Spatio-Temporal In Vivo הדמיה של מערכות אספקת תרופות עיניות באמצעות מיקרונדוסקופיה לייזר קונפוקל קונפוקלי פיברופטים

פרוטוקול זה מאפשר סינון של ניסוחים חדשים כדי להבין טוב יותר כיצד שינויים משפיעים על זמני המגורים שלהם רקמה, וזה קריטי בעיצוב מערכת אספקת תרופות אופטימלית. טכניקה זו אינה פולשנית ומאפשרת הדמיה בזמן אמת, מה שמפחית את השימוש המופרז בבעלי חיים לדגימה. מערכות אספקת תרופות ניתן לעצב מחדש עבור הדמיה ויישומים טיפוליים פשוט על ידי הכללת התרופה הטיפולית ואת moiety הדמיה בננו-נשא אחד.

זה יש יישומים שימושיים הן בטיפול בסרטן ומחלות זיהומיות. מפגינה את ההליך תהיה רשא מסלם, עמיתת מחקר בכירה מהמעבדה שלי. ראשית, שעתיים לפני הזרקת תת-צינור, הזרקו לעכבר דרך הווריד דרך הזנב 2.5 מיליגרם לקילוגרם של כחול אוונס, או EB. לאחר הרגעת העכבר עם 5% איזופלוריין, להעביר את העכבר לקונוס האף ולשמור על עכבר מסומם על כרית חימום.

לאחר מכן, לקצץ את השפם ליד העין כדי להיות מוזרק. להחדיר טיפה של 0.5% proxymetacaine פתרון הידרוכלוריד ישירות על העין. לאחר מכן, לטעון מזרק זכוכית 10 מיקרוליטר מצויד מחט 32-מד עם ליפוזומים פלואורסצנטיים ולוודא כי בועות האוויר אינם נוכחים במזרק.

באמצעות פינצטה, להרים את הלחמית ולהזריק לאט ליפוזומים לתוך החלל התת-ימי, ולאחר מכן למשוך את המחט לאט, מניעת זרימה חזרה. ודא היווצרות של bleb מלא ליפוזומים פלואורסצנטיים. תן טיפת חומצה פוסיטית של 1% על העין ונטר את העכבר עד שהוא חוזר להכרה.

הפעל את מערכת CLM. חבר את הגשוש למערכת CLM. בחר את שדה התצוגה ואת המיקום עבור קבצי הרכישה בשלב זה.

התאם את עוצמת הלייזר כדי להבטיח שזיהוי הפלואורסצנטיות עבור פלואורסצ'ין DHPE נמצא בטווח הליניארי, ושמור על העוצמה עקבית להשוואה בין תמונות שצולמו בנקודות זמן שונות. לאחר חימום המערכת למשך 15 דקות, כייל את המערכת בהתאם להוראות היצרן באמצעות ערכת הכיול המכילה את פתרונות הניקוי, השטיפה והפלואורו-4 לכל לייזר. בקצרה, התחל לכייל על ידי טבילת הקצה במשך חמש שניות כל אחד בבקבוקון הניקוי, ולאחר מכן בבקבוקון השטיפה.

השאירו את הקצה באוויר להקלטת רקע כדי לנרמל את ערכי הרקע מהגשושיות סיבים שונים, ולהבטיח אחידות תמונה. שוב, לטבול את הקצה במשך חמש שניות בבקבוקון ניקוי, ולאחר מכן בקבוקון שטיפה. לאחר מכן, לטבול את הקצה בקבוקון המכיל פלואורו-4 488-ננומטר במשך חמש שניות כדי לנרמל את ערכי האות.

חזור על טבילת הקצה במשך חמש שניות בבקבוקון הניקוי ואחריו בקבוקון השטיפה. שמור את הקצה בבקבוקון השטיפה עד שאות הפלואורסצנטיות שנרשם בשלב הקודם ייעלם. לאחר מכן, העבר את הקצה בבקבוקון המכיל פלואורו-4 660 ננומטר כדי לנרמל ערכי אות מסיבים שונים בגשוש.

