Name: הגירה גרעינית באוקיטה של דרוסופילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: למדו תצפית בהגירה גרעינית באוקיטה של דרוסופילה באמצעות מיקרוסקופיית הדמיה חיה. הפרוטוקול מאפשר שימור חללי ביצים ל-12 שעות לצילום תלת-ממדי מפורט של תהליכים דינמיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים מאוד לז'אן אנטואן לפסאנט וניקולס טיסוט שפיתחו את הפרוטוקול במקור ושיתפו איתנו כמה אלמנטים גרפיים של איור 3. אנו מודים לפאני רולנד-גוסלין שצילמה את התמונות של איור 4. אנו מודים גם לחברי מעבדה אחרים על דיונים מועילים שתרמו להחמצת טכניקה זו ונתנאל הנמן על הערותיו שעזרו לשפר את כתב היד הזה. אנו מכירים במתקן הליבה של ImagoSeine של המכון ז'אק מונוד, חבר בצרפת-BioImaging (ANR-10-INBS-04). מאליס לו נתמך על ידי מלגת דוקטורט ממשרד המחקר הצרפתי (MESRI). אנטואן Guichet ופרד ברנרד נתמכו על ידי ARC (גרנט PJA20181208148), האגודה des Entreprises contre le Cancer (גרנט Gefluc 2020 #221366) ועל ידי מענק הופעתה מאוניברסיטת IdEx דה פריז (ANR-18-IDEX-0001).

