Name: צמיחה, טיהור, ו Titration של וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: למדו שיטה פשוטה לגידול, טיהור וטיטרציה של וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי לשימוש במחקרים טרום-קליניים. הפרוטוקול מתאים למעבדות בטיחות ביולוגית רמה 2 ומייצר מניות ויראליות איכותיות לחקר אימונותרפיה נגד סרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר במעבדת סאהא נתמך בחלקו על ידי קרנות ממשרד המשפטים (W81XWH-20-1-0702) וקרן דודג' ג'ונס-אבילין. סמואל ד. רבקין ומליסה ר.M האמפרי נתמכו חלקית על ידי NIH (R01 CA160762).

1) צמיחת oHSV
הערה: יש להבטיח את אישור הוועדה המוסדית לתמיכה ביולוגית לפני העבודה עם oHSV. מחקר זה נערך במסגרת פרוטוקול IBC מס' 18007 שאושר. שמור על אמצעי זהירות BSL2: להלבין את כל pipets, טיפים, צינורות, וחומרים אחרים שבאים במגע עם הנגיף. ריסוס כפפות עם 70% אלכוהול איזופרופיל לפני הידיים לעזוב את מכסה המנוע תרבות התא BSL2. תמיד ביסודיות לשטוף ידיים עם מי סבון לאחר עבודה עם וירוס.
<ol><li>ביום -1, זרעים מעבר נמוך תאי Vero ב 20 T-150 ס"מ2 בקבוקונים בצפיפות של 7-8 × 106 תאים / בקבוקון במדיום תא Vero רגיל. הערה: מדיום Vero מוכן על ידי השלמת מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) עם 10% חום מומת סרום עגל עוברי (IFCS).</li>
	<li>ביום 0 (תאים הם 80-90% confluent), להוסיף inoculum oHSV על תאי Vero.<ol>
<li>הכנת אינוקולום וירוס<ol>
<li>השתמש בריבוי של זיהום (MOI) של 0.01 (MOI יכול לנוע בין 0.01 ל 0.1 בהתאם לקיבולת השכפול של וירוס) עבור הגברה וירוס. השתמש בנוסחה (1) כדי לחשב את כמות הווירוס (mL) עבור 20 בקבוקונים. כמות הווירוס (mL) עבור 20 בקבוקונים = כמות הווירוס הדרושה (pfu)/titer של מלאי וירוסים (pfu/mL)(1)</li>
			<li>השתמש במים מלוחים עם אגירת פוספט (DPBS) של גלוקוז גבוה (DPBS) בתוספת 1% IFCS להכנת אינוקולום הנגיף (7 מ"ל לכל בקבוקון T-150 ס"מ2, כלומר, ~ 140 מ"ל עבור 20 בקבוקונים). הוסף את הכמות הנדרשת של oHSV ל 140 מ"ל של פתרון DPBS/1% גלוקוז גבוה IFCS, מערבולת במשך 1 דקות, ולשמור על התערובת מוכנה לתוספת לתאי Vero.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לשטוף את T-150 ס"מ2 בקבוקונים 2x עם DPBS גלוקוז גבוהה בתוספת 1% IFCS (10 מ"ל / לשטוף). לשאוף DPBS/1% IFCS ולהוסיף 7 מ"ל של וירוס inoculum / T-150 ס"מ2 בקבוק.</li>
		<li>בעדינות לנענע את הבקבוקים במשך 5 דקות באמצעות נדנדה בקבוק לחלוקה נכונה של inoculum מעל monolayer Vero, ולאחר מכן לדגר את הבקבוקים ב 37 °C (60 °F) עבור 1.5-2 שעות. ודא מדף האינקובטור הוא ברמה.</li>
		<li>הסר את inoculum ולהוסיף DMEM בתוספת 1% IFCS (25 מ"ל / בקבוק). דגירה את הבקבוקים במשך 2-4 ימים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בדוק את הבקבוקים מדי יום עבור 90-100% CPE (ראה איור 2).</li>
	<li>לקצור את תאי Vero נגועים oHSV.<ol>
<li>לאסוף את התרבות supernatant (~ 20 מ"ל) מכל בקבוקון (להשאיר ~ 5 מ"ל בכל בקבוק) ב 50 צינורות צנטריפוגה חרוט מ"ל או מיכל מדיה.</li>
		<li>השתמש מגרד תאים כדי לגרד את התאים מתחתית הבקבוקים בעדינות. הערה: התאים צריכים לרדת במהירות את הבקבוקים.</li>
		<li>הוסף ~ 15 מ"ל של supernatant התרבות (שנאסף בשלב 1.4.1) לכל בקבוקון (אשר מביא את הנפח של ~ 20 מ"ל בכל בקבוקון, כלומר, 400 מ"ל עבור 20 בקבוקונים) בעדינות לשטוף את החלק התחתון של הבקבוקים כמה פעמים באמצעות צינור סרולוגי סטרילי 10 mL. הערה: אין לצנרת במרץ. המטרה היא לשמור על כל התאים שלמים.</li>
		<li>לאסוף את התאים (+ בינוני) לתוך 50 צינורות צנטריפוגה חרוט מ"ל על קרח (להשתמש 8 צינורות להחזיק 400 מ"ל של תאים שנקטפו מ 20 בקבוקים).</li>
		<li>לסובב את התאים ב 300 גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס לשאוף את supernatant.</li>
		<li>הוסף 1.25 מ"ל (50%) של מאגר וירוסים (VB) ו- 1.25 מ"ל (50%) של תרבות supernatant (שנאסף בשלב 1.4.1) לכל צינור צנטריפוגה להשעות מחדש כל גלולה ביסודיות. להעביר את התאים המושעים מחדש משמונה צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל לצינור אחד צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל. הערה: עיין בהכנת פתרון VB בטבלה 1. סינון-עיקור פתרון VB באמצעות מסנן עיקור מדיה. השתמש 0.5 מ"ל של VB + 0.5 מ"ל של supernatant לכל T-150 ס"מ2 בקבוק להשעיה מחדש, כלומר, עבור 20 בקבוקונים (20 מ"ל), להשתמש 10 מ"ל של VB ו 10 מ"ל של תרבות supernatant.</li>
		<li>להקפיא את התאים המושעים מחדש באמצעות קרח יבש/100% אתנול ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2) טיהור oHSV
<ol><li>הצמד להקפיא (בקרח יבש ו 100% אתנול)/ להפשיר (באמבט מים חמים 37 מעלות צלזיוס) התאים ואחריו אמבט מים sonication במשך 1 דקות במשך סך של 3 מחזורים כדי להבטיח תמוגה נכונה של התאים לשחרר וירוס supernatant. הערה: בצע sonication במשך דקה אחת באמצעות 40 kHz, 120 V כוח. אם sonicator מתכוונן אינו זמין, להשתמש sonicator אמבט מים קולי. קח aliquot 50 μL עבור טיטרציה בסעיף 3, אשר יסייע לזהות אילו מהשלבים הבאים(ים) אחראי על אובדן וירוסים פוטנציאליים במהלך הליך הטיהור.</li>
