Name: פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: למדו ליצור פרופיל פוליזום ללא מערכות פיצול אוטומטיות. שיטה זו מאפשרת ניתוח פעילות ריבוזומים בתאים באמצעות הכנת שיפועי סוכרוז ידנית. מתאים לחוקרים בתחומי הביולוגיה התאית והמולקולרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לד"ר פרסי טומבלה ולד"ר מליסה וולס על קריאתם הביקורתית של כתב יד זה. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של ארה"ב לבריאות תוכנית מחקר תוך-מוחית; המכון הלאומי של ארה"ב למדעי בריאות הסביבה (NIEHS; ZIA ES103247 ל- R.E.S).

1. הכנת שיפועים של 7% - 47% סוכרוז
הערה: ניתן לשנות את הטווח הליניארי של מעבר הצבע סוכרוז כדי להשיג הפרדה טובה יותר בהתאם לסוג התא שבו נעשה שימוש. פרוטוקול זה מותאם לפרופילי פוליזום עבור S. cerevisiae.
<ol><li>הכן פתרונות מלאי של 7% ו-47% סוכרוז במאגר הדרגתי של סוכרוז (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2 ו-1 mM DTT). המסנן מעקר את תמיסות מלאי הסוכרוז באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר ומאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הכן 14 מ"ל של 17%, 27% ו-37% פתרונות סוכרוז על-ידי חלוקה וערבוב של פתרונות מלאי של 7% ו-47% סוכרוז באופן המתואר בטבלה 1.</li>
	<li>הנח שש שפופרות צנטריפוגות פוליפרופילן (14 x 89 מ"מ) במדף מבחנות לצפייה מלאה. ודא מספיק רווח בין הצינורות כך שפעולות עם צינור אחד לא יפריעו לאחרים.</li>
	<li>הצמידו מחט ארוכה למזרק 3 מ"ל. עבור פרוטוקול זה, השתמש במחט בגודל 9 אינץ', 22 G עם קצה קהה (איור 1), אך כל מחט ארוכה מספיק כדי להגיע לתחתית צינור הצנטריפוגה תספיק. הערה: יש לבצע בדיקה של מילוי וחלוקה כדי לוודא שהמזרק יכול להכיל את תמיסת הסוכרוז ללא טפטוף לפני הגדרת מעברי הצבע.</li>
	<li>הוסף 2 מ"ל של 7% סוכרוז לתחתית כל צינור צנטריפוגה.</li>
	<li>הוסף 2 מ"ל של 17% סוכרוז מתחת לתמיסת 7% על ידי מיקום קצה המחט בסביבה הקרובה של תחתית הצינור וחלוקת התמיסה לאט ובזהירות.</li>
	<li>חזרו על הפעולה עם 2 מ"ל כל אחד מתמיסות הסוכרוז של 27%, 37% ו-47%. ודאו שכל שכבה ניתנת להבחנה ביניהן באמצעות קו המסמן את הפרדת הצפיפויות (איור 2). הערה: אם לא מתכוונים להשתמש בשיפוע תוך 48 שעות, בשלב זה, לפני התיישבותם לשיפוע רציף, הקפיא את הצינורות עם תמיסות סוכרוז שכבתיות בחנקן נוזלי ואחסן במקפיא של -80 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך.</li>
	<li>יש לאחסן מעברי צבע בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה כדי לאפשר למעברי צבע לשקוע באחוז רציף והולך של סוכרוז. לוקח 8-12 שעות עד שתמיסות הסוכרוז השכבתיות מתמקמות בשיפוע סוכרוז ליניארי. מעברי צבע ליניאריים יציבים עד 48 שעות. אחסון לילה בטמפרטורה של 4°C מספק מספיק זמן להפשרה והתיישבות לתוך שיפוע ליניארי לשימוש בתמיסות סוכרוז קפואות ושכבתיות. השתמש במד צפיפות כדי להעריך את איכות מעבר הצבע. הערה: חיוני לאחסן את מעברי הצבע במקום יציב שבו הם לא יופרעו, מכיוון שכל תנועה או רטט ישבשו את השיפוע.</li>
</ol>2. הכנת תמציות תאי שמרים
<ol><li>לחסן את זן השמרים המעניין לתוך 50 מ"ל של תמצית שמרים פפטון דקסטרוז (YPD) מדיה ולגדול בן לילה ב 30 מעלות צלזיוס באינקובטור רועד לשלב נייח. הערה: הטמפרטורה עשויה להשתנות בהתאם לדרישות זן השמרים.</li>
	<li>העבר 10 מ"ל של תרבית פאזה נייחת לתוך 1 ליטר של מדיית YPD טרייה. דגירה של התאים עם רעידות נמרצות ב 30 מעלות צלזיוס (או טמפרטורה מתאימה אחרת) עד התרבית מגיעה לשלב הצמיחה האמצעי-מעריכי (OD600 = 0.4-0.6).</li>
	<li>בשלב הגדילה האמצעי-אקספוננציאלי, יש להוסיף ציקלוהקסימיד לתרבית בריכוז סופי של 0.1 מ"ג/מ"ל. דגירה על קרח במשך 5 דקות.</li>
	<li>קציר התאים על ידי צנטריפוגה ב 3,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. הערה: בשלב זה, ניתן להקפיא תאים ולאחסן אותם בטמפרטורה של -80 °C.</li>