1. הדמיה הכנה בינונית
<ol><li>הכן מדיה טרייה ביום השימוש. פיפט 200 μL של בינוני שניידר (המכיל L-גלוטמין ו 0.40 גרם / ליטר של NaHCO3 בתוספת 10% סרום עגל עוברי מומת בחום, 100 U / mL של פניצילין, ו 100 מ"ג / מ"ל של סטרפטומיצין).</li>
	<li>תוספת עם 30 μL של אינסולין 10 מ"ג/מ"ל.</li>
	<li>יש להוסיף 4 מיקרו-אל של סרום עגל עוברי מומת בחום.</li>
</ol>2. הכנת תא תצפית
<ol><li>בעזרת קצה פיפטה, יש למרוח כמות קטנה של שומן סיליקון מסביב לחור בצד התחתון של השקופית המנוקבת (איור 4D).</li>
	<li>מקם כיסוי של 24 x 50 מ"מ בעובי 0.13-0.16 מ"מ.</li>
	<li>עם הקצה הרחב של קצה פיפטה, להפעיל לחץ על כיסוי כדי לשטח את הסיליקון כדי לאטום את כיסוי וליצור פנים טבעת סיליקון לשקופית(איור 4F,G).</li>
</ol>3. ניתוח השחלות
<ol><li>להרדים זבוב נקבה של פנוטיפ הרצוי על כרית CO2.</li>
	<li>העבר את הנקבה ב 150 μL של מדיום ההדמיה בבאר ניתוח(איור 4H).</li>
	<li>פתח נקבה אחת על ידי תפיסת בית החזה שלה עם מלקחיים וצביטת בטן הגב עם זוג שני של מלקחיים.</li>
	<li>לבודד ולנתק את זוג השחלות, אשר צריך להיות גלוי בקלות על פתיחת חתך.</li>
	<li>הסר בזהירות את הרחם, האובידוקט ונדן השרירים(איור 4I).</li>
	<li>מניחים טיפה של 10-15 μL של מדיום ההדמיה ומעבירים שחלה אחת בתא ההדמיה(איור 4J,K).</li>
</ol>4. בידוד תאי הביצים
<ol><li>כדי להפריד את השחלות, להחזיק את הקצה האחורי של השחלה (לקראת השלבים הישנים) עם המחט. להקניט את השחלות על ידי משיכה בזהירות על נבט עם מחט אחרת.</li>
	<li>הסר את נדן השריר הנותר על תאי הביצים; מחט אחת מחזיקה את הנדן והשנייה מושכת את השחלה דרך התאים הגדולים יותר (שלב 9 ומעלה).</li>
	<li>אפשרו לחלותות שלא נושלו לשקוע ולצור קשר עם כיסוי.</li>
	<li>הסר שלבים מאוחרים ושאר השחלות מתא המיקרו בעזרת מלקחיים. הרחיקו בזהירות את השחלות מהאחרים עם מחטים כדי להקל על הרכישה(איור 4L).</li>
</ol>5. סגירת תא תצפית
<ol><li>חותכים ריבוע קטן (10 x 10 מ"מ) של ממברנה חדירה(איור 4M,N).</li>
	<li>יש למרוח בזהירות את הממברנה על גבי מדיום ההדמיה כדי לגרש את כל בועות האוויר(איור 4O).</li>
	<li>אטמו הרמטית את התא בשכבה דקה של שמן הילוקרבון סביב הבאר על קווי המתאר של הממברנה(איור 4P,Q).</li>
</ol>6. הדמיה
<ol><li>מקם את הגדרת ההדמיה על מחזיק השקופית של המיקרוסקופ ההפוך באמצעות מטרה 40x (HCX PL Apo, 1.25NA, טבילת שמן).</li>
	<li>אתר ושמור עמדות של ביציות שלב 6 שונות שבהן הגרעין מוכן לנדוד.</li>
	<li>תגדיר את הלייזרים 488 ו-561 ננומטר. עם כוח לייזר פלט מדוד של 150 mW, להשתמש 30% של כוח הלייזר ו 300 אלפיות שני ו 500 ms חשיפה, בהתאמה.</li>
	<li>תארגן את הניסוי. קח זמן לשגות של 12 שעות עם מרווח של 15 דקות-41 קטעים עם מרווח של 1 מיקרומטר במרכז הגרעין. הערה: על פי זמן החשיפה המתואר לעיל, הגדרה זו מאפשרת רכישה של פוזיציה אחת בסביבות 45 s. מכיוון שיש עיכוב עקב שינוי מיקום, מומלץ לקבוע מקסימום של 12 עמדות בתנאים אלה.</li>
</ol>7. ניתוח תמונה
<ol><li>לעבד את הסרטים על התוכנה פיג'י, באמצעות תוסף תצוגת Orthogonal ולעקוב באופן ידני אחר הגרעינים.</li>
</ol><img alt="רצף טכניקת מיקרו-הזרקה לניתוח עוברי דרוזופילה תחת מיקרוסקופ." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> איור 4: תמונות הרכבה מיקרו-תא צעד אחר צעד. (A,B,C) הכנת הכלים הדרושים: כריתת צלחת באר, מלקחיים, מחטים, מדיית הדמיה, שומן סיליקון, ממברנה חדירה ומגלשת האלומיניום. (D)יישום של שומן הסיליקון בחלק האחורי של שקופית האלומיניום עם קצה פיפטה. (E)כיסוי זכוכית מודבק על שומן הסיליקון כדי ליצור את החלק התחתון של התא. (F,G) יישום לחץ על כיסוי עם הגפיים הרחבות יותר של קצה פיפטה כדי ליצור מפרק בתוך התא. (ח,אני) ניתוח השחלות הזבובות בתקשורת ההדמיה. (J)צנרת של טיפה של מדיה הדמיה בתא מיקרו. (K,L) הפרדת השחלות בתא המיקרו באמצעות מחטים. (M,N,O) קרום חדיר לחתוך לתוך 10 x 10 מ"מ מרובע ומניח מעל טיפת המדיום בתא מיקרו. (P,Q) איטום של תא המיקרו עם שמן הילוקרבון. הדגימות מוכנות להתמונה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<ol><li>Merkle, J. A., Wittes, J., Schüpbach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+between+somatic+follicle+cells+and+the+germline+patterns+the+egg+and+embryo+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling between somatic follicle cells and the germline patterns the egg and embryo of Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 140, 55-86 (2020).</li>
<li>Roth, S., Lynch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Symmetry+breaking+during+drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Symmetry breaking during drosophila oogenesis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (2), 001891(2009).</li>
<li>Bernard, F., Lepesant, J. -A., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleus+positioning+within+Drosophila+egg+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Nucleus positioning within Drosophila egg chamber.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 82, 25-33 (2017).</li>
<li>Koch, E. A., Spitzer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+effects+of+colchicine+on+oogenesis+in+Drosophila%3A+Induced+sterility+and+switch+of+potential+oocyte+to+nurse-cell+developmental+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">Multiple effects of colchicine on oogenesis in Drosophila: Induced sterility and switch of potential oocyte to nurse-cell developmental pathway.</a> Cell and Tissue Research. 228 (1), 21-32 (1983).</li>
<li>Januschke, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosome-nucleus+complex+and+microtubule+organization+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The centrosome-nucleus complex and microtubule organization in the Drosophila oocyte.</a> Development. 133, Cambridge, England. 129-139 (2006).</li>
<li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168(2017).</li>
<li>Cetera, M., Horne-Badovinac, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Round+and+round+gets+you+somewhere%3A+collective+cell+migration+and+planar+polarity+in+elongating+Drosophila+egg+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Round and round gets you somewhere: collective cell migration and planar polarity in elongating Drosophila egg chambers.</a> Current Opinion in Genetics & Development. 32, 10-15 (2015).</li>
<li>Hudson, A. M., Petrella, L. N., Tanaka, A. J., Cooley, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mononuclear+muscle+cells+in+Drosophila+ovaries+revealed+by+GFP+protein+traps%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Mononuclear muscle cells in Drosophila ovaries revealed by GFP protein traps.</a> Developmental Biology. 314, 329-340 (2008).</li>
<li>Gervais, L., Claret, S., Januschke, J., Roth, S., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIP5K-dependent+production+of+PIP2+sustains+microtubule+organization+to+establish+polarized+transport+in+the+Drosophila+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PIP5K-dependent production of PIP2 sustains microtubule organization to establish polarized transport in the Drosophila oocyte.</a> Development. 135 (23), 3829-3838 (2008).</li>
<li>Villányi, Z., Debec, A., Timinszky, G., Tirián, L., Szabad, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+persistence+of+importin-+b+explains+extended+survival+of+cells+and+zygotes+that+lack+the+encoding+gene+%27+n+Villa%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Long persistence of importin- b explains extended survival of cells and zygotes that lack the encoding gene ' n Villa.</a> Mechanisms of Development. 3-4 (125), 196-206 (2008).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Prasad, M., Jang, A. C. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+culturing+drosophila+melanogaster+stage+9+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A protocol for culturing drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging.</a> Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).</li>
<li>Weil, T. T., Parton, R. M., Davis, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+individual+Drosophila+egg+chambers+for+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparing individual Drosophila egg chambers for live imaging.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), (2012).</li>
<li>Chanet, S., Huynh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+cell+sorting+requires+contractile+cortical+waves+in+germline+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Collective cell sorting requires contractile cortical waves in germline cells.</a> Current Biology. 30 (21), 4213-4226 (2020).</li>
<li>Zhao, T., Graham, O. S., Raposo, A., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+microtubules+push+the+oocyte+nucleus+to+polarize+the+drosophila+dorsal-ventral+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Growing microtubules push the oocyte nucleus to polarize the drosophila dorsal-ventral axis.</a> Science. 336 (6084), New York, N.Y. 999-1003 (2012).</li>
<li>Legent, K., Tissot, N., Guichet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+7+Oogenesis+using+fixed+and+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Oogenesis%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">Chapter 7 Oogenesis using fixed and live imaging.</a> Drosophila Oogenesis: Methods and Protocols. 1328, 99-112 (2015).</li>
</ol>

