5 לכל באר ב 500 מיקרוליטרים של מדיום mTESR.

הוסף את שני activin A לריכוז הסופי של 100 ננוגרם למיליליטר ו CHIR99021 לריכוז הסופי של שלושה micromolar בנפח המתאים של מדיום בידול שלב אחד שחומם מראש. לאחר שלושה ימים של בידול, תאים מובחנים צריכים לבטא סמנים של תאים אנדודרמים סופיים, כגון FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 ו- FOXA1. ביום השלישי של הבידול, שואפים את המדיום, מחליפים אותו בשלב 2 בינוני, ומדגרים במשך 24 שעות.

שנה את המדיום כל יומיים בימים 4 עד 8. לאחר שמונה ימים של בידול, תאים מובחנים צריכים לבטא סמנים מתאימים של תאי אב בכבד, כגון HNF4 אלפא, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA. ביום השמיני, שאף את המדיום שלב 2 מהתאים, והחלף אותו באמצעי שלב 3.

אפשר לתאים להדגיר במשך 10 ימים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור פחמן דו חמצני, ולשנות את התקשורת כל יומיים עם גורמי בידול טריים הוסיף. לאחר 18 ימים של בידול, תאים מובחנים צריכים לבטא סמנים אופייניים של hepatocytes, כגון AAT, ALB, TTR, HNF4 אלפא, NTCP, ASGR1, CYP3A4. מוצגת הדיאגרמה הסכימטית של תאים דמויי hepatocyte מ- hESCs ותמונות שדה בהירות של כל שלב בידול.

בשלב הראשון, activin A ו- CHIR99021 נוספו במשך שלושה ימים כדי לגרום לתאי גזע ליצור תאי אנדודרם. בשלב השני, תאי האנדודרם מובחנים לתאי אב בכבד לאחר שטופלו במדיום בידול במשך חמישה ימים. בשלב השלישי, לאחר 10 ימים, הפטוציטים מוקדמים התבגרו והתבדלו לתאים דמויי hepatocyte בגורם הגדילה hepatocyte ו oncostatin.

בשלב הסופי של הבידול, התאים הראו פנוטיפ hepatocyte טיפוסי. RT-PCR, כתמי כשל חיסוני, כתמים מערביים שימשו לגילוי סמנים של תאים אנדודרם, תאי מבשר הכבד, ו hepatocytes בוגרת. התאים המובחנים הראו רמות ביטוי גבוהות של גנים וחלבונים הקשורים לבידול בכל שלב, כגון סמני אנדודרם SOX17 ביום השלישי, סמן מבשר הכבד HNF4 אלפא ביום שמונה, AFP ביום 14, וסמן hepatocyte בוגר ALB ביום 18.

ה-HLCs הציגו כתמים ירוקים וכתמים נרחבים של חומצה ציטופלסמית. ההפטוציטים הראו מורפולוגיה דו-גרעינית טיפוסית. הפעילות האנזימטית של CYP3A4, CYP מטבולי חיוני בכבד בHLCs, אושרה עם מבחני אנזים.

ישיבה של תאי גזע עובריים אנושיים בצפיפות מתאימה והתחילת הבידול בתאריך הבא הם קריטיים. בשלב הראשון, גע במדיה בעדינות מכיוון שהתאים נוטים לצוף למעלה. השילוב של activin A ומולקולות קטנות אחרות עשוי לשפר עוד יותר את יעילות הבידול, ולייצר תאים בוגרים יותר דמויי hepatocyte בהליך זה.

טכניקה זו יכולה לספק פלטפורמה לחקור השתלת hepatocyte, הנדסת רקמת כבד, כבדים bioartificial, ומידול מחלות.