	<li>החזירו את התאים למאגר מיצוי פוליזום מצונן של 700 μL (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 60 mM KCl, 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1% Triton X-100, 0.1 mg/mL של ציקלוהקסימיד, 0.2 מ"ג/מ"ל של הפרין). הוסף 100 יחידות של מעכב RNase והעבר אותו לצינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל.</li>
	<li>הוסף ~ 400 μL של חרוזי זכוכית מקוררים מראש עם טווח גודל של 425-600 מיקרומטר לצינור הצנטריפוגה. משבשים את תאי השמרים על ידי תסיסה נמרצת במקציף חרוזים למשך 5 דקות.</li>
	<li>להבהיר את ליזאט על ידי צנטריפוגה ב 8,000 x גרם במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>קבע את ריכוז הרנ"א בליזאט המובהר על ידי מדידת הספיגה ב-260 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר או באמצעות מערכת גילוי RNA מבוססת פלואורסצנציה. הערה: למדידות מדויקות מאוד של ריכוז RNA, השתמש בערכות זיהוי RNA מבוססות פלואורסצנציה.</li>
	<li>ודא כי ריכוז RNA הוא 0.5-1 מיקרוגרם / μL. אם ריכוז הרנ"א נמוך מדי, הפחיתו את נפח מאגר מיצוי הפוליסום המשמש להחייאת התאים בניסויים עתידיים. הערה: טען את הליזאט על מעברי הצבע מיד לאחר כמות הליזיס והרנ"א. במידת הצורך, פלאש להקפיא את הליזטים בחנקן נוזלי ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס במשך כמה ימים.</li>
</ol>3. צנטריפוגה של שיפועים
<ol><li>טען בזהירות את הליזאט על החלק העליון של מעברי הצבע. מניחים את קצה הפיפטה על הקיר הפנימי, בחלק העליון של צינור הפוליפרופילן. זווית עדינה את הצינור ופזרו באיטיות את הליזאט על החלק העליון של השיפוע על ידי טפטוף על הקיר. היזהר מאוד לא לשבש או להפריע לשיפוע בעת טעינת הליזאט. הערה: כמות הליזאט שנטען משתנה בהתאם לסוג התא. התוכן של RNA יהיה גם להשתנות. ייתכן שיהיה צורך לבצע מספר ניסויים כדי לקבוע את כמות הליזאט הדרושה ליצירת פרופיל פוליזום אופטימלי. עבור שמרים, 300 מיקרוגרם של RNA היא נקודת התחלה טובה לאופטימיזציה.</li>
	<li>מניחים בעדינות את הצינורות בדליים המצוננים מראש של רוטור דלי מתנדנד. הערה: כל צינור צנטריפוגה מפוליפרופילן צריך להיות בעל נפחים שווים של שיפוע וכמות הליזאט הטעונה. זה יכול להשתנות מצינור לצינור. ודא כי השונות אינה גורמת לשגיאה בחוסר איזון במהלך ultracentrifugation.</li>
	<li>צנטריפוגה שיפועים ב 260,110 x גרם במשך 150 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
</ol>4. שברים ואיסוף נתונים
<ol><li>הסר בזהירות את צינורות הצנטריפוגה מרוטור הדלי המתנדנד והנח אותם במחזיק צינורות.</li>
	<li>תייג את לוחות 96 הבארות כדי לאחסן את השברים ולצנן מראש על קרח. הערה: השתמש בלוח 96 בארות המתאים לספקטרופוטומטר בעל חלון אופטי עד 230 ננומטר לקביעת חומצות גרעין ב-260 ננומטר/280 ננומטר.</li>
	<li>אסוף שברים של 100 μL או 200 μL החל מראש השיפוע על ידי הכנסה קפדנית של קצה פיפט לחלק העליון של מעבר הצבע. אסוף שברים עד שכל מעבר הצבע הוא aliquoted. מספר השברים יהיה תלוי בנפח ההדרגתי הכולל. הערה: אסוף את השברים באופן שאינו משבש את שאר מעבר הצבע. ודא שלכל השברים יש נפח שווה. בנוסף לפיצול ידני, שיטה נוספת בעלות נמוכה לפיצול היא להשתמש במשאבה פריסטלטית קטנה.</li>
	<li>מעבירים כל חלק לצלחת 96 הבאר כדי להגיע לתחתית צינור הצנטריפוגה. שמור את השברים שנאספו על הקרח בכל עת.</li>
	<li>מדוד את הספיגה של כל שבר ב-254 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. השתמש בתמיסות 7% ו- 47% סוכרוז כריקים. הערה: בעת מדידת ספיגת שברים, זכור כי עבור רוב הספקטרומטרים ומדי הצבע, טווח הספיגה היעיל ביותר הוא 0.1-1. אם מדידות הספיגה נמצאות מחוץ לטווח (≥1.0), לשברים יש יותר מדי חומר. לדלל את המדגם, לזכור את הנתונים, ולאחר מכן לקחת בחשבון את גורם הדילול בעת התוויית הפרופיל.</li>
	<li>צור את פרופיל הפוליזום על-ידי התוויית מספר השבר לעומת הספיגה.</li>
</ol>

