Name: ניתוח כמותי 31P NMR של ליגנינים וטאנינים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-02T13:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: למד ניתוח כמותי של ליגנינים וטאנינים באמצעות ספקטרוסקופיית NMR פוספור-31. שיטה זו מאפשרת כימות מהיר ומדויק של קבוצות הידרוקסיל שונות במבנים פוליפנוליים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה לאורך השנים על ידי פרסים כספיים שונים שכללו ארגונים כגון מכון לחקר עיסת נייר של קנדה, אוניברסיטת מקגיל מונטריאול, המועצה למדעי הטבע ומחקר ההנדסה של קנדה, הקרן הלאומית למדע ארה"ב, מחלקת החקלאות של ארצות הברית וחברת סולביי.

תרשים הזרימה הבא (איור 6) מתאר את כל פרוטוקול הניסוי לביצוע ניתוח 31P NMR של ליגנינים וטאנינים.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig06.jpg"> איור 6: נוהל ניתוח 31P NMR של ליגנינים וטאנינים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
1. טיפול קדם מדגם
<ol><li>יבש עליקוט (כ-100 מ"ג) של האנליטה (דגימת ליגנין או טאנין) למשך הלילה בתנור ואקום שנקבע על 40 מעלות צלזיוס. הערה: תשומת לב מיוחדת נדרשת על בחירת הטמפרטורה מאז טמפרטורות גבוהות מ 40 °C (50 °F) עשוי כימית לשנות את המבנה הרגיש של פוליפנולים שנבדקו.</li>
	<li>לאחר הייבוש, מעבירים במהירות את הדגימה למייבש סידן גופרתי נטול מים עד שהוא מגיע לטמפרטורת החדר. שלב זה הוא חובה כדי למנוע את הדגימה סופג לחות מהסביבה.</li>
</ol>2. הכנת פתרון ממס
<ol><li>הכן תערובת ממס כלורופורם pyridine/deuterated במין מדגם 20 מ"ל על ידי ערבוב פירידין נטול מים וכלורופורם deuterated ביחס 1.6/1 (v/v). זהירות: שים לב בעת מניפולציה פירידין וכלורופורם deuterated. תרכובות אלה דליקות, מזיקות ורעילות. הכן והשתמש בתמיסה במכסה אדים מאוורר היטב באמצעות כפפות מתאימות.</li>
	<li>הוסיפו 5-8 גרם של מסננות 5A מולקולריות שטופים ומיובשים היטב בכדורי 3.2 מ"מ להסרת עקבות מים. בנוסף, השימוש במכסה מחיצה מומלץ מאוד למנוע מגע אוויר וזיהום לחות של מערכת הממס. אחסן את הפתרון המוכן בחושך.</li>
</ol>3. הכנת פתרון סטנדרטי פנימי (IS)
<ol><li>בבקבוק ארלנמאייר 2 מ"ל, להכין פתרון 0.1 M של כרום (III) אצטילאצטון (כ 10 מ"ג) ותקן פנימי (סביב 35.8 מ"ג של NHND או 77.3 מ"ג של כולסטרול) בתמיסה ממס שהוכן בעבר. זהירות: כרום (III) אצטילאצטוניאט מזיק; במהלך המניפולציה שלה, ללבוש כפפות מתאימות.</li>
	<li>רשום את המשקל המדויק של IS שנוסף בפתרון IS.</li>
	<li>העבר את פתרון IS בקבאליה המצוידת במכסה אטום המכיל מסננות מולקולריות מופעלות (ראה נקודה 2.2) ולאחסן אותו בחושך ב 40 °C (40 °F).</li>
</ol>4. הכנת פתרון מדגם NMR
<ol><li>שוקלים במדויק כ-30 מ"ג דגימה ב-2 מ"ל המצוידים בחטיף ערבוב. אוטמים את הוויאל עם כובע מחיצה.</li>
	<li>הוסף 0.5 מ"ל של פתרון מערכת ממס לביל למשלה לדוגמה.</li>
	<li>העבר 100 μL של פתרון IS בבקבוקון מדגם באמצעות micropipette. מערבבים מגנטית את הפיזור המתקבל (500 סל"ד) עד שכל ליגנין או טאנין מומסים, וכתוצאה מכך פתרון ברור. הערה: מאז solubilization מדגם מלא הוא הכרחי, צעד זה יכול לקחת עד 12 שעות.</li>
	<li>העבר 0.1 מ"ל של TMDP לפתרון לדוגמה. מניחים את הדגימה תחת ערבוב מגנטי נמרץ. שמור את הפתרון לדוגמה אטום. השתמש TMDP בברדס אדים מאוורר היטב תוך לבישת כפפות מתאימות. זהירות: TMDP והאדים שלה הם מאכלים, מזיקים, אינטראקציה מהירה עם מים. הערה: היווצרות של משקעים צהובים נובעת עקבות מים במדגם או תמיסת הפירידין/ כלורופורם. במקרה כזה, יש לחזור על ההליך על ידי הבטחת כל זיהום הלחות האפשרי נמנע.</li>