המחברים מצהירים שאין אינטרסים מתחרים.

פרוטוקולים אחרים מתארים כיצד להכין ולתרבות תאי הביצה Drosophila ex vivo לבדיקת הדמיה חיה12,13. החידוש של פרוטוקול זה הוא השימוש בתא הדמיה שנבנה באמצעות מגלשת אלומיניום חלולה, כיסוי, וקרום חדיר O2/ CO2. היתרון העיקרי של מערך זה הוא להגביל את התנועה ב- Z מבלי להפעיל לחץ על המדגם. לכן, oocyte עדיין יכול לנוע בחופשיות, וזו הסיבה הראשונה, המטרה 40x משמש ושני, z-ערימות נרכשים לאורך 40 מיקרומטר, בעוד oocyte הוא סביב 20 מיקרומטר גובה בשלב 6...

במשך מספר שנים, ביצינה Drosophila התפתח כמערכת מודל לחקר הגירה גרעינית. הביצית הדרוזופילה מתפתחת במבנה רב תאי הנקרא תא הביצים. תאי הביצה מקיפים 16 תאי נבט (15 תאי אחות וביציות) מוקפים בשכבה אפיתל של תאים סומטיים זקיקים. פיתוח תאי הביצים מחולק ל-14 שלבים (איור 1A),שבמהלכם הביצית תגדל ותצבר עתודות הדרושות להתפתחות מוקדמת של העובר. במהלך ההתפתחות, עם ארגון מחדש של מיקרוטובולות והובלה אסימטרית של דטרמיננטים אימהיים, הביציות מקוטבות לאורך הצירים האנטרו-דורסלים והדורסו-גחון. צירים אלה קובעים את צירי הקוטביות הבאים של העובר ואת המבוגר הנובע מהפריה של הביצית1. במהלך אוגנזה, הגרעין מאמץ עמדה אסימטרית בביציות. בשלב 6, הגרעין מרוכז בתא. לאחר אות שטרם זוהה הנפלט מתאי הזקיקים האחוריים המתקבל על ידי הביציות, הגרעין נודד לכיוון הצומת בין קרום הפלזמה הקדמי והלבטי בשלב 7 (איור 1B)2,3. עמדה אסימטרית זו נדרשת כדי לגרום לקביעת ציר דורסו-גחון.
<img alt="מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של תא הביצים של דרוזופילה, המציגה את שלבי גרעיני תאי הביציות והאחיות." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1: תאי הביצים של Drosophila melanogaster. (A)ביציות קבועות מזבובים מהונדסים המבטאים Fs(2)Ket-GFP המתייגת את המעטפות הגרעיניות ואת ubi-PH-RFP המתייג את קרום הפלזמה. השחלות מורכבות ממפתחת תאי ביצים בשלבים שונים. ההתבגרות גדלה לאורך הציר האחורי-הקדמי עם הנבט בקצה הקדמי (משמאל) שבו שוכן תא הגזע של החיידק והשלב הישן בקצה האחורי (מימין). (B)Z-הקרנה של תא ביצה חיה על ידי ספינינג דיסק קונפוקלי מיקרוסקופיה בשלב 6 של oogenesis (משמאל), שבו הגרעין מרוכז בביצית. הגרעין יעבור לאמץ תנוחה א-סימטרית בשלב 7 (מימין) במגע עם קרום הפלזמה הימני (בין הביציות לתא האחות) וקרום הפלזמה לרוחב (בין הביציות לתאי הזקיקים). עמדה זו תעורר את קביעת הצד הדו-צדדי, וכך גם את הציר הגחון-דורסו של תא הביצה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
במשך עשורים רבים, הגירה גרעינית זו נחקרה על רקמות קבועות על ידי חיסון. גישה זו אפשרה במיוחד להוכיח כי תהליך זה תלוי ברשת צפופה של microtubules4,5. לאחרונה, פיתחנו פרוטוקול המציע תנאים התואמים הדמיה חיה של oocyte במהלך מספר שעות, מה שמאפשר ללמוד את התהליך הזה באופן דינמי6.
לפיכך, בפעם הראשונה, הצלחנו לתאר כי הגרעין יש מסלולים מועדפים ומאופיינים במהלך נדידתו, אחד לאורך קרום הפלזמה הנעים (APM) והשני לאורך קרום הפלזמה לרוחב (LPM) של oocyte (איור 2). תוצאות עדכניות אלה מדגישות את החשיבות של פרוטוקולי הדמיה חיה בעת לימוד תהליכים דינמיים כגון הגירה גרעינית.
<img alt="&lt;span&gt;דיאגרמת ביציות: ביצית, תאי אחות, תאים זקיקים; כיוון ציר והתמיינות תאית.&lt;/span&gt;" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2: ייצוג סכמטי של נתיבי ההעברה השונים של הגרעין. בשלב 6 של oogenesis, ביוציט הוא תא גדול עם גרעין מרכזי. בשלב זה, ציר הקוטביות הקדמית-אחורית מוגדר עם קרום פלזמה אחורי / לרוחב של הביצית במגע עם תאי הזקיקים וקרום הפלזמה הקדמי (בצהוב) נמצא במגע עם תאי האחות2. דיווחנו בעבר כי הגרעין יכול לנדוד לאורך קרום הפלזמה הקדמי (APM), לאורך קרום הפלזמה לרוחב (LPM), או דרך הציטופלסמה (STAD, היישר לקליפת המוח הקדמית-דורסל)6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