<ol><li>Choi, A., Barrientos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sucrose+gradient+sedimentation+analysis+of+mitochondrial+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sucrose gradient sedimentation analysis of mitochondrial ribosomes.</a> Methods in Molecular Biology. 2192, Clifton, N.J. 211-226 (2021).</li>
<li>Dos Santos, R. F., Barria, C., Arraiano, C. M., Andrade, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+bacterial+ribosomes+through+sucrose+gradient+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of bacterial ribosomes through sucrose gradient ultracentrifugation.</a> Methods in Molecular Biology. 2106, Clifton, N.J. 299-310 (2020).</li>
<li>Pringle, E. S., McCormick, C., Cheng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+analysis+of+mRNA+and+associated+proteins+engaged+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling analysis of mRNA and associated proteins engaged in translation.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 125 (1), 79(2019).</li>
<li>Liang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome-profiling+in+small+tissue+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Polysome-profiling in small tissue samples.</a> Nucleic Acids Research. 46 (1), 3(2018).</li>
<li>Karamysheva, Z. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+profiling+in+leishmania%2C+human+cells+and+mouse+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Polysome profiling in leishmania, human cells and mouse testis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e57600(2018).</li>
<li>Jin, H. Y., Xiao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Integrated+polysome+profiling+and+ribosome+profiling+method+to+investigate+in+vivo+translatome%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An Integrated polysome profiling and ribosome profiling method to investigate in vivo translatome.</a> Methods in Molecular Biology. 1712, Clifton, N.J. 1-18 (2018).</li>
<li>Chasse, H., Boulben, S., Costache, V., Cormier, P., Morales, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+using+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation using polysome profiling.</a> Nucleic Acids Research. 45 (3), 15(2017).</li>
<li>Aboulhouda, S., Di Santo, R., Therizols, G., Weinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate%2C+streamlined+analysis+of+mrna+translation+by+sucrose+gradient+fractionation%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Accurate, streamlined analysis of mrna translation by sucrose gradient fractionation.</a> Bio-protocol. 7 (19), 2573(2017).</li>
<li>Kudla, M., Karginov, F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+mRNA+translation+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring mRNA translation by polysome profiling.</a> Methods in Molecular Biology. 1421, Clifton, N.J. 127-135 (2016).</li>
<li>Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+selective+mRNA+translation+in+mammalian+cells+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e52295(2014).</li>
<li>Coudert, L., Adjibade, P., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+translation+initiation+during+stress+conditions+by+polysome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Analysis of translation initiation during stress conditions by polysome profiling.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51164(2014).</li>
<li>Panda, A. C., Martindale, J. L., Gorospe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+fractionation+to+analyze+mRNA+distribution+profiles%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-protocol%22%5BJournal%5D)">Polysome fractionation to analyze mRNA distribution profiles.</a> Bio-protocol. 7 (3), 2126(2017).</li>
<li>Chikashige, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gcn2+eIF2alpha+kinase+mediates+combinatorial+translational+regulation+through+nucleotide+motifs+and+uORFs+in+target+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Gcn2 eIF2alpha kinase mediates combinatorial translational regulation through nucleotide motifs and uORFs in target mRNAs.</a> Nucleic Acids Research. 48 (16), 8977-8992 (2020).</li>
<li>Ingolia, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+footprint+profiling+of+translation+throughout+the+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome footprint profiling of translation throughout the genome.</a> Cell. 165 (1), 22-33 (2016).</li>
<li>Ripmaster, T. L., Vaughn, G. P., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DRS1+to+DRS7%2C+novel+genes+required+for+ribosome+assembly+and+function+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">DRS1 to DRS7, novel genes required for ribosome assembly and function in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (12), 7901-7912 (1993).</li>
<li>Lo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+essential+ribosome+assembly+AAA-ATPase+Rix7%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the essential ribosome assembly AAA-ATPase Rix7.</a> Nature Communications. 10 (1), 513(2019).</li>
<li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Borgnia, M. J., Williams, J. G., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Grc3+programs+the+essential+endoribonuclease+Las1+for+specific+RNA+cleavage%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Grc3 programs the essential endoribonuclease Las1 for specific RNA cleavage.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (28), 5530-5538 (2017).</li>
<li>Woolford, J. L., Baserga, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+biogenesis+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ribosome biogenesis in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 195 (3), 643-681 (2013).</li>
<li>Klinge, S., Woolford, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+assembly+coming+into+focus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosome assembly coming into focus.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 20 (2), 116-131 (2018).</li>
<li>Bassler, J., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+ribosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic ribosome assembly.</a> Annual Review of Biochemistry. 88, 281-306 (2019).</li>
<li>Kressler, D., Hurt, E., Bassler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+puzzle+of+life%3A+Crafting+ribosomal+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">A puzzle of life: Crafting ribosomal subunits.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42 (8), 640-654 (2017).</li>
<li>Prattes, M., Lo, Y. H., Bergler, H., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+nascent+ribosome%3A+AAA-ATPases+in+eukaryotic+ribosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Shaping the nascent ribosome: AAA-ATPases in eukaryotic ribosome biogenesis.</a> Biomolecules. 9 (11), 715(2019).</li>
<li>Pillon, M. C., Sobhany, M., Stanley, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+molecular+crosstalk+within+the+essential+Grc3%2FLas1+pre-rRNA+processing+complex%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Characterization of the molecular crosstalk within the essential Grc3/Las1 pre-rRNA processing complex.</a> RNA. 24 (5), New York, N.Y. 721-738 (2018).</li>
<li>Hu, W., Coller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+for+determining+mRNA+and+ribosome+association+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis for determining mRNA and ribosome association in Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods in Enzymology. 530, 193-206 (2013).</li>
<li>He, S. L., Green, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polysome+analysis+of+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymolog%22%5BJournal%5D)">Polysome analysis of mammalian cells.</a> Methods in Enzymolog. 530, 183-192 (2013).</li>
<li>Anand, M., Chakraburtty, K., Marton, M. J., Hinnebusch, A. G., Kinzy, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interactions+between+yeast+translation+eukaryotic+elongation+factor+%28eEF%29+1A+and+eEF3%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional interactions between yeast translation eukaryotic elongation factor (eEF) 1A and eEF3.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6985-6991 (2003).</li>
<li>Serikawa, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptome+and+its+translation+during+recovery+from+cell+cycle+arrest+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cell+Proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">The transcriptome and its translation during recovery from cell cycle arrest in Saccharomyces cerevisiae.</a> Molecular and Cell Proteomics: MCP. 2 (3), 191-204 (2003).</li>
<li>Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+in+vivo+of+translation+with+nucleotide+resolution+using+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling.</a> Science. 324 (5924), New York, N.Y. 218-223 (2009).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כאן תוארה שיטה ליצירת פרופילים פוליזום ללא שימוש במערכות פיצול אוטומטיות יקרות. היתרון של שיטה זו הוא שהיא מנגישה פרופיל פוליזום למעבדות שאין להן מערכות פיצול אוטומטיות. החסרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם פיצול ידיים מייגע ורגישות מופחתת בהשוואה למערכת פיצול הצפיפות הייעודית.
פרוטוקול זה כרוך בהכנה קפדנית של מעברי צבע סוכרוז ברזולוציה מספקת להפרדת תת-יחידות ריבוזומליות, מונוזומים ופוליסומים. בעת הכנת שיפועי סוכרוז, חשוב מאוד לא להכניס בועות אוויר בזמן טעינת שכבות הדרגתיות. בועות אוויר עולות ל...

