הגירה גרעינית באוקיטה של דרוסופילה
May 13th, 2021
בדרוסופילה, גרעין הביצית עובר הגירה תלוית מיקרוטובולה במהלך oogenesis. כאן, אנו מתארים פרוטוקול שפותח כדי לעקוב אחר הנדידה על ידי ביצוע הדמיה חיה על תאי ביצה ex-vivo. ההליך שלנו שומר על תאי ביצים בחיים במשך 12 שעות כדי לרכוש סרטים תלת-ממדיים רב-תכליתיים לשגות באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.
טכניקה זו מאפשרת לבחון תהליכים ביולוגיים ארוכים בתאי ביצים מפורקים של דרוזופילה, כגון הגירה גרעינית של ביציות, באמצעות מיקרוסקופיה חיה של הדמיה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לשמור על תאי הביצים נותחו בחיים במשך 12 שעות כדי לבצע מיקרוסקופיה הדמיה חיה. בתור התחלה, פיפטה 200 מיקרוליטרים של שניידר בינוני בתוספת עם 30 microliters של 10 מיליגרם לאינסולין מיליליטר, ולאחר מכן להוסיף ארבעה microliters של סרום עגל עוברי מומת חום.
השתמש קצה פיפטה כדי להחיל כמות קטנה של שומן סיליקון סביב החור בצד התחתון של השקופית המנוקבת. מקם כיסוי, והשתמש בקצה הרחב של קצה פיפטה כדי להפעיל לחץ על כיסוי כדי לשטח את שומן הסיליקון ליצירת פנים טבעת סיליקון לשקופית. מעבירים את זבובי הנקבה המרדימה לבאר הניתוח המכילה 150 מיקרוליטרים של מדיום ההדמיה.
לצורך ניתוח הנקבה, השתמש במלקחיים כדי לתפוס את בית החזה ולצבוט את בטן הבטן עם זוג שני של מלקחיים. הסר בזהירות את הרחם, oviduct, נדן שרירים. לבודד ולנתק את זוג השחלות הנראות על פתח חתך.
מניחים טיפה של 10 עד 15 מיקרוליטרים של מדיום ההדמיה על השחלות, ומעבירים שחלה אחת לתא ההדמיה. להפרדת השחלות, השתמש במחט כדי להחזיק את הקצה האחורי של השחלה. השתמש במחט אחרת כדי למשוך בזהירות את הנבט להקניט את השחלות לגזרים.
החזק את הנדן עם מחט אחת ולמשוך את השחלה דרך התאים הגדולים יותר עם מחט אחרת כדי להסיר את נדן השריר הנותר על תאי הביצים. אפשרו לחלותות שלא נושלו לשקוע ולצור קשר עם כיסוי. הסר את השלבים המאוחרים ואת שאר השחלות מן microchamber באמצעות מלקחיים.
השתמש במחטים כדי להרחיק בזהירות את השחלות כדי להקל על הרכישה. חותכים ריבוע קטן של 10 על 10 מ"מ של הממברנה החדירות. יש למרוח בזהירות את הממברנה על החלק העליון של מדיום ההדמיה כדי לגרש את כל בועות האוויר.
ואז לאטום הרמטית את התא עם שכבה דקה של שמן halocarbon סביב הבאר על קווי המתאר של הממברנה. מקם את הגדרת ההדמיה על מחזיק השקופית של המיקרוסקופ ההפוך והשתמש במטרה פי 40. נדידת גרעין הביצית של תא ביצים מסוג בר נתפסה באמצעות מיקרוסקופיה חיה של הדמיה.
הגרעין מגיע לקרום הפלזמה הנעים או לקרום הפלזמה לרוחב לפני שהוא מחליק לאורך המסלולים כדי להגיע למיקומו הסופי בצומת של שתי קרום הפלזמה. עיוותים בממברנה, תאי זקיקים לא מאורגנים, תאים מעוכבים וגרעינים מכווצים הם הסימנים הראשונים לתאי ביצים גוססים. oocyte מנוון לפני שמונה שעות של הדמיה אינו מזוהה בדרך כלל.
עם זאת, מקרים נדירים של ניוון מוקדם נובעים מבעיות במהלך השלבים התת-ניתוח או הרכבה. פגיעה בתאי הביצים מסכנת את הישרדותם. אז ניתוח יד עדין מדויק והכנת המיקרו-צ'מבר הם בעלי חשיבות עליונה.
הליך זה איפשר לנו לדמיין כי גרעין ביציות יכול לקחת שלושה מסלולים שונים במהלך נדידתו ואברונים שונים לווסת מסלולים אלה בתוך ביציות.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
פרוטוקול זה מפרט שיטה לצפייה בנדידת גרעין הביצית ב-Drosophila באמצעות מיקרוסקופיה חיה. הטכניקה מאפשרת שמירה על תאי ביציות מנותחים למשך 12 שעות, ומאפשרת צילום סרטי זמן ארוך תלת-ממדיים ממספר זוויות.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה תאית
- ביולוגיה התפתחותית
רקע
- Drosophila משמשת כאורגניזם מודלי לחקר ביצית.