	<li>לטפל lysate התא עם נוקליאז בנזונס (175 יחידות / מ"ל) + 2 mM MgCl2 (1 M מלאי = 2 μL / מ"ל), מערבולת, דגירה במשך 30 דקות ב 37 °C (69 °F). מניחים את הצינור על קרח ולבצע את השלבים הבאים ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>גלולה פסולת התא על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה.<ol>
<li>סובב את lysate התא ב 300 גרם במשך 10 דקות.</li>
		<li>לאסוף את supernatant בצינור צנטריפוגה חרוט חדש 50 מ"ל (להשעות מחדש את גלולת התא ב 0.5 מ"ל של VB, לייעד אותו כמו גלולה-1, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לשימוש בשלב 2.3.5; ראה איור 1).</li>
		<li>סובב את supernatant (הושג בשלב 2.3.2) שוב ב 500 גרם במשך 10 דקות.</li>
		<li>לאסוף את supernatant בצינור צנטריפוגה חרוט חדש 50 מ"ל (להשעות מחדש את גלולת התא ב 0.5 מ"ל של VB, לייעד אותו כמו גלולה-2, ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס לשימוש בשלב 2.3.5; ראה איור 1).</li>
		<li>שלב את גלולה-1 מושעה מחדש (מ 2.3.2) ו pellet-2 (מ 2.3.4) לתוך צינור צנטריפוגה חדש 1.7 מ"ל, מערבולת / sonicate (אמבט מים) 2x, ולהסתובב ב 400 גרם במשך 10 דקות. לאסוף את supernatant ולשלב אותו עם supernatant שהושג בשלב 2.3.4; ראו איור 1). הערה: בצע sonication במשך דקה אחת באמצעות 40 kHz, 120 V כוח כדי למנוע צבירה ויראלית לפני הליך הסינון בשלב 2.4. קח aliquot 50 μL של supernatant בשילוב עבור titration בסעיף 3.</li>
	</ol></li>
	<li>סנן את supernatant בשילוב (~ 21 מ"ל, כלומר, 20 מ"ל מ 1.4.6, 0.5 מ"ל מ 2.3.2, ו 0.5 מ"ל מ 2.3.4) באמצעות שיטת סינון 3 שלבים הבאה.<ol>
<li>לצייר 21 מ"ל של supernatant באמצעות 10 מ"ל מזרק (5-7 מ"ל בכל פעם למעבר קל דרך המסנן) ולהעביר אותו דרך סטרילי 5 מיקרומטר פוליווינילידן difluoride (PVDF) מסנן קרום להציב על צינור חדש 50 mL צנטריפוגה חרוטית (שכותרתו TUBE 1).<ol>
<li>הוסף 1 מ"ל של VB לצינור צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל התרוקן ב 2.4.1 (כדי לאסוף את כמות העקבות הנותרת של וירוס supernatant), מערבולת, ולעבור דרך אותו מסנן PVDF 5 מיקרומטר להציב על TUBE 1 (להביא את הסכום הכולל ל 22 מ"ל של סינון). המשך לשלב 2.4.2.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לצייר 22 מ"ל של הסינון מ TUBE 1 (כמו ב 2.4.1) ולהעביר אותו דרך סטרילי 0.8 מיקרומטר מעורב תאית אסתר (MCE) מסנן קרום ממוקם על צינור חדש 50 mL צנטריפוגה חרוט (שכותרתו TUBE 2).<ol>
<li>הוסף 1 מ"ל של VB ל TUBE 1 התרוקן בשלב 2.4.2, מערבולת, ולהעביר אותו דרך אותו מסנן MCE 0.8 מיקרומטר ממוקם על TUBE 2 (להביא את הסכום הכולל ל 23 מ"ל של סינון). המשך לשלב 2.4.3.</li>
		</ol>
</li>
		<li>לצייר 23 מ"ל של סינון מ TUBE 2 (כמו ב 2.4.1) ולהעביר אותו דרך מסנן סטרילי 0.45 מיקרומטר PVDF ממוקם על צינור חדש 50 mL צנטריפוגה חרוט (שכותרתו TUBE 3).<ol>
<li>הוסף 1 מ"ל של VB כדי TUBE 2 התרוקן בשלב 2.4.3, מערבולת, ולהעביר אותו דרך אותו מסנן PVDF 0.45 מיקרומטר ממוקם על TUBE 3 (להביא את הסכום הכולל ל 24 מ"ל של סינון). הערה: קח aliquot 50 μL של הסינון עבור titration בסעיף 3.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>צנטריפוגה במהירות גבוהה בשיטת שיפוע סוכרוז הערה: בפרוטוקול זה נעשה שימוש ברוטור F13-14x50cy בזווית קבועה. הן הרוטור והן הצנטריפוגה חייבים להיות ב 4 מעלות צלזיוס לפני שתמשיך עם השלבים הבאים.<ol>
<li>הוסיפו 10 מ"ל של תמיסת סוכרוז קרה כקרח ומסוננת סטרילית של 25% (שהוכנה על ידי המסת 25 גרם של אבקת סוכרוז ב-100 מ"ל של תמיסת מלח מאוזנת של האנק) בצינור צנטריפוגה חרוט חדש של 50 מ"ל.</li>
		<li>לאט (3 מ"ל / דקה) להוסיף 24 מ"ל של סינון הנגיף (המתקבל משלב 2.4.3.1) על גבי שכבת סוכרוז. יש להקפיד על שכבות נפרדות של סינון הנגיף ותמיסת סוכרוז. הערה: עד 30 מ"ל של שכבת הנגיף ניתן להוסיף מעל 10 מ"ל של פתרון סוכרוז.</li>
		<li>צנטריפוגה הצינור במשך 90 דקות ב 22,620 גרם ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>הסר את supernatant ואת שכבת סוכרוז מצינור צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל. הערה: גלולת הווירוס צריכה להיות לבנבן. קח aliquot 50 μL של supernatant ו 50 μL aliquot של שכבת סוכרוז עבור טיטרציה בסעיף 3.</li>
	</ol></li>
	<li>להשעות מחדש את גלולה ב 10% גליצרול / PBS פתרון.<ol>
<li>הוסף 1 מ"ל של גליצרול סטרילי 10% (מדולל ב- PBS) לצינור צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל כדי לכסות את גלולה. הערה: כמות התערובת המושעית מחדש יכולה להשתנות (כגון 0.8-1.2 מ"ל) בהתאם לגודל גלולה. נפח קטן יותר ייתן ריכוז גבוה יותר של וירוס.</li>
		<li>מניחים את צינור צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל על קרח במשך 2-4 שעות. במהלך תקופה זו, sonicate / מערבולת גלולה כל 15 דקות במשך 30 s כדי לעזור לעקור / להשעות מחדש את גלולה.</li>