ריבוזומים הם קומפלקסים מגה-דלטון ריבונוקלאופרוטאין המבצעים את התהליך הבסיסי של תרגום mRNA לחלבונים. ריבוזומים אחראים על ביצוע הסינתזה של כל החלבונים בתוך התא. ריבוזומים אאוקריוטים מורכבים משתי תת-יחידות המוגדרות כתת-יחידה ריבוזומלית קטנה (40S) ותת-יחידה ריבוזומלית גדולה (60S) על פי מקדמי המשקעים שלהן. הריבוזום המורכב במלואו מוגדר כמונוזום 80S. פוליזומים הם קבוצות של ריבוזומים העוסקים בתרגום מולקולת mRNA יחידה. פיצול פוליזום על ידי צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז היא שיטה רבת עוצמה המשמשת ליצירת פרופילי ריבוזום, זיהוי mRNA ספציפיים הקשורים לתרגום ריבוזומים וניתוח גורמים הקשורים לפוליזום 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. טכניקה זו משמשת לעתים קרובות להפרדת פוליסומים מריבוזומים בודדים, תת-יחידות ריבוזומליות וחלקיקי ריבונוקלאופרוטאין שליחים. הפרופילים המתקבלים מהפיצול יכולים לספק מידע רב ערך לגבי פעילות התרגום של פוליזומים14 ומצב ההרכבה של הריבוזומים15,16,17.
הרכבת ריבוזום היא תהליך מורכב מאוד המתאפשר על ידי קבוצה של חלבונים הידועים כגורמי הרכבה ריבוזום 18,19,20,21. גורמים אלה מבצעים מגוון רחב של פונקציות במהלך ביוגנזה של ריבוזום באמצעות אינטראקציות עם חלבונים רבים אחרים, כולל ATPases, אנדו ואקסו-נוקלזים, GTPases, RNA helicases וחלבונים קושרי RNA22. פיצול פוליזום היה כלי רב עוצמה המשמש לחקר תפקידם של גורמים אלה בהרכבת ריבוזום. לדוגמה, שיטה זו שימשה כדי להדגים כיצד מוטציות בפולינוקלאוטיד קינאז Grc3, גורם עיבוד קדם-rRNA, יכולות להשפיע לרעה על תהליך הרכבת הריבוזום17,23. פרופיל פוליזום גם הדגיש והראה כיצד המוטיבים המשומרים בתוך ATPase Rix7 חיוניים לייצור ריבוזום16.
ההליך לפיצול פוליזום מתחיל ביצירת תאים מסיסים מתאי עניין. הליזאט מכיל RNA, תת-יחידות ריבוזומליות ופוליזומים, כמו גם רכיבים תאיים מסיסים אחרים. שיפוע סוכרוז רציף וליניארי נוצר בתוך צינור אולטרה-צנטריפוגה. החלק המסיס של ליזאט התא נטען בעדינות על החלק העליון של צינור גרדיאנט סוכרוז. לאחר מכן, צינור השיפוע הטעון נתון לצנטריפוגה, המפרידה בין הרכיבים התאיים לפי גודלם בתוך שיפוע הסוכרוז בכוח הכבידה. הרכיבים הגדולים יותר נעים רחוק יותר לתוך השיפוע מאשר הרכיבים הקטנים יותר. החלק העליון של השיפוע מכיל את הרכיבים התאיים הקטנים והאיטיים יותר, ואילו הרכיבים הסלולריים הגדולים והמהירים יותר נמצאים בתחתית. לאחר צנטריפוגה, התוכן של הצינור נאספים כשברים. שיטה זו מפרידה ביעילות בין תת-יחידות ריבוזומליות, מונוזומים ופוליסומים. הצפיפות האופטית של כל שבר נקבעת לאחר מכן על ידי מדידת הבליעה הספקטרלית באורך גל של 254 ננומטר. התוויית ספיגה לעומת מספר שבר מניבה פרופיל פוליזום.
ניתן ליצור מעברי צבע ליניאריים של צפיפות סוכרוז באמצעות יצירת מעבר צבע. לאחר צנטריפוגה, שיפועים מופרדים לעתים קרובות, וסופגות נמדדות באמצעות מערכת פיצול צפיפות אוטומטית 3,7,13,24,25. בעוד שמערכות אלה פועלות היטב כדי לייצר פרופילים פוליזומיים, הן יקרות ועלולות להיות יקרות עבור מעבדות מסוימות. כאן מוצג פרוטוקול ליצירת פרופילים פוליזום ללא שימוש בכלים אלה. במקום זאת, פרוטוקול זה משתמש בציוד הזמין בדרך כלל ברוב מעבדות הביולוגיה המולקולרית.