נדידת גרעין הביצית היא תופעה של כ 3 שעות6, ועד כה, האירוע המפעיל את תחילת ההגירה בפועל אינו ידוע. תחילת הנדידה יכולה להתעכב גם על ידי מוטציות חלבון המשמשות לחקר מנגנון זה. משתנים לא ידועים אלה הניעו אותנו לרכוש תמונות על פני תקופות זמן ארוכות (10-12 שעות). לכן חשוב לוודא שהאוציטים יישארו בחיים. ככל שחדר הביצים מתפתח, הוא מתרבה לאורך הציר האנטרו-אחורי מצורה כדורית לצורה אליפטית. התארכות זו מונעת על ידי סיבוב של תאים זקיקים, המתרחש משלב 1 לשלב 8, בניצב לציר האנטרו-אחורי7. בנוסף, נדן צינורי של שריר עם רכוש פועם מקיף את תאי הביצים. תפקידו הפיזיולוגי הוא לדחוף את הזקיקים המתפתחים לכיוון oviduct ברציפות8. כדי להגביל את התנועות הגורמות לתנודות של תאי הביצים לאחר ניתוחם, עיצבנו מיקרו-תא תצפית בגובה 150 מיקרומטר(איור 3A). גובה זה גבוה באופן שולי מגודלו של זקיק בשלבים 10 ו -11. זה מגביל במידה ניכרת את התנועות האנכיות של המדגם תוך שמירה על הסיבוב של תא הביצה, ובכך וכתוצאה מכך פגמים מוגבלים בהתפתחות הזקיק. לאחר מכן אנו מבצעים הדמיה חיה במשך 12 שעות על תאי ביצים ניתחו על ידי רכישות זמן-לשגות מרובות מיקום באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי של דיסק מסתובב. כאן אנו מתארים את הפרוטוקול שלנו לחקר ההגירה הגרעינית של ביצית בין שלבים 6 עד 7.
<img alt="תרשים תא מיקרופלואידי; מידות, פרטי הרכבה ושימוש בשומן סיליקון לתצפית ביולוגית." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62688/62688fig3v3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> איור 3: ייצוג סכמטי של תא התצפית. (A) (תצוגה עליונה) ממדים מדויקים של שקופית האלומיניום עם הגבהים (A') וההיקפים (A') של הבאר שנקדחה באמצע השקופית. (B)(תצוגה תחתונה) כיסוי החוסם את הבאר אטום לשקופית עם שומן סיליקון. (C)(מבט עליון) השחלות נותחו מתפתחות במדיום הדמיה המכוסה על ידי קרום חדיר לגז. שמן Halocarbon משמש לייצוב הממברנה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62688/62688fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
על מנת לעקוב אחר הנדידה הגרעינית ולהעריך במדויק את המסלולים בביציות, יש צורך בסמנים הן לעוטף הגרעיני והן לממברנת הפלזמה. במטרה זו נבחרו שני טרנסג'נים בעלי יחס אות/רעש גבוה ואינם דוהים במהלך ההדמיה החיה. כדי לתייג את קרום הפלזמה, מומלץ להשתמש P[ubi-PH-RFP] המקודד את תחום ההומולוגיה של פלקסטרין (PH) של הפוספוליפאז האנושי C ∂1 (PLC∂1) התמזג ל- RFP. דומיין PH זה נקשר ל- PI phosphoinositide(4,5)P2 המופץ לאורך קרום הפלזמה של הביציות9. עבור המעטפה הגרעינית, P[PPT-un1]Fs(2)Ket-GFP זן מלכודת חלבון שבו GFP מוכנס בתוך הגן קידוד Drosophila ß-importin מציג הומוגני אות אינטנסיבי10. זבובים צעירים (בני 1-2 ימים) ממוקמים בבקבוקונים טריים המכילים שמרים יבשים 24-48 שעות לפני ניתוח השחלות.
עבור זה הדמיה חיה assay, חתיכה בעובי 1 מ"מ של אלומיניום, אשר אינו פעיל עבור המדגם, נחתך לתוך הממדים של שקופית מיקרוסקופיה. יש לו חור בקוטר 16 מ"מ במרכז השקופית כי כבר counterbored ל 0.85 מ"מ. ל-counterbore זה יש חור נוסף בקוטר 6 מ"מ עם עומק של 150 מיקרומטר(איור 3A). כיסוי מודבק עם שומן סיליקון (אינרטי לדגימה) בתחתית תא האלומיניום(איור 3B). לאחר הנחת הדגימות בבאר הבינונית, קרום חדיר לחילופי O2/CO2 ממוקם מעל המדיום ומוקף בשמן הילוקרבון(איור 3C).
עבור הניתוח, מומלץ להשתמש במלקחיים מפלדת אל-חלד עם ממד קצה של 0.05 x 0.02 מ"מ, ומחטים בקוטר 0.20 מ"מ להפרדת השחלות(איור 4B,C). הגרעינים הנודדים מצולמים על מיקרוסקופ הפוך של דיסק מסתובב CSU-X1 המצויד במצלמה. תמונות מרובות מיקום נרכשו על ידי זמן לשגות כל 15 דקות ב 24 °C (50 °F). מרווח של 15 דקות מאפשר ביצוע רכישות מרובות עמדות עם צילומים מוגבלים של חלבוני הפלואורסצנט והפוטו-טוקסיקיות עבור הדגימות. יתר על כן, מרווח זמן קצר יותר לא יספק נתונים אינפורמטיביים הרבה יותר כדי לעקוב אחר המסלולים הגרעיניים. הסרטים מעובדים ומנותחים באמצעות תוכנת פיג'י11.

