ניתוח ציטומטרי זרימה של סמנים ביולוגיים אפופטוטיים בתאי סרטן צוואר הרחם SiHa שטופלו ב- Actinomycin D

ציטומטריית זרימה היא טכניקה רבת עוצמה המאפשרת ניתוח רב-פרמטרי של תאים בודדים. הוא יכול לזהות סמנים ביולוגיים של אפופטוזיס מוקדם ומאוחר באופן מדויק ומהיר על ידי ניתוח מיליוני תאים. מולקולות תאים מרובות מוכתמות ומזוהות בו זמנית.

בפרט, ציטומטריית זרימה של ספסל עליון מאפשרת ניתוח ופרשנות על ידי ציטומטריסטים של זרימה שאינם מומחים. מי שתדגים את ההליך תהיה אסתר ג'ואו, סטודנטית לתואר שני מקבוצת הסרטן ויטמין D. התחילו בגידול תרביות התאים בסביבת CO2 לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.

ודא כי תרבית תאים היא כ 70% בבקבוק האב לפני העברת תאים לניסויים. הסר את המדיום מן הבקבוק ולשטוף את התאים עם 1X PBS. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של טריפסין כדי לנתק את התאים.

לאחר שהתאים מתחילים להתנתק, נטרלו את הטריפסין על ידי הוספת כחמישה מיליליטר של מדיום תרבית טרי בתוספת נסיוב עגל עוברי 10% לפני ספירת התאים. תאי זרע ב 15, 000 תאים למיליליטר בשלושה מיליליטר של מדיום תרבית תאים בצלחת תרבית תאים שש בארות. דגרו על צלחות התרבית למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2 כדי לאפשר את חיבור התאים לתחתית הבאר.

למחרת, טפל בתרביות הניסוי עם 100 ננוגרם למיליליטר של אקטינומיצין D ובבקרות המדיום והממס עם מדיום תרבית טרי ו- DMSO, בהתאמה, למשך 24 שעות. הסר את המדיום מהבארות ואסוף את המדיום המשומש בצינור של 15 מיליליטר. שטפו את התאים עם 1X PBS.

הוסף 500 מיקרוליטר של טריפסין כדי לנתק את התאים. יש לסובב בעדינות פיפטה אחורית מיליליטר אחד של מדיום פעמיים עד שלוש פעמים כדי לעקור מכנית את התאים הנותרים שעדיין מחוברים לתחתית הבאר. הוסף את התמיסה מהבארות לצינור של 15 מיליליטר ולאחר מכן הוסף חמישה מיליליטר של מדיום תרבית טרי כדי לנטרל את הטריפסין.

פיפטה 450 מיקרוליטר של מגיב המכיל DNA מחייב צבעים בצינור מיקרוצנטריפוגה. הוסף 50 מיקרוליטר של תרחיף התא לצינור מיקרוצנטריפוגה. דוגרים על הצינור בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות.

ספירת התאים לפי ציטומטריית זרימה. לדלל את כל הדגימות לריכוז של אחד פעמים 10 עד התאים השישיים למיליליטר עם מדיום תרבית תאים לפני שתמשיך לבדיקות אפופטוזיס. כדי לזהות החצנה של פוספטידיל-סרין באמצעות נספחין V, יש להוסיף 100 מיקרוליטר של תרחיף תאים לצינור מיקרוצנטריפוגה.

לזה, להוסיף 100 מיקרוליטר של תערובת 1: 1 של annexin מצומד פלואורסצנטי V ו 7-AAD מגיב. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות, מוגן מאור. לניתוח של דה-פולריזציה של קרום המיטוכונדריה, התחל בצנטריפוגה של 100 מיקרוליטר של תרחיף התא ב -300 פעמים G במשך חמש דקות ולאחר מכן השליך את הסופרנטנט.