		<li>לאסוף את גלולה מושעה מחדש (1 מ"ל של 10% גליצרול / PBS + גודל גלולה יביא את הנפח הכולל ~ 1.3 מ"ל) בצינור מיקרוצנטריפוגה 2 מ"ל. [אופציונלי: להוסיף עוד 0.3 מ"ל של 10% גליצרול / PBS לאותו צינור צנטריפוגה חרוט 50 מ"ל כדי לאסוף את כמות העקבות הנותרת של גלולה, צינור למעלה ולמטה, ולשלב עם גלולה מושעה מחדש בשלב 2.6.3 להביא את הנפח הכולל ~ 1.6 mL.]<ol>
<li>אם ההשעיה בשלב 2.6.3 היא עכורה או מעוננת (עקב פסולת תאים), צנטריפוגה הצינור ב 500 גרם במשך 10 דקות, להעביר את supernatant לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש 2 מ"ל, ולהמשיך לשלב 2.6.4.</li>
		</ol>
</li>
		<li>קח aliquot 50 μL עבור טיטרציה oHSV בסעיף 3. Aliquot שאר הפתרון (250 μL / aliquot) לתוך צינורות microcentrifuge סטרילי עם כובעי בורג (אטום היטב לאחסון לטווח ארוך), הצמד להקפיא, ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש (מוכן למחקרים ניסיוניים לאחר titer oHSV נקבע). הערה: יש להלבין או לטפל בכל החומרים שבאים במגע עם הנגיף בקרינה אולטרה סגולה לפני ההסרה מהמכסה המנוע או ההשלכה.</li>
	</ol></li>
</ol>3. oHSV טיטרציה וקלע פלאק
<ol><li>זרעים 1.7-1.8 x 105 תאי Vero /well בלוח תרבית תאים של 6 בארות במדיום תאי Vero (DMEM עם 10% IFCS; ראה שלב 1.1). הערה: ודא כי התאים מופצים הומוגנית ברחבי הבאר; לא מערבולת הצלחת, אשר יכול לגרום הצטברות של תאים באמצע בארות. כדי למנוע מערבולת, לאט לטלטל את הצלחת ביד אנכית, ואז אופקית, ולאחר מכן בעדינות למקם את הצלחת באינקובטור.</li>
	<li>למחרת (כאשר התאים מגיעים 70-80% מפגש), לשאוף את המדיום התרבותי, ולהוסיף 1 מ"ל / באר של PBS גלוקוז גבוהה בתוספת 1% IFCS. השאירו את הצלחת במכסה המנוע של תרבות התאים עד להשלמת שלב 3.3.</li>
	<li>לדלל את הנגיף באופן סדרתי בצינורות פוליפרופילן 5 מ"ל באמצעות PBS/1% IFCS (איור 3). הערה: השתמש aliquot μL 50 שנאספו בשלב 2.6.4 לדילול סדרתי. בצינור 1st (10-3 דילול), להוסיף 2 μL של הנגיף ב 1998 μL של PBS / 1%IFCS, מערבולת. בצינור2 nd (10-5 דילול), לקחת 10 μL מצינור 1st ב 990 μL של PBS / 1% IFCS, מערבולת. בצינור3 rd (10-6 דילול), לקחת 100 μL מן הצינור2 nd ב 900 μL של PBS / 1% IFCS, מערבולת; המשיכו בדילול סדרתי זה של פי 10 עד לדילול של10-9. ראו את הפרטים באיור 3.</li>
	<li>לשאוף PBS/1% IFCS, ולהוסיף 0.7 מ"ל / באר של הווירוס בדילול סדרתי (החל מ 10-5 עד 10-9) לתאי Vero. הערה: אל תתנו לתאים להתייבש.</li>
	<li>בעדינות לטלטל את הצלחת על נדנדה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (כדי להבטיח הפצה הומוגנית של אינוקולום הנגיף).</li>
	<li>דגירה את הצלחת במשך 1.5 שעות ב 37 מעלות צלזיוס. הערה: במהלך תקופת דגירה זו, להכין 1:1000 דילול של אימונוגלובולין אנושי G (IgG) ב DMEM בתוספת 1% IFCS. עבור צלחת 6-well, להכין 12.5 מ"ל, כך 2 מ"ל / באר ניתן להשתמש בשלב 3.7. להתאים את הדילול כדי להסביר וריאציות הרבה IgG האנושי.</li>
	<li>הסר את הנגיף inoculum מן הבארות, ולהוסיף 2 מ"ל / באר של 0.1% אנושי IgG (כדי לנטרל את oHSV במדיום התרבות ולמנוע היווצרות של לוחות משניים) ב DMEM בתוספת 1% IFCS. דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ימים. הערה: לוחות ברורים נוצרים בדרך כלל ב- 3 ימים.</li>
	<li>תיקון וכתמים של צלחות<ol>
<li>הסר את supernatant, ולתקן את התאים מתנול טהור (1 מ"ל / טוב) במשך 5 דקות. מוציאים את המתנול, ומאפשרים ללוחות להתייבש באוויר.</li>
		<li>לדלל כתם Giemsa (1:5) עם מים deionized, ולהוסיף 1 מ"ל של כתם Giemsa מדולל לכל באר. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 10 - 15 דקות.</li>
		<li>מוציאים את הכתם, שוטפים במי ברז ומאפשרים ללוחות להתייבש באוויר.</li>
		<li>לספור את הלוחות באמצעות מיקרוסקופ מנתח.</li>
		<li>אופציונלי עבור oHSVs עם ביטוי lacZ:<ol>
<li>הסר את supernatant, ולתקן את התאים עם קר 0.2% glutaraldehyde/2% paraformaldehyde במשך 5-10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
			<li>הסר את הפתרון המתקן, ולשטוף את התאים 3x עם PBS.</li>
			<li>מוסיפים את פתרון X-gal לתאים (1 מ"ל / טוב), ומדגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 2 שעות. הערה: יש להכין את כתם ה-X-gal טרי ביום הכתמים; אחסון לטווח ארוך עלול להוביל לדהיית צבע. ראה הכנת פתרון X-gal בטבלה 1.</li>
			<li>מוציאים את כתם ה-X-gal, ושוטפים את הצלחת במי ברז למשך דקה.</li>
			<li>כתם נגדי עם פתרון אדום ניטרלי (1 מ"ל / טוב) במשך 2 דקות בטמפרטורת החדר. הערה: ראה הכנת פתרון אדום ניטרלי בטבלה 1.</li>
			<li>לשטוף את הצלחת עם מי ברז במשך 1 דקות; אפשרו ללוחות להתייבש באוויר.</li>
			<li>ספירת לוחות כחולים באמצעות מיקרוסקופ מנתח(איור 4).</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>חישוב המקש המהינוס באמצעות נוסחה (2) טיטר ב pfu /mL (יחידות יוצרות פלאק) = מספר לוחות /0.7 מ"ל × גורם דילול (2) הערה: לדוגמה, אם נמצאו 25 לוחות בבאר הדילול 10-9, הטיטר הוא 25/0.7 × 109 = 35.7 × 109 = 3.57 × 1010 pfu/mL. זהו טיטר oHSV הסופי של aliquots מוכן בשלב 2.6.4.</li>
</ol>