- נדידה תלוית מיקרו-צינוריות חיונית להתפתחות הביצית.
- טכניקות צילום חיות משפרות את ההבנה של תהליכים תאיים דינמיים.
- שמירה על כדאיות תאי הביצית חיונית לצילום לטווח ארוך.
מטרת המחקר
- לפתח פרוטוקול לצילום חי של נדידת גרעין הביצית.
- לשמור על תאי ביציות בחיים לפרקי זמן ארוכים במהלך התצפית.
- להשתמש במיקרוסקופיית דיסק מסתובבת קונפוקלית לצילום מפורט.
שיטות ששימשו
- הכנת מדיום Schneider המשלים באינסולין וסרום עגל עוברי.
- יישום של חומר סיכה סיליקוני ליצירת סביבת צילום יציבה.
- ניתוח זבובות נקביות כדי להשיג תאי ביציות לצילום.
- שימוש במיקרוסקופיית דיסק מסתובבת קונפוקלית לצילום סרטי זמן ארוך.
תוצאות עיקריות
- שמירה מוצלחת על תאי ביציות למשך 12 שעות במהלך הצילום.
- הדגמה ברורה של תהליכי נדידת גרעין הביצית.
- הוכחת האפקטיביות של טכניקות צילום חיות.
- תרומה להבנת הביולוגיה ההתפתחותית ב-Drosophila.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר תצפית מפורטת על הדינמיקה של הביצית.
- צילום חי מספק תובנות למנגנוני נדידה תאית.
- שיטה זו יכולה להיות מיושמת על תהליכים ביולוגיים אחרים ב-Drosophila.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Understanding nuclear migration dynamics in model systems like Drosophila oocytes provides foundational insights into cytoskeletal regulation and intracellular transport mechanisms relevant to target validation in cell-based assays. Live imaging of 3D organelle movement enables mechanistic de-risking of hypotheses involving motor proteins, microtubule stability, or polarity establishment—key considerations in early discovery where phenotypic screening relies on subcellular readouts. This approach supports predictive confidence by linking molecular perturbations to observable, quantifiable cellular behaviors in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses related to cytoskeletal regulators and nuclear positioning proteins through direct visualization of migration trajectories.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating genetic or pharmacological perturbations with alterations in 3D nuclear movement patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates assay standardization by providing quantitative, time-resolved readouts of nuclear position and migration kinetics in a controlled, long-term imaging environment.
- Operational Value: Enhances screening readiness through reproducible chamber preparation and stable viability of Drosophila egg chambers for up to 12 hours, enabling multi-condition comparisons.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Offers a disease-relevant system to study polarity defects linked to developmental disorders, supporting translational biomarker exploration via correlation of nuclear mislocalization with phenotypic outcomes.
- Operational Value: Promotes translational continuity by allowing discovery-phase findings to be validated in a genetically tractable, live-imaging-compatible model before mammalian system translation.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through assay optimization to preclinical validation, particularly when nuclear dynamics or cytoskeletal function are central to the mechanism of action.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and biological de-risking by visualizing how specific gene knockdowns or compound treatments alter nuclear migration in real time.
- Screening: Enables assay readiness through standardized chamber setup and quantitative 3D tracking of nuclear position as a functional readout for compound effects.
- Analytics: Generates measurable outputs such as migration velocity, trajectory choice, and final nuclear positioning, which can be statistically compared across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by establishing a causal link between nuclear positioning defects and developmental phenotypes, informing risk-adjusted advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying intracellular transport, organelle positioning, or polarity establishment across multiple projects in developmental and cell biology.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target mechanisms by reducing ambiguity in how molecular interventions affect subcellular organization and dynamics.
- Operational Value: Delivers standardization and reproducibility via a validated chamber preparation protocol that maintains tissue viability for extended live imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making by providing early, observable phenotypic anchors for targets involved in cytoskeletal regulation or intracellular transport.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their demonstrated impact on nuclear migration, a process linked to cell fate and developmental integrity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila dissection, live imaging microscopy, and fluorescent sample preparation.
- Depends on access to spinning-disk confocal or equivalent long-term 3D imaging systems with environmental control.
- Necessitates standardization of chamber sealing and medium composition across teams to ensure consistent egg chamber survival.
- Involves adaptation considerations when applying the chamber system to other tissue types or developmental stages beyond mid-oogenesis.
- Limited by the physiological relevance of Drosophila to human disease, necessitating orthogonal validation in mammalian systems for translational targets.