לאחר הכיול, ודא שהערך קטן מ- 100 עבור הרקע של הגשושית. אחרת, בצע ניקוי חוזר ונשנה של הבדיקה עם אפליקטור קצה כותנה. הפעל את בקר הטמפרטורה של בעלי החיים עם כרית חימום מחוברת, והתאם את הטמפרטורה ל-37 מעלות צלזיוס.

לאחר כיסוי כרית החימום עם וילון כירורגי, לתקן את חרוט האף על כרית החימום. לאחר הרגעת העכבר באמצעות 5% איזופלוריין בתא אינדוקציה, להעביר את העכבר לקונוס האף ולשמור על העכבר מסומם על כרית חימום. לאחר מכן, להחדיר טיפה של הרדמה 0.5% proxymetacaine הידרוכלוריד פתרון על העין.

כדי לשטוף את פני השטח העין ולהימנע התגבשות של העדשה, לשמור על העיניים משומן על ידי הפלת כמה טיפות מלוחים. לאחר מכן, סובב והתאם את עפעפי המיקרוסקופ כדי להציג את עין העכבר ארגונומית במוקד הישיר בהגדלה של פי 0.67. הפעל את הלייזר והנח את הגשוש כמו עט ישירות על אזור העיניים כדי להיות בתמונה.

לאחר מכן, התחל להקליט רכישה כדי לבחון את הפלואורסצנטיות בעין באזור העניין. הפסק את ההקלטה כאשר כל האזורים מסומנים בדגל ומסומנים לפי מפת העין כדי לדעת את מיקום הבדיקה המדויק במסגרת המדויקת. קבצי הרכישה יישמרו באופן אוטומטי כקבצי וידאו במיקום שנבחר בעבר.

הדמיית הפלואורסצנטיות חשפה הבחנה ברורה בין אזורי הסקלרה והקרנית. כלי דם גבוהים של האפיסקלרה והלחמית גרמו לאזור הסקלרה להכתים אדום עם EB. הקרנית, שחסרה כלי דם, נראתה שחורה. הפלואורסצנטיות הניגודית של לימבוס וסקלרה נצפתה במחקר בן שבעה ימים.

עכברי בקרה מוזרקים בצבע פלואורסצ'ין אישרו את הספציפיות של פלואורסצנטיות שמקורה בליפוזום. עוצמות הפלואורסצנטיות היו גבוהות ביום הראשון והשלישי. פלואורסצנטיות ירוקה סייעה להפחתת הליפוזום באזורי הלימבוס והסקלרה לאורך זמן.

ההבדלים באותות הפלואורסצנטיות מהיום הראשון לאחר ההזרקה ליום השלישי בלימבוס הזמני ובאזורי לימבו מעולה לא היו משמעותיים, מה שמצביע על העדפה של ליפוזומים ניטרליים לאזור הלימבוס, במיוחד הפריפריה הקרנית. עבור האזורים הזמניים והנעלים ביום הראשון שלאחר ההזרקה, הפלואורסצנטיות בסקלרה הייתה גבוהה פי שישה מאשר בלימבוס. ביום השלישי והשביעי, ליפוזומים צומצמו באופן משמעותי בסקלרה באזורים הזמניים והעליון, המיוחסים למנגנוני פינוי עינית.

הכמות הנמוכה ביותר של פלואורסצנטיות זוהתה באזורי האף והנחותות, בשל המרחק מאתר ההזרקה. חשוב לתייג את מסגרות הכתמים לפי מפת העיניים לפני הפסקת ההקלטה. שמור על עקביות עוצמת הלייזר והגדר את ערך הרקע המרבי להשוואה נכונה בין ניסויים שונים.

לאחר זיהוי של ניסוחים עופרת, פרמקוקינטית מקיפה ומחקרים biodistribution בבעלי חיים ניתן לערוך כדי ללמוד את הזמינות הביולוגית של התרופה, ולאמת את היעילות הטיפולית של ניסוחים שלהם.