מולקולה בודדת פלואורסצנטית העברת אנרגיה מחקר של סינתזת חלבון ריבוזום

FRET של מולקולה אחת יכול ללכוד דינמיקה המתרחשת במרחקי ננומטר, שהוא קנה המידה הנכון לתהליך הביוסינתזה של חלבון ריבוזומלי. ריבוזום עובד על ידי תיאום גורמים ורכיבים מרובים באופן אלסטרי, שהוא מהותי אינומוגני. שיטת מולקולה אחת יכולה לעקוב אחר כל ריבוזום מבלי להיות מוגבלת על ידי אפקט ממוצע זה inhomogeneous.

שיטה זו תחשוף כיצד אנטיביוטיקה מעכבת את תפקוד הריבוזום לפתח תרופות חדשות לזיהומים חיידקיים עמידים לתרופות. התחל על ידי הכנת PRE על ידי ערבוב EFTU החניכה, NOG, ו PAG לערבב ביחס של אחד עד שניים לשניים ב 37 מעלות צלזיוס במשך שתי דקות. לאחר הדגירה, לטהר את PRE באמצעות 1.1 כרית סוכרוז טוחנת אולטרה צנטריפוגה לילה ב 100, 000 פעמים G.Prepare את ההודעה על ידי ערבוב EFTU החניכה, WG, ו PHE לערבב ביחס של אחד עד שניים לשניים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.

לאחר הדגירה, לטהר את הפוסט באמצעות 1.1 טחנת סוכרוז כרית אולטרה צנטריפוגה לילה ב 100, 000 פעמים G.Clean את שקופיות זכוכית מיקרוסקופ המכיל שישה זוגות של חורים כי הם מילימטר אחד כיסוי זכוכית מיקרוסקופ. אופים את השקופיות הנקיות ומכסה ב-300 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות, ואז מצפים את כיסוי הציפוי באמינסלין. במכסה המנוע הנקי, הניחו כיסוי אחד שטוח על פני השטח.

בזהירות טיפה 60 מיקרוליטרים של פתרון PEG בקצה העליון, ואז להניח כיסוי נוסף על גבי זה, ומאפשר אפקט נימי להפיץ את הפתרון ביניהם להבטיח כי אין בועות נוצרו. חזור על שלבים אלה עבור שני זוגות כיסויים נוספים. אחסנו את הכיסויים האלה בקופסת קצה ריקה מלאה במים ודגרו אותם במשך שלוש שעות בחושך.

לאחר שלוש שעות, להפריד את כיסויים, לשטוף עם מים בשלושה כור היתוך רצופים לטהר עם זרם חנקן יבש. משכו קצות פיפטה חדות דרך החורים על מגלשות הזכוכית עד שהם מתאימים היטב. לגרד את הקצוות החדים עד שהם שטוחים לחלוטין עם משטח הזכוכית, ולאחר מכן לחתוך קלטת דו פרצופית עם דפוס הערוץ על זה.

תקעו את מגלשות הזכוכית בצד השטוח. יש להניח את הכיסוי המצולף על גבי סרט הפנים הכפול ותלחצו עליו כדי ליצור אטם הדוק של תא הדגימה, ולוודא שהצד המצופה פונה פנימה. הפעל את המחשב ואת מתג המיקרוסקופ.

התחל את ממשק בקרת הלייזר והפעל את הלייזר. לחץ על לחצן ההפעלה בתיבת בקרת הלייזר כדי לחמם את הלייזר. הפעל את המצלמות ולאחר מכן הפעל את התוכנה המשויכת למיקרוסקופ.

לחץ על התריס העליון כבוי ולחץ על המנורה. הכן את ה- TAM10 עם חיץ Tween על-ידי הוספת 10 מיקרוליטרים של 5% Tween-20 למיליליטר אחד של חיץ TAM10. הכן את פתרון deoxy על ידי שקילה של שלושה מיליגרם של גלוקוז אוקסידאז בצינור microcentrifuge קטן ולהוסיף 45 microliters של קטלאז אליו.