	<li>העבר את הפתרון לדוגמה לתוך צינור NMR באמצעות פיפטה פסטר.</li>
</ol>5. ניתוח NMR
<ol><li>טען את הצינור לתוך מכשיר NMR. הספקטרומטר המשמש לביצוע ניתוח זה זקוק לבדיקת פס רחב.</li>
	<li>תקן את הפרמטרים הניסיוניים בהתאם להגדרה המוצגת בטבלה 11.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>תוכנית PULSE</td>
			<td>פולס ניתוק מגודר הפוך (זיג)</td>
		</tr>
<tr>
<td>גרעין</td>
			<td>31P</td>
		</tr>
<tr>
<td>רוחב ספקטרלי</td>
			<td>22: 00.m.</td>
		</tr>
<tr>
<td>זמן רכישה</td>
			<td>- 0.8 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>עיכוב הרפיה</td>
			<td>≥ 10</td>
		</tr>
<tr>
<td>מספר סריקות</td>
			<td>64 או יותר</td>
		</tr>
<tr>
<td>מרכז ספקטרום</td>
			<td>140 אחה"צ.m.</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: פרמטרים ניסיוניים כדי להקליט ספקטרום 31P NMR של ליגנינים נגזרים או טאנינים.
<ol start="3"><li>הגדר את תדר הספקטרומטר באמצעות תדר התהודה של כלורופורם מפורק, שים את הדגימה וכוון את הספקטרומטר. לאחר מכן, התחל את הרכישה.</li>
</ol>6. עיבוד וניתוח ספקטרום
<ol><li>עבד נתונים גולמיים של P NMR 31על-ידי תוכנה סטנדרטית מתאימה בהתאם לשלבים הבאים.<ol>
<li>בצע טרנספורמציה פורייה.</li>
		<li>התאם שלב לפי תיקון פאזה ידני (עיבוד | | תיקון פאזה תיקון ידני).</li>
		<li>תקן את תוכנית הבסיס באופן ידני, הגדר בזהירות אפס נקודות(עיבוד | | בסיסית תיקון בסיסי מרובה נקודות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>כיול אותות.<ol>
<li>הגדר את האות עבור המים הפוספטיים בערך שינוי כימי של 132.2 ppm (ניתוח | | הפניות הפניה). הערה: הנוכחות של אות חד של 31P ב- 175 ppm נובעת מעודף של TMDP. נוכחותו מבטיחה את ההפקה המלאה של המדגם. אם שיא זה נעדר, יש לבחון מחדש את כל ההליך על ידי מתן דגימה יסודית וייבוש ממס והוספת TMDP נוסף. ברגע שזה מובטח, הספקטרום מוגדל בטווח הספקטרום 132 עד סביבות 150 ppm(איור 7).</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig07.jpg"> איור 7: בדוק את נוכחותו של עודף של TMDP: אם ניתן לראות אותו, נגזרת המדגם הושלמה. לאחר מכן ניתן לנתח את הספקטרום. כדי לעשות את הזום בטווח הספקטרלי שבין 155 ל-132 ppm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<ol start="3"><li>שילוב<ol>
<li>נרמל את האינטגרציה על-ידי הגדרת התקן הפנימי ל- 1.0 (לחץ על שיא | עריכת | אינטגרלי מנורמל: 1.00). בצע שילוב ספקטרום בהתאם לשינויים הכימיים המדווחים בטבלאות הבאות. השתמש בטבלה 2 עבור ליגנינים וטבלה 3 עבור טאנינים.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>קבוצה פונקציונלית</td>
			<td>משמרת כימית (ppm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>אליפטית אוה</td>
			<td>149.0-146.0</td>
		</tr>
<tr>
<td>פנוולית OH</td>
			<td>144.0-137.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>C5 הוחלף פנוליות OH</td>
			<td>143.0-140.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5-5' פנוולי OH</td>
			<td>141.7-140.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>סירינגיל או</td>
			<td>143.2-142.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>4-O-5' OH</td>