<table><tbody><tr><td>כרית CO2 מרדימה</td><td>Dutscher</td><td>789060</td><td>זבובי הרדמה</td></tr><tr><td>Coverslip (24x50 מ"מ)</td> <td>Knittel זכוכית</td><td>VD12450Y100A</td><td>הכנת תא תצפית</td></tr><tr><td>מלקחיים Dumont #5</td><td>Carl Roth</td><td>K342.1</td><td>דיסקציה</td></tr><tr><td>מחטי נירוסטה</td><td>Entosphinx</td><td>20</td><td></td></tr><tr><td>דיסקציה סרום עגל עוברי מושבת בחום</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>F7524</td><td>מדיום הדמיה</td></tr><tr><td>תמיסת אינסולין בקר</td><td>לבלב בקר SIGMA-ALDRICH</td><td>10516 - 5 מ"ל</td><td>מדיום הדמיה</td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P0781</td><td>מדיום הדמיה</td></tr><tr><td>קרום חדיר</td><td>Leica</td><td>11521746</td><td>הכנת תא תצפית</td></tr><tr><td>שניידר Medium</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-91500</td><td>מדיום הדמיה</td></tr><tr><td>גריז סיליקון</td><td>BECKMAN COULTER</td><td>335148</td><td>הכנת תא תצפית</td></tr><tr><td>דיסק מסתובב קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td>CSU-X1</td><td>תצפית הגירה גרעינית</td></tr><tr><td>שמן וולטלף 10S</td><td>VWR</td><td>24627 - 188</td><td>הכנת תא תצפית</td></tr></tbody></table>