<ol><li>Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+oncolytic+virotherapy+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).</li>
<li>Zhang, S., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discovery+and+development+of+oncolytic+viruses%3A+are+they+the+future+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy.</a> Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).</li>
<li>Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+herpes+simplex+viruses+as+a+paradigm+for+the+treatment+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cancer+Biology%22%5BJournal%5D)">Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer.</a> Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).</li>
<li>Peters, C., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+herpes+viruses+as+oncolytics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy-Oncolytics%22%5BJournal%5D)">Designing herpes viruses as oncolytics.</a> Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010(2015).</li>
<li>Nguyen, H. -M., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+state+of+oncolytic+herpes+simplex+virus+for+glioblastoma+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Oncolytic+Virotherapy%22%5BJournal%5D)">The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment.</a> Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).</li>
<li>Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HSV-1+oncolytic+viruses+from+bench+to+bedside%3A+an+overview+of+current+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials.</a> Cancers. 12 (12), 3514(2020).</li>
<li>Menotti, L., Avitabile, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+oncolytic+immunovirotherapy%3A+the+blossoming+branch+of+multimodal+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310(2020).</li>
<li>Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+virus+encoding+a+master+pro-inflammatory+cytokine+interleukin+12+in+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy.</a> Cells. 9 (2), 400(2020).</li>
<li>Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncolytic+herpes+simplex+virus+engineering+and+preparation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation.</a> Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).</li>
<li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+propagation%2C+titration+and+single-step+growth+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441(2019).</li>
<li>Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+growth%2C+preparation%2C+and+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus growth, preparation, and assay.</a> Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).</li>
<li>Froechlich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrity+of+the+antiviral+STING-mediated+DNA+sensing+in+tumor+cells+is+required+to+sustain+the+immunotherapeutic+efficacy+of+herpes+simplex+oncolytic+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus.</a> Cancers. 12 (11), 3407(2020).</li>
<li>Froechlich, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+novel+mesothelin-targeted+oncolytic+herpes+virus+and+implemented+strategies+for+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477(2021).</li>
<li>Mosca, J. D., Pitha, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+and+posttranscriptional+regulation+of+exogenous+human+beta+interferon+gene+in+simian+cells+defective+in+interferon+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis.</a> Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).</li>
<li>Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleic+acid+impurity+reduction+in+viral+vaccine+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+International%22%5BJournal%5D)">Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing.</a> BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).</li>
<li>Herpes simplex virus: methods and protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Diefenbach, R. J., Fraefel, C. , Humana Press. New York, USA. (2014).</li>
<li>Hadi, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+trial+to+prepared+%CE%B31+34.5+herpes+simplex+virus+1+immunogene+by+cloning+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Systematic+Review+Pharmacy%22%5BJournal%5D)">An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique.</a> Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).</li>
<li>Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flip-Flop+HSV-BAC%3A+bacterial+artificial+chromosome+based+system+for+rapid+generation+of+recombinant+herpes+simplex+virus+vectors+using+two+independent+site-specific+recombinases%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases.</a> BMC Biotechnology. 6, 40(2006).</li>
<li>Motamedifar, M., Noorafshan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytopathic+effect+of+the+herpes+simplex+virus+type+1+appears+stereologically+as+early+as+4+h+after+infection+of+Vero+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells.</a> Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).</li>
<li>Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus%3A+propagation%2C+quantification%2C+and+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage.</a> Current Protocols in Microbiology. , Chapter 14, Unit 14E 1(2005).</li>
<li>Malenovska, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+stabilizers+and+rates+of+freezing+on+preserving+of+structurally+different+animal+viruses+during+lyophilization+and+subsequent+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage.</a> Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).</li>
<li>Vahlne, A. G., Blomberg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+herpes+simplex+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Purification of herpes simplex virus.</a> Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).</li>
<li>Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+herpes+simplex+virus+type+1+by+density+gradient+centrifugation+and+estimation+of+the+sedimentation+coefficient+of+the+virion%5BTitle%5D)+AND+%22APMIS%3A+Acta+Pathologica%2C+Microbiologica%2C+et+Immunologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion.</a> APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).</li>
<li>Mundle, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-purity+preparation+of+HSV-2+vaccine+candidate+ACAM529+is+immunogenic+and+efficacious+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo.</a> PLoS One. 8 (2), 57224(2013).</li>
<li>Jiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilized+cobalt+affinity+chromatography+provides+a+novel%2C+efficient+method+for+herpes+simplex+virus+type+1+gene+vector+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification.</a> Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).</li>
<li>Grosche, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herpes+simplex+virus+type+1+propagation%2C+titration+and+single-step+growth+curves%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves.</a> Bio-protocol. 9 (23), 3441(2019).</li>
<li>Svennerholm, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+herpes+simplex+virus+virions+and+nucleocapsids+on+Percoll+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients.</a> Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).</li>
<li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+concentration+determination+through+plaque+assays%3A+using+traditional+and+novel+overlay+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065(2014).</li>
<li>Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+targeting+of+herpes+simplex+virus+for+cell-specific+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication.</a> Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).</li>
<li>Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+titrate+herpes+simplex+virus-1+%28HSV-1%29+using+laser-based+scanning+of+near-infrared+fluorophores+conjugated+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies.</a> Frontiers in Microbiology. 8, 1085(2017).</li>
</ol>