			<td>142.8-141.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>גואיאקיל אוה</td>
			<td>140.2-138.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>p-הידרוקסיפניל OH</td>
			<td>138.8-137.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>COOH</td>
			<td>136.0-133.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>טריצין</td>
			<td>137.0-136.0</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: 31P NMR משמרות כימיות עבור קבוצות OH פוספיות ליגנין.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>קבוצה פונקציונלית</td>
			<td>משמרת כימית (ppm)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">טבעת א'</td>
		</tr>
<tr>
<td>o-פנוליות לא מזוהות</td>
			<td>137.9–137.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>פנוליות שהוחלף o</td>
			<td>138.8–137.9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">טבעת ב'</td>
		</tr>
<tr>
<td>קטכול או</td>
			<td>140.2–138.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>פירוגלול אוה</td>
			<td>144.0–140.2</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">טבעת C</td>
		</tr>
<tr>
<td>אליפטיק אוהו</td>
			<td>146.0–145.0</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 3: 31P NMR שינוי כימי עבור טאנין פוספילט קבוצות OH.
הערה: באמצעות תוכנת עיבוד ספקטרלית סטנדרטית, ניתן להגדיר אזורים מוגדרים מראש של המשמרת הכימית שישולבו. הזדמנות זו היא יתרון כאשר מספר ספקטרום צריך להיות מעובד.
7. כימות קבוצתי פונקציונלי
<ol><li>חשב את הריכוז של פתרון IS. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62696/62696eq1v2.png">
</li>
	<li>חשב את הכמות המקבילה של האות הספציפי: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62696/62696eq2v2.png"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/62696/62696eq3v2.png">
</li>
</ol>

קלאודיה קרסטיני ודימיטריס S ארגירופולוס מבטיחות שלכל המחברים (ג.C, נ.פ. ו- D.S.A. ) אין ניגודי עניינים.

השיטה המתוארת מייצגת את היישום והאופטימיזציה של הפרוטוקול האנליטי שמטרתו אפיון איכותי וכמותי של ליגנינים כפי שפותח על ידי ארג'ירופולוס37,38,39,40,41,42. בהשוואה לטכניקות רבות אחרות הזמינות להבהרה מבנית של ליגנין, השיטה התקבלה באופן נרחב כאחת ההרחבות, המהירות והשחזוריות ביותר. תוקפן של השיטות הכימיות הרטובות (למשל, ניטרבנזן, חמצון פרמנגנט וכו ') מסתמך על הכישורים הניסיוניים הטובים של המפעיל, ולמעשה ממזג את השיטה למפעילים מוגבלים. יתר על כן, אין זה נדיר להיתקל בגורמי תיקון בספרות עבור שיטות כימיות רטובות כדי להסביר כמה חסרונות. פרוטוקול 31P NMR המתואר אינו דורש כישורי ניסוי מתקדמים, מה שהופך את זה לייש, ידידותי למשתמש וזמין באופן נרחב. בהשוואה לשיטות אנליטיות אינסטרומנטליות אחרות, 31P NMR היא הטכניקה היחידה המסוגלת לזהות ולכומת במדויק את קבוצות ההידרוקסי השונות בליגנינים. לדוגמה, ניתן להשתמש ב- FTIR כדי לזהות קבוצות הידרוקסיות שונות כגון 1H NMR. שתי הטכניקות, לעומת זאת, סובלות מכיוון שהן אינן יכולות להציע נתונים כמותיים אמינים עקב בעיות חפיפה נרחבות של אותות. טכניקה נפוצה נוספת היא ספקטרוסקופיה UV-Vis, שדווחה לראשונה על ידי גולדשמיד. הגישה, עם זאת, מוגבלת לקביעה כללית של קבוצות הידרוקסיה שכן היא אינה יכולה להבדיל ביעילות בין OHs47,ארומטי וקרבוקסי .
