מערכת O9-1/הידרוג'ל ממוטבת לחקר אותות מכניים בתאי ציצית עצבית

השיטה מסייעת בחקר האיתות המכני של תאי הסמל העצבי והאינטראקציה שלו עם אותות כימיים. זה יכול גם לסייע במנגנונים המולקולריים והגנטיים של התפתחות הסמל העצבי במחלות. העברת פתקי כיסוי הזכוכית היא המאתגרת ביותר ולכן מעבירים אותם לאט ובתשומת לב כדי למנוע שבירה והורדתם.

אם נדגים את ההליך, אני וד"ר שרי זאו, פוסט-דוקטורנט מהמעבדה שלי. התחל על ידי הצבת המספר הרצוי של כיסוי זכוכית מחליק על פיסת מגבון מעבדה. לאחר מכן לעקר כל פיסת כיסוי על ידי העברתו הלוך ושוב דרך הלהבה של מבער האלכוהול.

כאשר החלקות הכיסוי מתקררות, מכסים את החלקת הכיסוי של 12 מ"מ עם כ -200 מיקרוליטרים וכיסוי 25 מ"מ להחליק עם 800 microliters של 0.1 נתרן הידרוקסיד טוחנת. לאחר חמש דקות, לשאוף נתרן הידרוקסיד ולאפשר את החלקות הכיסוי לאוויר יבש במשך חמש דקות כדי ליצור סרט אחיד. לאחר כיסוי החלקות מיובשים, להוסיף כ 18 microliters של אמינופרופיל triethoxysilane או APTS על תלוש כיסוי 12 מילימטר ו 150 microliters של APTS על תלוש כיסוי 25 מילימטר.

שאפו גישה APTS כדי לאפשר APTS שיורית להתייבש במשך חמש דקות. מאוחר יותר, לשטוף את כיסוי מחליק שלוש פעמים על ידי שקוע אותם במים deionized סטרילי במשך חמש דקות בכל פעם. מעבירים את פתקי הכיסוי השטופים לצלחת פטרי טרייה כשהצד הריאקטיבי פונה כלפי מעלה.

ולטפל בתלושי הכיסוי על ידי השריה במספיק 0.5% גלוטרדהיד במשך 30 דקות. לאחר שאיפת glutaraldehyde, לשטוף את החלקות הכיסוי פעם אחת עם מים deionized במשך שלוש דקות אוויר יבש את הכיסוי מחליק עם הצד תגובתי למעלה. כדי להכין את כיסוי סיליקון מחליק, מניחים את המספר השווה של פתקי כיסוי כמו כי aminosilane מצופה כיסוי מחליק בצלחת פטרי מרופד בסרט para.

לאחר מכן, לטפל 12 מילימטר כיסוי מחליק עם 40 microliters 25 מילימטר כיסוי מחליק עם 150 microliters של סילאן דיכלורומתאן או DCMS במשך חמש דקות. לשטוף את כיסוי מחליק עם מים deionized סטרילי פעם אחת במשך דקה אחת לפני הנחת כיסוי תגובתי מחליק עם הפנים כלפי מעלה על מגבון מעבדה. כדי להכין את ההידרוג'ל, פיפטה מוכנה טרי פתרון ג'ל אקרילאמיד על החלקי כיסוי מצופים aminosilane מיובש.

באמצעות פינצטה מעוקלת, העבר מיד את החלק הכיסוי המטופל DCMS על גבי פתרון הג'ל כאשר הצד המטופל נוגע בתמיסת הג'ל ובכך סנדוויץ ' לשנות את פתרון הג'ל בין שתי תלושי כיסוי. לאחר הג'ל הוא פולימר, להפריד את DCMS מטופל כיסוי להחליק עם פינצטה מעוקלת, משאיר את הג'ל מחובר לכיסוי מצופה aminosilane. לאחר מכן, שקועים בתלוש הכיסוי של 12 מ"מ עם ההידרוג'ל המצורף בלוח קבוע מראש של 4 בארות או 24 בארות המכוסה ב-500 מיקרוליטרים של PBS סטריליים או מים שעברו דה-תיופח, וכיסוי 25 מ"מ בצלחת של 6 בארות מכוסה בשני מיליליטר של PBS סטרילי או מים שעברו דה-תיוין במשך 30 דקות.

לאחר הסרת תמיסת אקרילאמיד עודף, לאחסן את hydrogels PBS סטרילי או מים deionized בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות. מאוחר יותר, שאפו PBS או מים deionized מצלחת הבאר לפני הוספת סולפו-סוקינימידיל או פתרון סולפו-SUNPAH כדי לכסות את הג'ל לחלוטין. ומניחים את הג'לים עם הפתרון תחת 15 וואט, 365 ננומטר אור אולטרה סגול נחשף במשך 10 דקות.