<table><tbody><tr><td>פרקטטור אוטומטי</td><td>Brandel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clariostar Multimode קורא צלחות</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7698</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Invitrogen</td><td>15508-013</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית, שטוף חומצה</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8772</td><td>425&ndash; 600 &mu; m</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4784</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד, 1 M</td><td>KD Medical</td><td>CAC-5290</td><td></td></tr><tr><td>מחט, 22 גרם, מתכת רכזת</td><td>המילטון</td><td>7748-08</td><td>אורך מותאם אישית 9 אינץ', סגנון נקודה 3</td></tr><tr><td>אופטימה XL-100K אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פוליפרופילן צינורות צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר בקמן קולטר</td><td>331372</td><td></td></tr><tr><td>מבחנה פוליפרופילן מתלה peg</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-810-54A</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>קיוביט 4 פלואורומטר</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>Q33228</td><td></td></tr><tr><td>קיוביט RNA HS ערכת בדיקה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>Q32855</td><td></td></tr><tr><td>מעכב RNAse</td><td>יישומי ביוסיסטמס</td><td>N8080119</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SW41 מתנדנד דלי רוטור חבילה</td><td>בקמן קולטר</td><td>331336</td><td></td></tr><tr><td>מזרק, 3 מ"ל</td><td>Coviden</td><td>888151394</td><td></td></tr><tr><td>Tris, 1 M,&nbsp; pH 7.4</td><td>KD Medical</td><td>RGF-3340</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>UV-Star Microplate, 96 בארות</td><td>Greiner Bio-One</td><td></td><td></td>655801</tr></tbody></table>