SDR הוא ממציא שותף על פטנטים הקשורים וירוסים הרפס סימפלקס oncolytic, בבעלות ומנוהל על ידי אוניברסיטת ג'ורג'טאון ובית החולים הכללי של מסצ'וסטס, אשר קיבלו תמלוגים אמגן ActiVec Inc. והוא על המועצה המדעית המייעצת של EG 427. למחברים האחרים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול מתחיל עם הצמיחה של oHSV בתאי Vero מעבר נמוך. המפגש של monolayer תא Vero צריך להיות ~ 80% בזמן חיסון וירוס כמו תאים מגודלים יכולים לפתח מבנים סיביים הדוקים שיכולים להפחית את כניסת oHSV לתאי Vero20. לאחר 90-100% CPE נצפתה, supernatant התרבות מוסרת, תאים נקצרים, respended ב VB / supernatant (ראה שלב 1.4.6), הצמד קפוא, ומאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס לטיהור מאוחר יותר. בלאהו ועמיתיו השתמשו בשיטה שונה במקצת של קציר ואחסון של תאי Vero נגועים. לדוגמה, הבקבוקים המכילים את התאים ואת התקשורת התרבותית (...

וירוסים אונקוליטיים (OVs) הם צורה מתפתחת וייחודית של אימונותרפיה של סרטן. OVs לשכפל באופן סלקטיבי תאים סרטניים lyse (חוסך תאים נורמליים / בריאים)1 תוך גרימת חסינות אנטי גידול2. וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי (oHSV) הוא אחד הווירוסים שנחקרו בהרחבה ביותר בקרב כל OVs. זה הרחוק ביותר יחד במרפאה, עם Talimogene laherparepvec (T-VEC) להיות OV הראשון והיחיד לקבל אישור ה-FDA בארה"ב לטיפול במלנומה מתקדמת3. בנוסף ל- T-VEC, oHSVs מהונדסיםגנטיתרבים אחרים נבדקים באופן פרה-קליני וקליני בסוגי סרטן שונים 3,4,5,6,7,8. הביוטכנולוגיה הנוכחית המתקדמת של דנ"א רקומביננטי הגדילה עוד יותר את ההיתכנות של קידוד oHSVs חדש עבור transgene(s)טיפולית 3,5. מערכת יעילה של התפשטות oHSV, טיהור, וקביעת טיטר הוא קריטי לפני כל (שפותח לאחרונה) oHSV ניתן לבדוק במבחנה ובמחקרים vivo. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה צעד אחר צעד של צמיחת oHSV (בתאי Vero), טיהור (בשיטת ההדרגתית של סוכרוז) ו titration (על ידי בדיקת לוח oHSV בתאי Vero) (איור 1). זה יכול להיות מאומץ בקלות בכל Biosafety רמה 2 (BSL2) הגדרת מעבדה כדי להשיג מלאי ויראלי באיכות גבוהה למחקרים פרה-קוליניים.
ורו, קו תאי כליה של קוף ירוק אפריקאי, הוא קו התאים הנפוץ ביותר להפצת oHSV9,10,11,12,13 כמו תאי Vero יש מסלול איתות אנטי ויראלי פגום14. קווי תאים אחרים עם גירוי מומת של גנים אינטרפרון (STING) איתות יכול לשמש גם לצמיחה oHSV12,13. פרוטוקול זה מנצל תאי Vero לצמיחה oHSV ו פלאק assay. לאחר התפשטות, תאים נגועים oHSV נקצרים, lysed, ונתון לטיהור, שבו תאים lysed מטופלים תחילה עם גרעין בנזונזה כדי להשפיל את ה-DNA של התא המארח, למנוע הצטברות חומצה גרעינית חלבון, ולהפחית את הצמיגות של ליסט התא. כמו הפעלה נכונה של בנזונאס לעתים קרובות דורש Mg2+, 1-2 mM MgCl2 משמש בפרוטוקול זה15. פסולת התא המארח מן lysate התא שטופלו בנזונז הוא בוטל עוד יותר על ידי סינון סדרתי לפני צנטריפוגה במהירות גבוהה סוכרוז שיפוע. כרית פתרון סוכרוז צמיג 25% מסייעת להבטיח קצב איטי יותר של נדידת וירוסים דרך שכבת סוכרוז, משאיר רכיבים הקשורים לתא המארח ב supernatant, ובכך לשפר את הטיהור והגבלת אובדן וירוסים גלולה16. oHSV מטוהרים לאחר מכן titrated על תאים Vero, לוחות ויראליים הם דמיינו על ידי Giemsa מכתים17 או X-gal כתמים (עבור LacZ קידוד oHSVs)18.