מנקודת מבט כלכלית, המגבלה היחידה של טכניקת 31P NMR היא המחיר של TMDP, שהוא ריאגנט יקר יחסית. זה עולה כ 190 USD לגרם; כתוצאה מכך, אם עלות הניתוח תהיה משוערת רק למחיר של TMDP, למעט אלה הנובעים מתערובת הפירידין / כלורופורם ואלה של זמן המפעיל, זה יסתכם בכ -24 דולר לניתוח. כדי לפתור בעיה זו, מעבדות רבות לנקוט לסנתז TMDP, ובכך, הפחתת עלויות ריאגנט. כדי לעשות זאת, pinacol ו זרחן טריכלוריד מגיבים בנוכחות טריאתילאמין44. מבחינה טכנית, תגובה זו קלה יחסית; עם זאת, טיפול בשימוש טריכלוריד זרחן ואת העבודה שלה, כולל זיקוק ואקום מבוקר היטב, נדרש. פרטים נוספים על הסינתזה של TMDP ניתן לספק על פי בקשה.
למרות שפרוטוקול זה הוא בין הטובים ביותר מבחינת קלות, שחזור ודיוק, יש להדגיש כמה נקודות קריטיות. ראשית, המדגם צריך להיות מסיס לחלוטין בתערובת פירידין / כלורופורם מזוהה. שיקול זה הוא בסיסי כי התגובה הכמותית פוספטיליציה של קבוצות הידרוקסיל צריך להתקיים בתנאים הומוגניים לחלוטין. אם רק חלק מהדגימה הוא solubilized, הניתוח המתקבל יהיה לא מדויק. שנית, המדגם שיש לבחון צריך להיות ללא לחות וללא ממסים שכן משתנים אלה ישפיעו לרעה על הדיוק וההצלחה הכוללת של הניתוח. עקבות של לחות יגיבו עם TMDP נותן 2-הידרוקסי-4,4'-5,5'-tetramethyl-1,3,2-דיוקספוספולן. תרכובת זו היא מלח flocculating חיוור-צהוב, מסיס בתערובת ממס pyridine / כלורופורם, גרימת רכישת אותות NMR לקוי. מאז רק משקל קטן (~ 30 מ"ג) של מדגם נדרש, זה צריך להיות חופשי של נדיפים עבור המשקל המדויק שלה להיות ידוע במדויק לפני הניתוח.