הגירה גרעינית באוקיטה של דרוסופילה

Nuclear Migration in the Drosophila Oocyte

הדמיית תאים חיים נחוצה במיוחד כדי להבין את המנגנונים התאיים והמולקולריים המווסתים את תנועות האברונים, סידורים מחדש של ציטוסקלטון או דפוסי קוטביות בתוך התאים. בעת לימוד מיקום גרעין oocyte, טכניקות הדמיה חיה חיוניות כדי ללכוד את האירועים הדינמיים של תהליך זה. תא הביצים Drosophila הוא מבנה רב תאי ומערכת מודל מעולה ללמוד תופעה זו בשל גודלה הגדול וזמינות של כלים גנטיים רבים. במהלך Drosophila באמצע oogenesis, הגרעין נודד מעמדה מרכזית בתוך oocyte לאמץ עמדה אסימטרית בתיווך כוחות שנוצרו microtubule. נדידה זו ומיצוב הגרעין נחוצים כדי לקבוע את צירי הקוטביות של העובר ואת הזבוב הבוגר הבא. מאפיין אחד של הגירה זו הוא שהיא מתרחשת בשלושה ממדים (3D), יצירת צורך בהדמיה חיה. לכן, כדי לחקור את המנגנונים המסדירים הגירה גרעינית, פיתחנו פרוטוקול כדי לתרבות את תאי הביצים נותחו ולבצע הדמיה חיה במשך 12 שעות על ידי רכישות בזמן לשגות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב. בסך הכל, התנאים שלנו מאפשרים לנו לשמר את תאי הביצים של Drosophila בחיים במשך תקופה ארוכה של זמן, ובכך לאפשר את השלמת ההגירה הגרעינית להיות לדמיין במספר רב של דגימות בתלת-ממד.

לפני ההעברה, הגרעין דינמי ומתנדנד סביב מיקום מרכזי בתקופה המוגדרת כקדם-העברה. תנועות קטנות אלה משקפות איזון של דחיפה ומשיכת כוחות השומרים על שיווי משקל באמצע ביציות. על ידי כימות המסלולים של הגרעינים, הראינו כי מסלולי APM ו- LPM היו פרופורציות דומות. אנו מגדירים את אופי המסלול על ידי המגע הראשון בין הגרעין לבין קרום הפלזמה6. לפיכך, הגרעין מגיע ל-APM או ל-LPM לפני שהוא מחליק לאורכו, כדי להגיע למקומו הסופי בצומת של שתי קרום הפלזמה (איור 5,סרטים ...