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

Polysome Profiling without Gradient Makers or Fractionation Systems

פיצול פוליזום על ידי צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז הוא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בו כדי ליצור פרופילים של ריבוזומים, לזהות mRNA ספציפיים המתורגמים על ידי ריבוזומים, ולנתח גורמים הקשורים לפוליזום. בעוד שיצרני שיפועים אוטומטיים ומערכות פיצול הדרגתיות משמשים בדרך כלל בטכניקה זו, מערכות אלה הן בדרך כלל יקרות ויכולות להיות יקרות עבור מעבדות שיש להן משאבים מוגבלים או שאינן יכולות להצדיק את ההוצאה בשל הצורך הנדיר או המזדמן שלהן לבצע שיטה זו עבור המחקר שלהן. כאן מוצג פרוטוקול ליצירת פרופילי פוליזום באמצעות ציוד סטנדרטי הזמין ברוב מעבדות הביולוגיה המולקולרית ללא מכשירי פיצול מיוחדים. יתר על כן, ניתנת השוואה של פרופילי פוליזום שנוצרו עם ובלי מערכת פיצול הדרגתית. נדונו אסטרטגיות למיטוב וייצור פרופילי פוליזום הניתנים לשחזור. Saccharomyces cerevisiae משמש כאורגניזם מודל בפרוטוקול זה. עם זאת, פרוטוקול זה יכול להשתנות בקלות ולהתאים ליצירת פרופילי ריבוזום עבור אורגניזמים וסוגי תאים רבים ושונים.

שלושה פרופילים פוליזום מייצגים מוצגים באיור 3. כל הפרופילים הם מאותו זן שמרים. פרופיל פוליזום טיפוסי יהיה בעל פסגות פתורות היטב עבור תת-יחידות ריבוזומליות של 40S, 60S ו-80S, כמו גם פוליזומים. הפסגה של כל תת-יחידה ריבוזומלית ופסגה פוליזומית תיראה בכל פרופיל (איור 3). פרופיל מייצג ממערכת אוטומטית של פיצול צפיפות מוצג באיור 3A. שיפועי הסוכרוז ששימשו ליצירת פרופיל זה הוכנו ביד כמתואר בפרוטוקול זה. פרופיל זה המוצג בא...

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פרופיל פוליזום מבלי להשתמש ביצרני שיפועים אוטומטיים או במערכות פיצול הדרגתיות.

Polysome fractionation by sucrose density gradient centrifugation is a powerful tool that can be used to create ribosome profiles, identify specific mRNAs ...

