הדמיה של היווצרות קפלים בממברנה באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת

פרוטוקול ההדמיה הנוכחי של SEM מספק כלי להדמיה ולכימות של היווצרות קפלים בממברנה, בליטות מעגליות וכוסות מקרופינוציטיות על פני התא במבחנה. SEM מספק תמונות ברזולוציה גבוהה של פני השטח של התא שניתן להשתמש בהן כדי להמחיש את פעילויות הממברנה המקרופינוציטית. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לגלות מסלולי איתות חדשים המווסתים את המקרופינוציטוזה, ולזהות ממריצים ומעכבים חדשים של מיקרופינוציטוזה.

התחילו בהנחת מחליקים מזכוכית סטרילית בבארות של לוחית בעלת 24 בארות באמצעות מלקחיים אוטוקלאבים. לאחר מכן זרעים גולמיים של 264.7 מקרופאגים על הכיסוי מחליקים בצפיפות של 10 עד השישית לכל מיליליטר ומדגירים את הצלחת למשך הלילה באינקובטור לח ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. ביום שלמחרת, החליפו את המדיה בכל באר ב-500 מיקרוליטרים של מדיה מלאה ורעננה, ואז הקדים את המקרופאגים למשך 30 דקות עם בקרת רכב כגון DMSO או מעכב מקרופינוציטוזה כגון EIPA.

לאחר מכן, כדי לקדם את התפשטות הממברנה, טפלו בתאים במשך 30 דקות עם ממריצים למקרופינוציטוזה, כגון תמיסת PMA של מיקרומולר אחד או 100 ננוגרם למיליליטר של גורם מגרה מושבת מקרופאגים. כדי לתקן את התאים לסריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים, שאפו את המדיה מהבארות ושטפו את החלקות הכיסוי פעמיים עם PBS קר כקרח, ואז דגרו את החלקות הכיסוי בקיבוע למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר ולאחר מכן דגירה לילית בארבע מעלות צלזיוס. ביום המחרת, מבלי להפריע למונו-שכבת התא, לשטוף בעדינות ולאחר מכן לדוגר את החלקות הכיסוי ב 500 מיקרוליטרים של 0.1-מנוע נתרן cacodylate במשך 15 דקות.

לאחר שתי שטיפות עם 500 מיקרוליטרים של מים מזוקקים, שטפו את החלקות הכיסוי פעמיים ב-500 מיקרוליטרים מסדרת אתנול מדורגת עם דגירה של 10 דקות בכל שטיפה. כדי לבצע ייבוש נקודתי קריטי, הניחו את החלקות הכיסוי במייבש נקודה קריטית וכסו אותן ב-100% אתנול. לאחר מכן, לחץ על לחצן ההפעלה ופתח את מיכל הפחמן הדו חמצני.

לחץ על הכפתור הקריר למשך כ-30 שניות עד שהטמפרטורה יורדת לאפס מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לחץ על לחצן המילוי עד שתופיע בועה בחלון החדר. לאחר מכן, לחץ על כפתור הטיהור עד שריח האתנול מפליטת הטיהור ייעלם.

לאחר מכן, לחץ שוב על הכפתור הקריר עד שהטמפרטורה יורדת לאפס מעלות צלזיוס. לחץ מחדש על הלחצנים המלאים ונקה אותם כדי לכבות אותם. לאחר מכן, סגור את מיכל הפחמן הדו חמצני.

לחץ/י מחדש/י על החלק התחתון הקריר כדי לכבות אותו ולאחר מכן לחץ/י על הכפתור ״חום״. הגדר את הטמפרטורה ל -42 מעלות צלזיוס והלחץ ל -1, 200 פאונד לאינץ 'מרובע. לאחר שהלחץ והטמפרטורה מתייצבים, לחץ על כפתור הדימום כדי לאפשר ללחץ לרדת לאט.

ברגע שלחץ התא מגיע ל-150 פאונד לאינץ' מרובע, לחצו על קרקעית האוורור והמתינו עד שהלחץ יירד לאפס פאונד לאינץ' מרובע. כבו את מייבש הנקודה הקריטית והסירו את תלושי הכיסוי. לאחר מכן, באמצעות ברזים דבק פחמן, להרכיב את החלקות הכיסוי על תושבות דגימת האלומיניום לסריקת מיקרוסקופיית אלקטרונים, ולאחר מכן להמשיך לפזר ציפוי באמצעות זהב או פלדיום במעיל Sputter.

הפעל את לחצן ההפעלה של מעיל הספליטר. לאחר שהוואקום מגיע ל -30 מיליטרים, שטפו את התא כדי להסיר לחות ואוויר על ידי כיבוי מתג הגז והפעלת שסתום הגז העדין נגד כיוון השעון. ברגע שהוואקום גדל ל-200 מיליטורים, כבו את מתג הגז והמתינו עד שהוואקום יגיע ל-30 מיליטורים.

לאחר מכן, שטפו שוב את החדר כדי להסיר לחות ואוויר כפי שהודגם. לאחר שטיפת התא שלוש פעמים, דחפו את תחתית הטיימר והתאימו את ידית המתח עד שהמד יקרא 10 מיליאמפרים. לאחר מכן, הסר את החלקות הכיסוי המצופה מהתא.

כדי לדמיין ולכמת את קפלי הממברנה, הכנס את כיסוי הדגימה מחליק לתוך החדר של מיקרוסקופ אלקטרונים סורק, סגור את הדלת ולחץ על כפתור evac. פתח את תוכנת ההפעלה של המיקרוסקופ והגדר את המתח המואץ ל-15 קילובולטים ואת מרחק העבודה ל-10 מילימטרים. לחץ על הלחצן קואורדינטות והתקדם סביב הבקר עד שהתאים יופיעו במרכז מסך התצפית.

הגדר את ההגדלה ל- 3, 500 X ודמיין את הדגימה על ידי לחיצה על לחצן תמונה. מוצגות כאן תמונות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקות מייצגות, המדגימות היווצרות קפלי ממברנה במקרופאגים גולמיים של 264.7 לאחר טיפול ב-PMA ובגורם מגרה מושבת מקרופאגים. טיפול מקדים של מקרופאגים עם מעכב המקרופינוציטוזה EIPA מחליש את היווצרות הקפלים של הממברנה.

במהלך היווצרות הקפלים, קרום הפלזמה עובר שלבים מורפולוגיים שונים, כולל בליטה דמוית ממברנה דמוית יריעה, קפל קרום בצורת C וכוס מקרופינוציטית. ניתן לכמת את היווצרות קפל הממברנה בעקבות טיפולים בגורמים מגרים של PMA ומקרופאגים באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת, בעוד שניתן לאשר היווצרות מקרופינוזומים על ידי טכניקות הדמיה חלופיות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות דקסטרן אדום טקסס ו- FM4-64. החצים הכחולים מצביעים על ריפוד ממברנה, בעוד שהחצים הצהובים והירוקים מצביעים על המיקרופינוזומים.

לבסוף, ניתן לאשר ולכמת את המקרופינוציטוזה באמצעות ציטומטריית זרימה באמצעות סמן פאזה של נוזל פלואורסצנטי כגון FITC או טקסס רד דקסטרן. בנוסף ל-SEM, ניתן לבצע גם הדמיית תאים חיים וניתוח ציטומטריה של זרימה של הפנמה פלואורסצנטית של דקסטרן כדי לחקור ולכמת מקרופינוציטוזה.