בדרוסופילה, גרעין הביצית עובר הגירה תלוית מיקרוטובולה במהלך oogenesis. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שפותח כדי לעקוב אחר הנדידה על ידי ביצוע הדמיה חיה על תאי ביצה ex-vivo. ההליך שלנו שומר על תאי ביצים בחיים במשך 12 שעות כדי לרכוש סרטים תלת-ממדיים רב-תכליתיים לשגות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.

Live cell imaging is particularly necessary to understand the cellular and molecular mechanisms that regulate organelle movements, cytoskeleton ...

טכניקה זו מאפשרת לבחון תהליכים ביולוגיים ארוכים בתאי ביצים מפורקים של דרוזופילה, כגון הגירה גרעינית של ביציות, באמצעות מיקרוסקופיה חיה של הדמיה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לשמור על תאי הביצים נותחו בחיים במשך 12 שעות כדי לבצע מיקרוסקופיה הדמיה חיה. בתור התחלה, פיפטה 200 מיקרוליטרים של שניידר בינוני בתוספת עם 30 microliters של 10 מיליגרם לאינסולין מיליליטר, ולאחר מכן להוסיף ארבעה microliters של סרום עגל עוברי מומת חום.השתמש קצה פיפטה כדי להחיל כמות קטנה של שומן סיליקון סביב החור בצד התחתון של השקופית המנוקבת. מקם כיסוי, והשתמש בקצה הרחב של קצה פיפטה כדי להפעיל לחץ על כיסוי כדי לשטח את שומן הסיליקון ליצירת פנים טבעת סיליקון לשקופית. מעבירים את זבובי הנקבה המרדימה לבאר הניתוח המכילה 150 מיקרוליטרים של מדיום ההדמיה.לצורך ניתוח הנקבה, השתמש במלקחיים כדי לתפוס את בית החזה ולצבוט את בטן הבטן עם זוג שני של מלקחיים. הסר בזהירות את הרחם, oviduct, נדן שרירים. לבודד ולנתק את זוג השחלות הנראות על פתח חתך.מניחים טיפה של 10 עד 15 מיקרוליטרים של מדיום ההדמיה על השחלות, ומעבירים שחלה אחת לתא ההדמיה. להפרדת השחלות, השתמש במחט כדי להחזיק את הקצה האחורי של השחלה. השתמש במחט אחרת כדי למשוך בזהירות את הנבט להקניט את השחלות לגזרים.החזק את הנדן עם מחט אחת ולמשוך את השחלה דרך התאים הגדולים יותר עם מחט אחרת כדי להסיר את נדן השריר הנותר על תאי הביצים. אפשרו לחלותות שלא נושלו לשקוע ולצור קשר עם כיסוי. הסר את השלבים המאוחרים ואת שאר השחלות מן microchamber באמצעות מלקחיים.השתמש במחטים כדי להרחיק בזהירות את השחלות כדי להקל על הרכישה. חותכים ריבוע קטן של 10 על 10 מ"מ של הממברנה החדירות. יש למרוח בזהירות את הממברנה על החלק העליון של מדיום ההדמיה כדי לגרש את כל בועות האוויר.ואז לאטום הרמטית את התא עם שכבה דקה של שמן halocarbon סביב הבאר על קווי המתאר של הממברנה. מקם את הגדרת ההדמיה על מחזיק השקופית של המיקרוסקופ ההפוך והשתמש במטרה פי 40. נדידת גרעין הביצית של תא ביצים מסוג בר נתפסה באמצעות מיקרוסקופיה חיה של הדמיה.הגרעין מגיע לקרום הפלזמה הנעים או לקרום הפלזמה לרוחב לפני שהוא מחליק לאורך המסלולים כדי להגיע למיקומו הסופי בצומת של שתי קרום הפלזמה. עיוותים בממברנה, תאי זקיקים לא מאורגנים, תאים מעוכבים וגרעינים מכווצים הם הסימנים הראשונים לתאי ביצים גוססים. oocyte מנוון לפני שמונה שעות של הדמיה אינו מזוהה בדרך כלל.עם זאת, מקרים נדירים של ניוון מוקדם נובעים מבעיות במהלך השלבים התת-ניתוח או הרכבה. פגיעה בתאי הביצים מסכנת את הישרדותם. אז ניתוח יד עדין מדויק והכנת המיקרו-צ'מבר הם בעלי חשיבות עליונה.הליך זה איפשר לנו לדמיין כי גרעין ביציות יכול לקחת שלושה מסלולים שונים במהלך נדידתו ואברונים שונים לווסת מסלולים אלה בתוך ביציות.

nuclear-migration-in-the-drosophila-oocyte

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

כאן אנו מדגימים microinjection cytoplasmic...