פרוטוקול זה מתאר כיצד ליצור פרופיל פוליזום החושף פרטים מולקולריים על פעילות הריבוזומים בתוך התא. טכניקה זו מאפשרת למשתמשים להשיג את המידע החשוב המסופק על ידי פרופיל פוליזום, שאין להם גישה למערכות פיצול הדרגתיות אוטומטיות. קח את הזמן שלך בעת הכנת מעברי הצבע, ואחסן את מעברי הצבע במיקום שבו הם לא יופרעו על ידי מדחס או פעולות מכניות אחרות כשהם שוקעים לשיפוע ליניארי.כדי להתחיל, הכינו פתרונות מלאי של 7 ו-47% סוכרוז במאגר הדרגתי של סוכרוז. המסנן מעקר את תמיסות מלאי הסוכרוז באמצעות מסנן של 0.22 מיקרון. הכן 14 מיליליטר של 17, 27 ו 37% סוכרוז פתרונות על ידי חלוקה וערבוב של פתרונות מלאי 7 ו -47%.הנח שש שפופרות צנטריפוגות פוליפרופילן לתוך מתלה מבחנה לצפייה מלאה. ודא שיש מספיק רווח בין הצינורות, כך שהפעולות עם צינור אחד לא יפריעו לאחרים. חברו מחט בגודל 9 אינץ', 22 מד עם קצה קהה למזרק של שלושה מיליליטר, ובצעו מילוי ופיזור בדיקה כדי להבטיח שהמזרק יכול להחזיק את תמיסת הסוכרוז ללא כל טפטוף לפני הגדרת השיפועים.הוסף שני מיליליטר של 7% סוכרוז לתחתית כל צינור צנטריפוגה. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של 17% סוכרוז מתחת לתמיסת 7%, על ידי מיקום קצה המחט בסביבה הקרובה של תחתית הצינור. בזהירות ובאיטיות לוותר על הפתרון.חזור על ההליך עם שני מיליליטר כל אחד מתמיסת 27, 37 ו 47% סוכרוז, להבטיח כי כל שכבה ניתנת להבחנה מהשנייה על ידי קו המסמן את הפרדת הצפיפויות. אחסנו את השיפועים בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר להם להתמקם לאחוז רציף והולך של סוכרוז. לאחר הצמיחה והקציר של שמרים, Saccharomyces cerevisiae תאים, לתלות את התאים ב 700 microliters מקורר של חיץ מיצוי פוליזום.הוסף 100 יחידות של מעכב RNAse. לאחר מכן, הוסיפו 400 מיקרוליטרים של חרוזי זכוכית מקוררים מראש בגודל משוער של 425 עד 600 מיקרון. מעבירים את התערובת לצינור צנטריפוגה בקוטר 1.5 מיליליטר עם חרוזי הזכוכית, ומשבשים את תאי השמרים על ידי תסיסה נמרצת במקציף חרוזים למשך חמש דקות.לאחר שיבוש התאים, להבהיר את lysate על ידי צנטריפוגה. קבע את ריכוז הרנ"א בליזאט המובהר על ידי מדידת הספיגה ב-260 ננומטר, באמצעות מערכת זיהוי RNA מבוססת פלואורסצנציה. ודא כי ריכוז RNA הוא 0.5 עד מיקרוגרם אחד לכל מיקרוליטר.אם ריכוז הרנ"א נמוך מדי, הפחיתו את נפח חיץ המיצוי המשמש להחייאת התאים. טען בזהירות את הליזאט על החלק העליון של מעברי הצבע. מניחים את קצה הפיפטה על הקיר הפנימי בחלק העליון של צינור הפוליפרופילן.זווית את הצינור ולאט לאט לטפטף את הליזאט על החלק העליון של שיפוע, מטפטף על הקיר. מניחים בעדינות את הצינורות לתוך הדליים המצוננים מראש של רוטור דלי מתנדנד, וצנטריפוגות את השיפועים. לאחר הצנטריפוגה, הסר בזהירות את צינורות הצנטריפוגה מרוטור הדלי המתנדנד, והנח אותם במחזיק צינורות.תייג את לוחות 96 הבארות כדי לאחסן את השברים ולצנן מראש על קרח. אסוף 100 או 200 שברים מיקרוליטר החל מראש השיפוע, על ידי החדרה זהירה של קצה פיפטה לחלק העליון של השיפוע, ואיסוף השברים עד שכל השיפוע הוא aliquoted. מדוד את הספיגה של כל שבר ב-254 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר כנגד תמיסות 7 ו-47% סוכרוז כריקים.צור את פרופיל הפוליזום על-ידי התוויית מספר השבר לעומת הספיגה. שלושה פרופילים פוליזום מייצגים של שמרים S.Cerevisiae, מוצגים. הפסגה של כל תת-יחידה ריבוזומלית ופסגת פוליזום ניכרת בכל פרופיל.פרופיל מייצג ממערכת חלוקת צפיפות אוטומטית מוצג כאן. פרופיל זה הופק מפרופיל ספיגה רציף כאשר שיפוע הסוכרוז נעקר מלמטה למעלה על ידי תמיסת מרדף, דרך תא זרימת גלאי ונאסף בשברים. פרופיל הפוליזום שנוצר על ידי חלוקה ידנית של 200 ו-100 דגימות מיקרוליטר מוצג כאן.הדבר החשוב ביותר שיש לזכור עם הליך זה הוא לא לשבש את שיפוע. היזהרו לא להכניס בועות אוויר או לשבש את השיפוע על ידי חלוקת פתרון מהר מדי. לאחר הליך זה, ניתן לחלץ RNA מהשיפועים לניתוח נוסף כדי לקבוע mRNA המשויכים לריבוזומים פעילים

polysome-profiling-without-gradient-makers-or-fractionation-systems

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

מאמר זה מתאר פרוטוקול להפקת תרגום הריבוזומים של התאים האיקריוטים. לאחר שחולצו, ריבוזומים מופרדים monosomes ו polyribosomes על ידי חלוקה סוכרוז הדרגתי כדי לאפשר לאוכלוסיות שונות ריבוזומלי להיות מנותח. ככזה, שיטה זו היא תקן הזהב לבחינת הרגולציה של התרגום.

האיקריוטים פרופיל Polyribosome ניתוח

כאן, אנו מתארים שיטה לניתוח שינויים בייזום של תרגום ה-mRNA של תאי אוקריוטים בתגובה למצבי לחץ. שיטה זו מבוססת על הפרדת המהירות בשיפועי סוכרוז של תרגום ריבוזומים מהריבוזומים שאינם תרגום.