<table><tbody><tr><td>צינורות צנטריפוגה 1.7 מ"ל צינורות צנטריפוגה</td><td>סיגמא</td><td>CLS3620</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות צנטריפוגה פוליפרופילן</td><td>פלקון</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל</td><td></td> צינורות צנטריפוגה <td>פוליפרופילן פלקון</td> 352063 <td></td></tr><tr><td>50 מ"ל</td><td>פלקון</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>צלחות תרבית תאים 6 בארות</td><td>פלקון</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>בנזונאז נוקלאז</td><td>סיגמא</td><td>E8263-25KU</td><td></td></tr><tr><td>מגרד תאים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>179693</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד</td><td>סיגמא</td><td>D2650-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle בינוני</td><td>קורנינג</td><td>MT-10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s פוספט חוצץ</td><td>מלח קורנינג</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Hyclone</td><td>SH3007003</td><td></td></tr><tr><td>Giemsa Stain</td><td>Sigma</td><td>G3032</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-262-23</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS)</td><td>קורנינג</td><td>MT-21-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>דולקו בעל גלוקוז גבוה s Phosphate-buffered</td><td>Sagma</td><td>D4031</td><td></td></tr><tr><td>Human Immune globulin</td><td>Gamastan</td><td>NDC 13533-335-12</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>Fisher Chemical</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>מסנן עיקור מדיה, 250 מ"ל</td><td>Nalgene, Fisher Scientific</td><td>09-740-25E</td><td></td></tr><tr><td>מסנן עיקור מדיה, 500 מ"ל</td><td>Nalgene, Fisher Scientific</td><td>09-740-25C</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה אדומה ניטרלית</td><td>Sigma</td><td>N4638</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher מדעי</td><td>&nbsp; 15710S</td><td></td></tr><tr><td>נדנדת צלחת</td><td>פישר</td><td>88861043</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פריטיאניד</td><td>Sigma</td><td>P8131</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פרוציאניד</td><td>סיגמא</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר כימיקל</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>סורוול ST 16R צנטריפוגה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75004381</td><td></td></tr><tr><td>סורוול ST 21R צנטריפוגה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>75002446</td><td></td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה סטריליים עם מכסי בורג</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-371</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק סוכרוז</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>, מסנן מזרק SLHV033RS</td><td></td><td></td>0.45 PVDF <td>MilliporeSigma</td></tr><tr><td>, 0.8 MCE</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLAA033SS</td><td></td></tr><tr><td>מסנן מזרק, 5 ומיקרו; m PVDF</td><td>Milliporeבקבוק תרבית Sigma</td><td>SLSV025LS</td><td></td></tr><tr><td>T150</td><td>Falcon</td><td>355001</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>MP Biomedicals LLC</td><td>816116</td><td></td></tr><tr><td>אמבט מים אולטרסאונד</td><td>ברנסון</td><td>CPX-952-116R</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>קורנינג</td><td>46-101-RF</td><td></td></tr></tbody></table>

צמיחה, טיהור, ו titration של וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי

Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus

וירוסים אונקוליטיים (OVs), כגון וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי (oHSV), הם אסטרטגיית טיפול הגדלה במהירות בתחום האימונותרפיה של סרטן. OVs, כולל oHSV, לשכפל באופן סלקטיבי ולהרוג תאים סרטניים (חוסך תאים בריאים / נורמליים) תוך גרימת חסינות נגד גידולים. בשל תכונות ייחודיות אלה, אסטרטגיות טיפול מבוססות oHSV נמצאות בשימוש הולך וגובר לטיפול בסרטן, פרה-קלינית וקלינית, כולל talimogene laherparevec (T-Vec) שאושר על ידי ה-FDA. צמיחה, טיהור, טיטרציה הן שלוש טכניקות מעבדה חיוניות עבור כל OVs, כולל oHSVs, לפני שהם יכולים להיות מנוצלים למחקרים ניסיוניים. מאמר זה מתאר שיטה פשוטה שלב אחר שלב להגברת oHSV בתאי Vero. כמו oHSVs להכפיל, הם מייצרים אפקט ציטופתי (CPE) בתאי Vero. פעם 90-100% מהתאים הנגועים מראים CPE, הם נקצרים בעדינות, מטופלים עם בנזיונז ומגנזיום כלורי (MgCl2), מסוננים, ונתון לטיהור בשיטת ההדרגתית סוכרוז. לאחר הטיהור, מספר oHSV זיהומיות (המיועד כיחידות יוצרות פלאק או PFUs) נקבע על ידי "פלאק assay" בתאי Vero. הפרוטוקול המתואר בזאת יכול לשמש להכנת מלאי oHSV גבוה טיטר למחקרים במבחנה בתרבית התא בניסויים בבעלי חיים vivo.

סקירה קצרה של הפרוטוקול כולו מתוארת באיור 1, המייצג את הצעדים הקריטיים הכרוכים בצמיחה, טיהור וטייטרציה של oHSV. CPE בתאי Vero ניתן לזהות כבר 4 שעות לאחר זיהום HSV19. איור 2 מדגים CPE בתאי Vero בשלוש נקודות זמן שונות בעקבות זיהום oHSV. רמת ה- CPE גדלה עם הזמן. בפרוטוקול זה, 90-100% CPE נצפתה בדרך כלל בתוך 48 שעות של חיסון oHSV moI נמוך (וזה הזמן הטוב ביותר לקצור תאים לטיהור). עם זאת, זה יכול לקחת עד 4 ימים בהתאם MOI oHSV מחוסן בשלב 1.2 ו/א...

בכתב יד זה, אנו מתארים שיטה פשוטה של צמיחה, טיהור, ו titration של וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי לשימוש פרה-קוליני.

צמיחה, טיהור, ו Titration של וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי

Oncolytic viruses (OVs), such as&#160;the&#160;oncolytic herpes simplex virus (oHSV), are a rapidly growing treatment strategy in the field of cancer ...