להשעות מחדש את התאים במיליליטר אחד של 1X PBS. הוסיפו 100 מיקרוליטר של תמיסת צביעת TMRE לכל דגימה וערבבו את המתלה על ידי פיפטינג גב עדין. עטפו את הדגימות ברדיד אלומיניום נקי כדי להגן עליהן מפני אור ודגרו על התאים במשך 20 דקות בסביבת CO2 לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

בסוף הדגירה, להוסיף פתרון עבודה 7-AAD למדגם ולערבב אותו. כדי לזהות קספאז-3 ו-7 טרמינליים פעילים, התחל על ידי דילול הפפטיד קושר ה- DNA הקשור ל- DEVE ב- DMSO ליחס של 1:8 עם PBS 1X סטרילי כדי להפוך את פתרון זיהוי הקספז לפתרון. אחסנו את התמיסה על קרח או הוסיפו שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס, מוגנות מפני אור.

הוסף שני מיקרוליטרים של פתרון מלאי 7-AAD ל- 148 מיקרוליטר של 1X PBS כדי ליצור את פתרון העבודה 7-AAD. אחסנו את התמיסה על קרח או בשתיים עד שמונה מעלות צלזיוס, מוגנות מפני אור. צנטריפוגה 50 מיקרוליטר של התא מתלה במשך חמש דקות ב 300 פעמים G ולזרוק את supernatant.

להשהות מחדש את התאים ב 50 מיקרוליטר של 1X PBS, ולאחר מכן חמישה מיקרוליטרים של פתרון זיהוי קספז עבודה ולערבב היטב. שחררו את פקק הצינורות ודגרו במשך 30 דקות בסביבת CO2 לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, מוגנת מפני אור. הוסף 150 מיקרוליטר של פתרון העבודה 7-AAD לכל דגימה וערבב.

דוגרים במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר, מוגנים מפני אור. לצורך זיהוי שברי דנ"א דו-גדיליים ונזק כולל לדנ"א, יש לבצע צנטריפוגה ראשונה של 50 מיקרוליטר של תרחיף התא למשך חמש דקות ב-300 פעמים G ולהשליך את הסופר-נטנט. להשהות מחדש את התאים ב 500 מיקרוליטר של 1X PBS ולהוסיף 500 מיקרוליטר של חיץ קיבוע מבוסס פורמלדהיד ולערבב.

לדגור את הדגימות על קרח במשך 10 דקות. צנטריפוגה במשך חמש דקות ב 300 פעמים G ולזרוק את supernatant. להשהות מחדש את התאים ב 90 מיקרוליטר של 1X PBS בצינור מיקרוצנטריפוגה.

הוסף 10 מיקרוליטר של תמיסת הנוגדנים לצינור המיקרוצנטריפוגה. יש לדגור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות בחושך. מוסיפים 100 מיקרוליטר של 1X PBS וצנטריפוגה למשך חמש דקות ב-300 פעמים G.השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את התאים ב-200 מיקרוליטר של 1X PBS.

ערבבו את הדגימה על ידי פיפטציה עדינה לאחור לפני העמסת הדגימה על ציטומטר הזרימה. אמת את הביצועים האנליטיים של ציטומטר הזרימה על ידי הפעלת ערכת בדיקת המערכת של המכשיר ואל תמשיך עם דגימות ריצה עד שכל הבדיקות יושלמו ויעבורו. ראשית, טען דגימת בקרה שלילית על ציטומטר הזרימה ובחר הפעלה, התאמת הגדרות, כך שהמכשיר יתחיל לשאוף את הדגימה ויספק תצוגה מקדימה בזמן אמת של אירועים שזוהו.

באמצעות התצוגה המקדימה החיה, התאם את ערכי הסף עבור פלואורסצנטיות וגודל התא. ציירו שער מלבני סביב אוכלוסיית התא, גררו את סמן הסף כדי לא לכלול פסולת תאית ובחרו באפשרות הבא, הגדר פרופיל אפופטוזיס כדי להמשיך. הקש וגרור את סמני הרביע כדי להפריד בין אוכלוסיות התאים וכדי להתוות אירועים שזוהו בזמן אמת.