לפעמים, בעיות פתיון מדגם ניתן לקדם (במיוחד עבור דגימות מחומצנות מאוד) על ידי הוספת כמויות קטנות של ממס משותף (כלומר, דימתילפורמיד), סיוע פירוק מדגם. באופן עקרוני, כל ממס שאינו אינטראקציה עם TMDP יכול לשמש כדי לעזור פירוק מדגם. בחירתו של ממס משותף לא יכולה לכלול ממיסים שותפים המכילים הידרוקסיה מעבדה או קבוצות אמינו מאז שהם מגיבים עם ריאגנט, גרימת ספקטרום סופי מטעה. ראוי לציין, דימתילסולפוקסיד גם מגיב עם TMDP מונע את השימוש בו כמו ממס משותף. נוזלים יוניים מבוססי פירידין, כגון 1-אליל-3-בוטילפירידיניום כלוריד, ניתן להשתמש כאשר בעיות מסיסות להתעורר; עם זאת, הנוזל היוני צריך להיות שוב יבש48. כדי להמיס ליגנוסולפונטים (סוג ליגנין המאופיין במעלת גופרית גבוהה), הוכח טיפול מקדים הכולל המרה של קבוצות מנוטרלות לצורה החומצית שלהן. ניתן להמיר בנוחות ליגנוסולפונטים לתנאים החומציים שלהם באמצעות שרפים החלפה חומציים במדיה מימית. חומצות ליגנוסולפוניות וכתוצאה מכך מבודדים מהפתרון על ידי ספיחות שלהם על שרפים ספציפיים (למשל, XAD-7) ו desorption באתנול. אידוי של פתרונות אתנולית על לחץ מופחת ב 40 °C (40 °F) מאפשר בידוד של חומצות ליגנוסולפוניות. לאחר מכן ניתן לאפיין ליגנינים אלה על ידי 31P NMR מכיוון שהם מסיסים בתערובת הפירידין/ כלורופורם המוצעת על ידי הפרוטוקול.
ייבוש ואקום ממושך בטמפרטורות קלות מפחית ביעילות את כמות הלחות ונדיפים אחרים בכל דגימה. יש לציין כי כמויות קטנות של מים אינן משפיעות על הספקטרום הסופי מכיוון ש- TMDP נוסף עודף. בנוסף, במקרים מסוימים, כמות קטנה של 2-הידרוקסי-4,4'-5,5'-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane עשוי לנבוע מהלחות הקיימת בצינור NMR או בקבוקון המדגם. במקרים אלה, ערבוב מספיק כדי להמיס את כמות המשקעים שנוצרו לחלוטין. אם נוצרת כמות גבוהה של 2-הידרוקסי-4,4'-5,5'-טטראמתיל-1,3,2-דיאוקספוסופלן, מומלץ לחזור על הכנת המדגם, ולשפר את טיפול הייבוש. לדוגמה, לפני השימוש, כל כלי הזכוכית יכולים להיות מחוממים לזמן קצר עם אקדח חום.
הטווח הספקטרלי המשמש לתיעוד הספקטרום רחב בהשוואה לאזור העניין של האות לגבי קבוצות ההידרוקסיל השונות. עם זאת, חובה להבין אם נגזרת המדגם התרחשה בהצלחה. האישור של נגזרת מדגם מלא ניתן על ידי נוכחות של אות חזק סביב 174 ppm. שיא חד זה נובע TMDP לא נטען, וקיומו מבטיח כי ריאגנט היה נוכח עודף, ולכן, כל קבוצות הידרוקסיל נגזרו. אם שיא זה נעדר, שתי הסיבות הצפויות ביותר הן: (1) כמות TMDP המשמשת אינה מספיקה כדי לבצע את ההפקה המלאה של המדגם, או (2) כמות גבוהה של מים קיימת במדגם. במקרה הראשון, שימוש בכמות גבוהה יותר של TMDP יבטיח ככל הנראה את ההפקה המלאה של המדגם, והאות ב- 174 ppm יופיע. במקרה השני, המדגם צריך להיות מיובש בהרחבה רבה יותר. לאחר הבטחת עודף של TMDP, ניתן לבצע שילוב שיא. לפני פעולה זו, התקרב לחלון צר יותר (150 עד 132 ppm) שמגביל את אותות העניין.