וירוס הרפס סימפלקס oncolytic הוא צורה המתעוררים של אימונותרפיה סרטן. מערכת יעילה של התפשטות וירוסים, טיהור ונחישות טיטרית היא קריטית לשימוש במחקרים ניסיוניים. שיטה זו היא פשוטה מאוד וניתן לאמץ בקלות בכל biosafety רמה שתיים הגדרת מעבדה כדי לקבל מלאי ויראלי באיכות גבוהה למחקרים פרה-קוליניים.ייצור של איכות גבוהה, מלאי ויראלי טהור הוא חיוני שכן הוא משמש לחקר התגובה החיסונית נגד סרטן ולפתח צורה חדשה של אימונותרפיה סרטן מבוסס וירוס. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לטהר כל וירוס הרפס סימפלקס מסוג פראי או מהונדס גנטית. פרוטוקול זה צריך להיות קל לקריאה וקל לעקוב אחר אדם שמעולם לא ביצע טכניקה זו לפני.החומרים הרשומים ריאגנטים צריך להיות במקום לפני שניסה טכניקה זו בפעם הראשונה. התחילו בשטיפת צלושי T-150 ס"מ רבועים עם DPBS גלוקוז גבוה פי שניים בתוספת 1%IFCS. לשאוף את DPBS ולהוסיף שבעה מיליליטר של אינוקולום וירוס לכל בקבוק.בעדינות לנענע את הבקבוקים במשך חמש דקות דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 1.5 עד 2 שעות. לאחר מכן, להסיר את inoculum ולהוסיף 25 מיליליטר של DMEM בתוספת 1%IFCS לכל בקבוק. לאחר הדגירה ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך יומיים עד ארבעה ימים, לאסוף 20 מיליליטר של התרבות supernatant מכל בקבוק לתוך צינורות צנטריפוגה 50 מיליליטר.באמצעות מגרד תאים, לגרד את התאים מתחתית הבקבוקים. הוסף כ 15 מיליליטר של תרבות שנאסף בעבר supernatant לכל בקבוקון כדי להביא את הנפח עד 20 מיליליטר, ולאחר מכן להשתמש פיפטה סרולוגית סטרילית 10 מיליליטר לשטוף בעדינות את החלק התחתון של הבקבוקים כמה פעמים. לאסוף את התאים עם בינוני לתוך צינורות צנטריפוגה חרוט 50 מיליליטר להציב על קרח.צנטריפוגה הצינורות ב 300 פעמים G במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. Resuspend כל גלולה ביסודיות 1.25 מיליליטר של מאגר וירוסים, או VB, ו 1.25 מיליליטר של תרבות שנאספו בעבר supernatant. מערבבים את כל כדורי resuspended לתוך צינור אחד צנטריפוגה חרוט 50 מיליליטר.הצמד להקפיא את התאים בשימוש חוזר באמצעות קרח יבש ו 100% אתנול ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס. להפשיר את התאים הקפואים שנשברו בעבר באמבט מים חמים ב 37 מעלות צלזיוס sonicate במשך דקה אחת במשך שלושה מחזורים באמבט מים. הוסף 175 יחידות של נוקליאז בנזונס ושני מיקרוליטרים של שני מגנזיום כלוריד מילימולאר למיליליטר של ליסט התא ומערבולת.לאחר דגירה של 30 דקות ואמבט מים חמים ב 37 מעלות צלזיוס, מניחים את הצינור על קרח. לסובב את התא lysate ב 300 פעמים G במשך 10 דקות. לאסוף את supernatant בצינור צנטריפוגה חרוט 50 מיליליטר חדש resuspend גלולת התא ב 500 microliters של VB. לייעד אותו ככדור אחד.סובב את supernatant שנאסף שוב ב 500 פעמים G במשך 10 דקות ולאחסן את supernatant בנפרד בצינור צנטריפוגה חרוט טרי 50 מיליליטר לשימוש מאוחר יותר. Resuspend גלולת התא ב 500 microliters של VB, ייעוד זה כמו גלולה שתיים. לשלב את גלולה resuspended אחד גלולה שתיים בצינור צנטריפוגה חדש 1.75 מיליליטר ומערבולת sonicate פעמיים באמבט מים לפני ספינינג הצינורות ב 400 פעמים G במשך 10 דקות.לאסוף את supernatant מצינור צנטריפוגה 1.7 מיליליטר ולשלב אותו עם supernatant שנאסף בעבר צינור צנטריפוגה חרוט 50 מיליליטר. לסנן את supernatant דרך מסנן קרום PVDF סטרילי חמישה מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה 50 מיליליטר חדש שנקרא צינור אחד. הוסף מיליליטר אחד של VB לצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר, התרוקן לאחר סינון supernatant מהצעד הקודם, מערבולת, ולהעביר אותו דרך אותו מסנן קרום PVDF להציב על צינור אחד.להעביר את הסינון מצינור אחד דרך מסנן קרום MCE סטרילי 0.8 מיקרומטר ממוקם על צינור צנטריפוגה חדש 50 מיליליטר בשם צינור שתיים. הוסף מיליליטר אחד של VB לצינור מרוקן אחד, מערבולת, ולהעביר אותו דרך אותו מסנן MCE ממוקם על צינור 2. מעבירים את הסינון מצינור 2 דרך מסנן PVDF סטרילי של 0.45 מיקרומטר שהונח על צינור צנטריפוגה חדש של 50 מיליליטר עם תווית צינור שלוש.כפי שתואר קודם לכן, לחזור על שטיפת צינור 2 עם מיליליטר אחד של VB להוסיף סינון צינור שלוש. בניתוח מייצג זה, ניתן היה לראות את האפקט הציטופתי בתאי Vero ב 36, 48, ו 72 שעות לאחר זיהום oHSV עם עיגול של התאים המושפעים. הרמה ההולכת וגדלה של CPE לאורך זמן ניכרת כפי שהיא מוצגת על-ידי ביטוי mCherry.ב 72 שעות לאחר ההדבקה, לוחות ויראליים היו מוכתמים X-גל לדמיין oHSVs עם ביטוי lacZ. קרצוף בעדינות את התאים נגועים בווירוס בעדינות לשטוף את החלק התחתון על הבקבוק הוא קריטי כדי לשמור על כל התא הנגוע HSV שלם, כך מלאי נגיפי טיטר גבוה ניתן להשיג.

growth-purification-and-titration-of-oncolytic-herpes-simplex-virus

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

פרוטוקול מהיר, פשוט וחסכוני עבור הדור של התורם הנגזרות multivirus ספציפי ההרג (rCTL) עבור עירוי כדי allogeneic hematopoietic בתאי גזע להשתלה (HSCT) מקבלי בסיכון לפתח זיהומים CMV, עו"ד או EBV. תהליך הייצור GMP תואמי וצריך להבטיח את יישום רחב יותר של חיסוני T-cell מעבר במרכזים מיוחדים.