השתמש בתרשימים אלה כדי להנחות את משתמש הקצה לגבי המיקום המתאים של סמני הרביע. בחר הבא, אמת הגדרות כדי להמשיך כך שהמכשיר יציג סיכום של ההגדרות. לאחר סקירת ההגדרות, בחר Next, Finish Settings כדי להחיל הגדרות אלה על כל הדגימות בניסוי.

ערבבו את הדגימה הראשונה על ידי פיפטציה עדינה לאחור וטענו את הדגימה הראשונה על ציטומטר הזרימה. בחר הבא ולאחר מכן תן שם לדוגמה ובחר הפעל כך שהמערכת תתחיל להפעיל את הדגימה. במידת הצורך, בצע כוונון עדין של שערים או סמני רביע לאחר הרכישה.

אתר את הניסוי הדורש התאמה על-ידי ניווט בדפדפן הקבצים של המערכת ופתח את הניסוי. הקש על התצוגה המקדימה של התמונה הממוזערת של העלילה כדי להגדיל אותה. כדי לכוונן את הסמנים המרובעים, לחץ על הצטלבות הקו האנכי והאופקי כדי להזיז את הסמנים כפי שהם, והתאם את הזווית של כל קו על-ידי לחיצה על הקו וגרירת הידית.

כדי לחדד את גידור התא, לחץ על הכרטיסייה שער והתאם את מידות השער. התאם את הסמנים כרצונך והחל הגדרות אלה על כל הדגימות בניסוי על-ידי בחירת סמל סימן הביקורת, סימון כל הדגימות ובחירה באפשרות קבל. הפעל בדיקות משולשות והפעל ניתוח שונות עם מבחן בונפרוני פוסט הוק כדי להעריך הבדלים משמעותיים בין הדגימות לבקרות.

ספירת התאים ותוצאות הכדאיות הראו כי 95.2% מהתאים במדגם היו חיים ו-4.8% היו מתים. ריכוז התאים נמצא 5.90 כפול 105 תאים למיליליטר. בדיקת annexin V ומוות תאים הראתה עלייה משמעותית בתאים אפופטוטיים בתאי SiHa שטופלו ב-100 ננוגרם למיליליטר אקטינומיצין D, בהשוואה לקבוצת הביקורת.

בדיקת פוטנציאל טרנסממברנה אלקטרוכימית מיטוכונדריאלית הדגימה ירידה משמעותית בפרופילי בריאות התא בין actinomycin-D, בקרה בינונית ובקרת ממס, אשר הציעה כי 100 ננוגרם למיליליטר actinomycin D גרם לדפולריזציה מיטוכונדריאלית בתאי SiHa. בדיקת קספאז-3 ו-7 הדגימה הפעלה משמעותית של קספזות סופניות בתאי SiHa שטופלו ב-100 ננוגרם למיליליטר אקטינומיצין D, בהשוואה לקבוצת הביקורת. Actinomycin D גרם באופן משמעותי לסמני נזק לדנ"א, ATM, ו- H2A.

X בתאי SiHa, מה שמרמז על עלייה משמעותית בנזק לדנ"א. כדי לשפר את הדיוק, הקפד לקצור את אוכלוסיית התאים הכוללת. כמו כן, יש להקפיד על ריכוזי התאים המומלצים על ידי היצרן וזמני הצביעה.

ההגנה על דגימות מוכתמות מפני אור מונעת הלבנה או פלואורופורים. הניתוח הביוכימי של אפופטוזיס על ידי ציטומטריית זרימה צריך להיות נתמך על ידי מיקרוסקופיה. זה יזהה תכונות מורפולוגיות של אפופטוזיס קלאסי.

התכונות כוללות עיבוי גרעיני, מיזוג קרום התא, גופים אפופטוטיים, ו karyorrhexis.