ניתוח של תרגום ייזום בתנאי לחץ ידי Polysome פרופיל

פרוטוקול זה ממחיש שינויים מהותיים בחלוקת polyribosome כדי ללמוד translatome של in vivo דגימות במערכת העצבים המרכזית. זה מאפשר הערכה הגלובלית של רגולציה תרגום ותעתיק דרך הבידוד והשוואה של רנ"א הכל לריבוזום שברי RNA מאוגד.

בחקירתו vivo של Translatome מערכת עצבים המרכזי על ידי Polyribosome היפוך חלוק

הריבוזומים לשחק תפקיד מרכזי בסינתזה של חלבונים. חלוקה Polyribosome (polysome) על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות סוכרוז מאפשרת קביעה ישירה של יעילות תרגום של mRNAs הבודד בקנה מידת הגנום כולו. בנוסף, בשיטה זו ניתן להשתמש לצורך הניתוח ביוכימי של הריבוזום וגורמים הקשורים polysome כגון מלווים ומולקולות איתות.

Polysome היפוך חלוק וניתוח של יונקי Translatomes בקנה מידת הגנום

היכולת של תאים להסתגל ללחץ היא קריטית להישרדותם. ויסות תרגום mRNA הוא אסטרטגיית הסתגלות כזו, המספקת ויסות מהיר של הפרוטאום. כאן, אנו מספקים פרוטוקול פרופיל פוליזום סטנדרטי לזיהוי mRNAs ספציפיים המתורגמים באופן סלקטיבי בתנאי לחץ.

הערכת סלקטיבי mRNA התרגום בתאי יונקים ידי Polysome פרופיל

פרוטוקול זה מתאר שיטה קלה לחילוץ ופיצול תעתיקים מרקמות צמחים על בסיס מספר הריבוזומים הקשורים. הוא מאפשר הערכה גלובלית של פעילות התרגום וקביעת סטטוס התרגום של mRNAs ספציפיים.

שיטה קלה הצמח Polysome Profiling

תקנה translational ממלא תפקיד חשוב בבקרה על שפע חלבונים. כאן, אנו מתארים שיטה תפוקה גבוהה לניתוח כמותי של תרגום שמרים ניצני האפייה.

הגנום כולו כימות של תרגום ניצני שמרים על-ידי יצירת פרופיל ריבוזום

המטרה הכוללת של טכניקה פרופיל polysome הוא ניתוח של פעילות translational של הפרט mRNAs או transcriptome mRNAs במהלך סינתזת החלבון. השיטה זו חשוב ללימודים של רגולציה סינתזה של חלבון, הפעלת תרגום ודיכוי בריאות ומחלות האנושי מרובים.

Polysome פרופיל לישמניה, תאים אנושיים, Testis העכבר

התפתחות מוח היונקים דורשת שליטה נאותה בביטוי הגנים ברמת התרגום. כאן, אנו מתארים מערכת פרופיל פוליזום עם פלטפורמת יצירת שיפוע סוכרוז קל להרכבה ושבר כדי להעריך את מצב התרגום של mRNAs במוח המתפתח.

ניתוח תרגום במוח העכבר המתפתח באמצעות פרופיל פוליזום

אנו מציגים טכניקה לייצוב מהיר של מתחמים תרגומיים (ביוסינטזה של חלבונים) עם קשרים צולבים פורמלדהידים בתאי שמרים ויונקים חיים. הגישה מאפשרת לנתח מתווכים ארעיים ואינטראקציות דינמיות של RNA:חלבון. ניתן להשתמש במתחמים המקושרים ביישומים מרובים במורד הזרם, כגון בשיטות פרופיל מבוססות רצף עמוק, מיקרוסקופיה וספקטרומטריית מסה.

קיבוע מהיר ב- Vivo ובידוד מתחמים תרגומיים מתאי אוקריוטיים

הפרוטוקול המוצג כאן כולל פרופיל פוליזומלי כדי לבודד טרנסלטום, mRNA הקשור לריבוזומים, לרנ"א לא פוליזומלי ופוליזומלי מארבידופסיס באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות סוכרוז. שיטה זו מדגימה את יעילות התרגום של Arabidopsis בלחץ חום.

בדיקת יעילות תרגום באמצעות פרופילי פוליזום תחת לחץ חום

למדו ליצור פרופיל פוליזום ללא מערכות פיצול אוטומטיות. שיטה זו מאפשרת ניתוח פעילות ריבוזומים בתאים באמצעות הכנת שיפועי סוכרוז ידנית. מתאים לחוקרים בתחומי הביולוגיה התאית והמולקולרית.

פרופיל פוליזום ללא יצרני שיפועים או מערכות פיצול

גלה סרטונים נוספים