דור Multivirus ספציפיים תאים T כדי למנוע / לטפל זיהומים נגיפיים לאחר השתלת allogeneic תא גזע hematopoietic

וירוסים oncolytic הם מבטיחים סרטן ותרופות. היכולת לוודא את infectability של דגימות רקמה חיה המתקבל חולים לפני הטיפול הוא יתרון ייחודי של גישה זו הטיפולי. פרוטוקול זה מתאר כיצד תהליך רקמות...

Ex Vivo זיהום של רקמה חיה עם וירוסים oncolytic

אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי תפקידי מפתח של מולקולות איתות מארחת בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס מודל, גמא 68 ההרפס (γHV68). ניצול זני עכבר מהונדס גנטי ופיברובלסטים עובריים לשכפול ממוסס γHV68, הפרוטוקול מאפשר גם אפיון פנוטיפי וחקירה מולקולרית של אינטראקציות וירוסים מארחים בשכפול ממוסס נגיפי.

אינטראקצית מארח וירוס ביתור בשכפול של וירוס ההרפס ממוסס דגם

הפרוטוקול מתאר את מערכת מודל יעיל לשחזור ללמוד הרפס סימפלקס סוג הנגיף 1 (HSV-1) ההשהיה מחדש. Assay מעסיקה הומוגניות תרבויות נוירונים אוהדים ומאפשר לנתיחה מולקולרית של וירוסים נוירונים אינטראקציות באמצעות מגוון של כלים, כולל התערבות RNA וביטוי של חלבונים רקומביננטיים.

תא עצב ראשי מערכת התרבות לחקר וירוס הרפס סימפלקס המתנה ו הפעלה מחדש

Source: Tang, N., et al. Generating Recombinant Avian Herpesvirus Vectors with CRISPR/Cas9 Gene Editing. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the clonal isolation and PCR-based screening of recombinant herpesvirus following site-specific excision of a GFP marker. Fluorescence-activated cell sorting is used to isolate non-fluorescent infected cells, and junction PCR confirms retention of the target gene in GFP-negative clones.

Clonal Isolation and PCR Screening of GFP-Excised Recombinant Herpesvirus Retaining the Target Gene

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021).This video demonstrates the propagation and harvesting of oncolytic herpes simplex virus in mammalian cell cultures, highlighting viral entry, replication, and the recovery of virus-loaded cells. It further shows methods for preserving infected cells for downstream processing.

Propagation and Harvesting of Oncolytic Herpes Simplex Virus in Mammalian Cells

Source: Nguyen, H., et al. Growth, Purification, and Titration of Oncolytic Herpes Simplex Virus. J. Vis. Exp. (2021)This video demonstrates the purification of an oncolytic virus from infected mammalian cell cultures using nuclease treatment, sequential centrifugation, membrane filtration, and sucrose cushion centrifugation.

 Oncolytic Virus Purification from Infected Mammalian Cells 

כאן נתאר פרוטוקול להעסקת תפוקה גבוהה ההקרנה RNAi לחשוף את מטרות המארח יכול להיות מניפולציות כדי לשפר את הטיפול וירוס oncolytic, במיוחד rhabodvirus וטיפול וירוס vaccinia, אבל ניתן בקלות להתאים oncolytic אחרים וירוס פלטפורמות או לגילוי גנים המארח לווסת את שכפול וירוס בדרך כלל.

ברמת הגנום RNAi ההקרנה כדי לזהות גורמים מארח לווסת את הטיפול Oncolytic וירוס

פרוטוקול זה מתאר עבודה מפורט עבור הדור של ex-vivo אפיון של וירוסים oncolytic ביטוי של immunomodulators, באמצעות וירוסי חצבת קידוד bispecific תא T engagers כדוגמה. יישום והתאמה וקטור פלטפורמות אחרות, transgenes נאיץ את ההתפתחות של הרומן immunovirotherapeutics לתרגום קליניים.

Paramyxoviruses עבור Immunomodulation, ממוקדות הגידול: הערכה לשעבר Vivo ועיצוב

הפלקה היא שיטה שגרתית המשמשת לכימות וירוסים חיים באוכלוסייה. למרות שהפלקה נלמדת לעתים קרובות בתוכניות לימודים מיקרוביולוגיות שונות עם חיידקים ובקטריופאג'ים, הפלקה של וירוסים יונקים מורכבת יותר וגוזלת זמן רב יותר. פרוטוקול זה מתאר את ההליכים המתפקדים באופן אמין לעבודה רגילה עם וירוסי הרפס סימפלקס.

הפלקה של וירוסי הרפס סימפלקס

פרוטוקול זה מתאר מערכת חוץ גופית למודל זיהום ליטי דה נובו של נגיף ההרפס הקשור לסרקומה של קפוסי באמצעות נגיפים שמקורם ב-BAC16. השיטה מאפשרת לחקור שכפול והפצה מוקדמים של הנגיף. ייצור הנגיף הזיהומי מכומת על ידי בדיקות יחידות זיהומיות מבוססות GFP ו-PCR בזמן אמת של גנומים נגיפיים עטופים.

ביסוס וכימות של זיהום ליטי דה נובו על ידי וירוס הרפס הקשור לסרקומה של קפוסי נטול תאים

למדו שיטה פשוטה לגידול, טיהור וטיטרציה של וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי לשימוש במחקרים טרום-קליניים. הפרוטוקול מתאים למעבדות בטיחות ביולוגית רמה 2 ומייצר מניות ויראליות איכותיות לחקר אימונותרפיה נגד סרטן.

צמיחה, טיהור, ו Titration של וירוס הרפס סימפלקס אונקוליטי

גלה סרטונים נוספים