לאסוף כמה שיותר של סולפו-SANPAH לכל פתרון ככל האפשר על ידי הטיית הצלחת. ואז לשטוף את הג'ל פעמיים עד שלוש פעמים עם HEPES 15 מילימולר. הוסיפו 15 מיליגרם לקולגן מיליליטר 1 מדולל ב-0.2% חומצה אצטית לכל באר המכילה את ההידרוג'ל.

ודגר את הג'לים בין לילה ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. למחרת, בצע את הכביסה כמתואר בכתב היד לפני דגירה הידרוג'ל עם PBS המכיל 10% סרום סוס ו 5% FBS ב 37 צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר שעתיים של דגירה, להוסיף 500 microliters של DMEM מסונן סטרילי עם 10% FBS ו 1%פניצילין סטרפטומיצין לכל באר ולאחסן את הג'לים ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני.

כאשר תרבית התא מוכנה, צלחת בערך 1.5 כפול 10 עד הרביעי 09-1 תאים לסנטימטר בריבוע במדיום בזל. השתמש פינצטה כדי להעביר את פתקי הכיסוי לצלחת חדשה כדי למזער אותות שווא מהתאים שגדלו ישירות על הצלחת. לאחר מכן, לתקן את התאים באמצעות 500 microliters של 4%paraformaldehyde במשך 10 דקות לפני טיפול בתאים עם 500 microliters של 0.1% טריטון X-100 בטמפרטורת החדר.

לאחר 15 דקות, ללכת בתאים עם 250 microliters של סרום חמור 10%. להכתים את התאים עבור F-actin עם felodipine בדילול של 1 עד 400 ב 250 microliters של סרום חמור 10%, ואחריו דגירה עם DAPI במשך 10 דקות. לשטוף את התאים עם PBS במשך שתי דקות לפני הוספת שלוש עד ארבע טיפות של הרכבה בינונית לכל באר.

במיקרוסקופ פלואורסצנטי, ללכוד את התמונות של לפחות שלוש מסגרות אקראיות לכל מדגם הידרוג'ל לייצר ערוצים בודדים וממוזגים. בהערכת הנוקשות של ההידרוג'ל באמצעות מיקרוסקופיה של כוח אטומי או AFM, השיפוע של עקומת הכוח היה עדין להידרוג'לים רכים מכיוון שהכוח הנדרש מהגשושית AFM היה פחות. עם זאת, על הידרוג'ל נוקשה, המדרון שנוצר היה הרבה יותר תלול.

מדידות AFM שימשו אז לחישוב הנוקשות הממוצעת של הידרוג'לים מהמודולות האלסטיות של יאנג בקילפסקלים. מאפייני הצמיחה של תאי P19 ו- 09-1 נצפו בקילפסקיל אחד ו -40 קילופסקל הידרוג'לים של שליטה ומערכות ג'ל מותאמות. 09-1 תאים גדלו על מערכות הג'ל המקוריות הביא מספר גבוה יותר של תאים מתים.

לעומת זאת, תאי 09-1 שגדלו במערכות הג'ל המותאמות הציגו צמיחת תאים בריאה וחיבור מספיק למצע ההידרוגלס עם סיפון התא הקטן המצוין על ידי תאים עגולים מינימליים. תאי P19 מצופים בשתי מערכות הידרוג'ל הציגו עודף של תאים צפים עגולים וחוסר קבצים מצורפים למצע התא. התאימות של תאי ציצית עצבית או NCCs עם מערכת הידרוג'ל שונה הוערך על ידי כתמים immunofluorescent עבור AP-2.

נצפתה עלייה משמעותית בביטוי AP-2 בתאי 09-1 מצופים במערכת ההידרוג'ל שהשתנתה. בנוסף, 09-1 תאים הציגו morphologies שונים המבוססים על הידרוג'ל נוקשות נמוכה או גבוהה באמצעות כמויות שונות של סיבי הלחץ. הביטוי האנטי-וינקולין בתאי 09-1 שגדלו על הידרוג'ל 40 קילופסקל היה גבוה יותר מאלה שגדלו על הידרוג'ל קילופסקל אחד המשקף כי התאים הגדלים על מצעים רכים יותר יוצרים מתחמי תוספת מוקד מינימליים מאשר המצע נוקשה.

זמן המתנה מתאים הוא חיוני עבור פילמור של הידרוג'ל כמו אקרילאמידים רעילים לתאים. שקועים הידרוג'ל ב- PBS או במים שעברו דה-יונים למשך 30 דקות לפחות כדי להבטיח תוצאות טובות יותר.