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

Hemocytes תסיסנית לפזר מעל מכלול של העובר המתפתח. פרוטוקול זה מדגים כיצד הר התמונה באמצעות העברות אלה עוברים עם hemocytes שכותרתו fluorescently.

הדמיה חיה של תסיסנית melanogaster Hemocyte נדידות עובריים

פרוטוקול עבור הדמית חיה של חלבוני GFP-tagged או מבני autofluorescent...

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

מסמך זה מדגים את השימוש במיקרוסקופ confocal סריקה מהירה לתמונת התנהגות תא ישירות דרך הגולם. מאת עוזב את המקרה גלמי שלם, שיטה זו מאפשרת תצפית ומדידה של תהליכים בתא דינמיים בשלב של פיתוח דרוזופילה שקשה ללמוד באופן ישיר.

הדמיה באמצעות המקרה גלמי של<em&gt; Melanogaster דרוזופילה</em

שיטת ההדמיה הזקופה המתוארת בפרוטוקול זה מאפשרת הדמיה מפורטת של הקטבים של ביצית דרוזופילה מלנוגסטר מתפתחת.  מבט מקצה לקצה זה מספק פרספקטיבה חדשה על הסידורים והמורפולוגיה של סוגי תאים מרובים באפיתל הזקיקים.

הדמיה זקופה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; לשכות ביצה

אנו מציגים פרוטוקולים לאיסוף, הכנה והדמיה של ביציות דרוזופילה בוגרות. שיטות אלו מאפשרות הדמיה של התנהגות הכרומוזומים והרכבת הציר ותפקודו במהלך מיוזה.

טכניקות הדמיה prometaphase ו Metaphase של המיוזה ואני קבוע<em&gt; תסיסנית</em&gt; ביציות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול עבור ויזואליזציה, זיהוי, ניתוח ומעקב של סחר האנטי-מסוגגני mRNA בחיים Drosophila ילה מלאנוסטר תא ביצה באמצעות משואות מולקולריות, מיקרוסקופיה דיסק מסתובב, וניתוח קוד פתוח תוכנה.

חזותי ומעקב אחר mRNAs בשידור חי דרוזוסופילה מלאנוגסטר צ'יימברס

המטרה של פרוטוקול זה היא לנתח את חלוקת התא ברקמה שלמה על ידי מיקרוסקופ התאים החיים והקבוע באמצעות דרוסוילה מיוטיק מאיוציטים. הפרוטוקול מדגים כיצד לבודד את כל האשכים שלמים, מזחלים מדרוזופילה ומהגלמים המוקדמים, וכיצד לעבד ולטעון אותם למיקרוסקופיה.

הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

בעובר דרוזופילה המוקדם, אברונים רבים הם תנועתיים. באופן עקרוני, ניתן לדמות אותם בשידור חי באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות ספציפיות, אך קליפת הביצית מונעת יישום ישיר על העובר. פרוטוקול זה מתאר כיצד להציג בדיקות כאלה באמצעות מיקרו-איניג'קציה, ולאחר מכן לנתח תנועת אברונים בתפזורת באמצעות ולוסימטריה של תמונת חלקיקים.

הדמיה של סחר תלוי-שלד ציטוסקלטון של אברונים המכילים שומנים בעוברי דרוזופילה

פרוטוקול זה מספק מסגרת ניסויית לתיעוד ההשפעה הפיזית של השלד הציטו-שלד על הצורה הגרעינית ועל האברונים חסרי הקרום הפנימי במערכת הביציות של העכבר. ניתן להתאים את המסגרת לשימוש בסוגי תאים ובהקשרים אחרים.

לכידת תסיסה מבוססת שלד של גרעין ביצית העכבר על פני קני מידה מרחביים

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לביצוע הדמיה חיה של החלוקה הא-סימטרית של תאי גזע של קו הנבט (GSCs) בנישת השחלות של דרוזופילה. אנו משתמשים בקו טרנסגני המבטא בכל מקום היתוך חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) של חלבון הספקטרוזום Par-1.

הדמיה חיה מורחבת של נישות תאי גזע נקבות Drosophila melanogaster

למדו תצפית בהגירה גרעינית באוקיטה של דרוסופילה באמצעות מיקרוסקופיית הדמיה חיה. הפרוטוקול מאפשר שימור חללי ביצים ל-12 שעות לצילום תלת-ממדי מפורט של תהליכים דינמיים.

הגירה גרעינית באוקיטה של דרוסופילה

גלה סרטונים נוספים