כמות המדגם (~ 30 מ"ג) שיש לנתח, שדווח בפרוטוקול הניסיוני לעיל, נבחרה כדי לאסוף ספקטרום באיכות טובה עבור ספקטרומטר NMR 300 MHz או יותר. עם זאת, ראינו כי ניתן להפחית את כמות המדגם אם נעשה שימוש במגנט שדה של 500 מגה-הרץ ומעלה. לדוגמה, באיור 8D, ספקטרום NMR (הנובע ממכשיר 700 MHz) של מדגם שהוכן עם 7.2 מ"ג ליגנין מוצג. שילוב אותות של ספקטרום זה מציע את אותן תוצאות כמו אלה שהושגו בעת שימוש בכמויות גבוהות יותר של ליגנין. עובדה זו מגבירה את תחולתו של פרוטוקול זה עבור כל המחקר שבו כמויות קטנות של מוצרים זמינים.
בסך הכל, פרוטוקול ניסיוני זה יכול להיות מיושם על יישומי מחקר ופיתוח רבים בעת הבנת המקור והגורל של קבוצות הידרוקסי שונות הנוכחים ליגנינים וטאנינים נדרש. בפרט, כאשר בשילוב עם נתוני GPC ו- HSQC, הנתונים המתקבלים מציעים את ההזדמנות לפרט עוד יותר ולהעלות השערות על המבנה של ליגנין או טאנין. במקרים רבים שבהם שינויים כימיים מוחלים על קבוצות הידרוקסיה של ליגנין או טאנין, ניתוחים כמותיים 31P NMR יכול להיות בעל ערך רב כדי לזהות אם שינויים אלה התרחשו ובאיזו מידה. לדוגמה, איור 9 מציג שתי ספקטרום NMR של אותו ליגנין לפני ואחרי החמצון שלו. הערכה איכותית פשוטה מראה את הירידה של קבוצות הידרוקסיה אליפטית ארומטית על חמצון, ובכך לספק מידע והדרכה יקרי ערך.
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig09.jpg"> איור 9: ספקטרוםכמותי של 31P NMR של אותו אורגנוסולב ליגנין נגזר באמצעות TMDP (A)לפני ו -( B)לאחר חמצון שלה. הספקטרום נרשם באמצעות ספקטרומטר 300 NMR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig09large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
לסיכום, טכניקה זו יש את כל התכונות של להיות בין הכלים החיוניים והחזקים ביותר כאשר בירורים העוסקים פוליפנולי, OH נושא ליגנינים, וטאנינים (ואפילו פולימרים סינתטיים)49,50,51 צריך להיעשות במגוון תחומים, החל כימיה להנדסה, מביולוגיה לפולימר, ויישומי תרופות.

הליך זה, שפורסם לאחרונה בפרוטוקולי טבע1 צוטט יותר מ-3,000 פעמים בספרות הארכיונית והפך למדידה שגרתית לאפיון ליגנין וטאנין, שכן הוא מספק מידע מבני חיוני, מהיר ושחזורי.
ליגנין וטאנינים כאשר כימיה ירוקה הוצגה על ידי פול ט אנסטס וג'ון ס . ורנר2,3, זה שינה באופן דרסטי את התפיסה הכללית של כימיה. בפרט, החשיבות של שימוש בחומרים בני קיימא במקום מזון מאובנים, כגון נפט ופחם, כנקודת התחלה מודגשת כהיבט מכריע2,3. בין סוגים שונים של ביומסה, ליגנין הוא הביופולימר הארומטי הנפוץ ביותר וניתן לראות בו מקור פוטנציאלי לסחורות תעשייתיות ומוצרי ערך מוסף גבוה4.
ליגנין הוא מרכיב העץ השני הנפוץ ביותר (עם תאית להיות הראשון והיצלוז השלישי). תכולתו בצמחים משתנה בהתאם לסוג הצמח: למשל עץ קשה המאופיין בכמות נמוכה יותר של ליגנין בהשוואה לעצים רכים (20% ± 4% לעומת 28% ± 4%). בנוסף, התפלגות ליגנין בתוך רקמת הירקות אינה הומוגנית: תכולת ליגנין גבוהה יותר ניתן למצוא בקיר התא5,6. ליגנין הוא חומר פוליפנולי המתקבל בתעשייה כמו תוצר לוואי של תעשיית הנייר / תאית7. הוא התאושש מתהליך ריסוס העץ, שבו שבבי עץ מעובדים בעיקר בנוכחות OH- ו / או OH- + HS- תנאי יונים כדי להפריד תאית מן המיצלולוז ו ליגנין (סודה ו / או קראפט תהליכים)8,9.