מערבולת את הצינור בעדינות כדי להמיס את המוצק. ספין ב 20, 000 פעמים G ב microcentrifuge במשך דקה אחת ולקחת את supernatant. הכן 30% פתרון גלוקוז, פתרון טרולוקס 200 מילימולר ו 0.5 מיליגרם למיליליטר של פתרון סטרפטבידין בעקבות הוראות בכתב היד טקסט.

הוסף טיפה אחת של שמן הדמיה למטרה דשא. שים את תאי המדגם על המטרה. מלאו את התא ב-10 מיקרוליטרים של תמיסת סטרפטבידין והמתינו דקה אחת.

לשטוף את התא עם 30 microliters של TAM10 עם חוצץ Tween, איסוף הפתרון לרוץ דרך עם נייר מסנן מקופל. המתן דקה לאחר הכביסה. לדלל את מתחמי ריבוזום לפני או פוסט לריכוזים 10-15 ננומולר עם TAM10 עם חוצץ Tween.

טען 20 מיקרוליטרים של דגימת ריבוזום לתוך הערוץ ולחכות שתי דקות. הפוך את מאגר ההדמיה באמצעות 50 מיקרוליטרים של חיץ TAM10 ו 0.5 מיקרוליטרים כל אחד של פתרון deoxyglucose ו Trolox. מערבבים אותם היטב.

לשטוף את התא עם 30 מיליליטר של מאגר ההדמיה. הגדר את המצלמה להשגת תמונות. לחץ על התריס העליון על והמנורה כבויה.

התחל את רכישת המצלמה והפץ את התמונות לשלושה חלונות המייצגים שתי מצלמות בודדות ואת שכבת העל. תחת תפריט רכישה, בחר לכידה של זמן ולאחר מכן לחץ על לכידה באופן אוטומטי. הגדר את שם הקובץ, נתיב הקובץ ומספר הלולאות המתאימים ולחץ על הפעל כעת.

סגור את החלון המוקפץ לאחר השלמת רכישת התמונה ולאחר מכן פתח את קובץ ND שנרכש. לחץ על ROI, עורך ROI פשוט ובחר את מעגל האפשרויות. בחר את ההבגייה בתמונה ולחץ על סיום לאחר השלמתה.

לחץ על מדידה, מדידת זמן כדי להציג את הנתונים כהתוויה או כגליונות אלקטרוניים. פתח את הכרטיסיה ייצוא כדי להגדיר את פרמטרי הייצוא ולאחר מכן לחץ על ייצוא כדי לשמור את האינטנסיביות. לבסוף, פתח את הקובץ שיוצא באמצעות יישום מתאים.

המרחק משאריות התוויות L27 לאתר A או ל- TRNA של אתר P הוא 61 או 52 אנגסטרום בהתאמה, בהתאם ליעילות FRET של 0.47 ו- 0.65. עוצמות פלורסנס מערוצי התורם והקבלה אוחזרו ותכננו כזמנים. לאחר הלבנת התורם, שני העקבות התקרבו לקו הבסיס מכיוון שלא ניתן היה להתרחש עירור ישירות על המקבל.

לאחר ההלבנה הקבלה, עוצמת התורם גדלה כי פחות מסלולי תגובה פיזרו את אנרגיית העירור. הריבוזומים הבודדים הציגו תנודות שונות בשל התנועה המתנדנדת של tRNAs, אשר גרם תנודות מרחק L27. שיטות אחרות כמו Puromycin assay, בדיקות, צקת בהונות ומפרט מסה הם מחמיאים לשיטת FRET מולקולה אחת לחשוף פרטים נוספים על סינתזת חלבון.

למולקולה אחת FRET יש יישום רחב מכיוון שלתהליכים ביולוגיים רבים מתרחשים בטווח הננומטר ובטווחי זמנים של אלפיות השנייה. על ידי תיוג צבעים נכונים בתנוחות מתאימות, ניתן לגלות דינמיקה רבה אחרת.