הניסיונות הראשונים ללמוד ליגנין נעשו על ידי פיין ו Schultze, בהתאמה, בשנים 1838 ו 186510. בשנת 1977, אדלר סיכם את כל הידע הרלוונטי הזמין של התקופה11. כיום ידוע כי אבני הבניין של ליגנין הן שלוש יחידות פניל-פרופנואידים: p-coumaryl, coniferyl, ואלכוהול סינפיל. מונומרים אלה, הודות לתהליך פילמור רדיקלים חופשיים, מעוררים יחידות p-hydroxyphenyl, guaiacyl ו- sinapyl שבסופו של דבר מהוות ליגנין (איור 1)12. היעדר מבנה ראשוני בליגנינים מרמז על קושי מובנה באפיון המבני שלו. בהתאם, הערכת התפלגות המשקל המולקולרי תמיד הייתה שנויה במחלוקת. ליגנין עץ טחון, ליגנין מבודד בתנאים קלים כי משוער בעיקר protolignin10, מורכב אוליגומרים13 אשר אינטראקציה רבה באמצעות תהליכי צבירה supramolecular14,15.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig01.jpg"> איור 1: דגם מייצג של ליגנין מעץ רך שבו מודגשת סוגי האג"ח השונים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
ליגנינים מסווגים בדרך כלל בהתאם ל: (א) סוג העץ שממנו הם נגזרים (למשל, עץ קשה ועץ רך), (ב) התהליך המשמש לבידודו. סוגי ליגנין תעשייתיים חיוניים ביותר הם קראפט, ליגנוסולפונטים, ו Organosolv.
מבנה ליגנין תלוי מאוד במקורו ובכימיה של העיבוד. ליתר דיוק, כאשר המבנה המורכב ולא סדיר למדי של ליגנין מורכב עם המגוון הטבעי שלה ואת הכימיות עיבוד המורכבות, חומר של שונות קיצונית, גיוון, והטרוגניות עולה, הגבלת השימוש בו ליישומים בעלי ערך נמוך16. בעוד ליגנינים עץ רך מכילים בעיקר יחידות guaiacyl (G) עם כמויות זניחות של קבוצות p-hydroxyphenyl (G lignin), ליגנינים עץ קשה מורכבים על ידי guaiacyl ו syringyl subunits (GS ליגנין) ביחסים משתנים ליגנינים דשא מורכבים על ידי guaiacyl, סירינגיל, ו p-hydroxyphenyl (GSH ליגנין) subunits. הגישה החילוץ המשמשת לבידוד משפיעה באופן דרמטי על המבנה של ליגנין המתעורר17. איור 2 מתאר שלושה מבני ליגנין, השונים בגישת הבידוד המופעלת. כמה שיקולים לגבי ההשפעה של שיטת החילוץ ניתן להדגיש. ראשית, קראפט ליגנין הוא ליגנין מעוסק, מקוטע מאוד, מרוכז מאוד, בעוד אורגנוסולב ליגנין יש מבנה דומה ליגנין עץ טחון (מבודד באמצעות גישת ביורקמן)18,19,20. לבסוף, ליגנוסולפונטים מאופיינים ברמה גבוהה של גופרית, בהתאם לעוצמה ולתנאים של תהליך סולפונציה תמציתית.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig02.jpg"> איור 2: מבנים מייצגים לליגנינים טכניים. באיור זה ניתן לראות את ההבדלים בין הסוגים השונים של ליגנין. (A)ליגנין קראפט עץ רך מרוכז מאוד, (B) ליגנוסולפונטים מאופיינים בקבוצות סולפוניות על פחמנים רוויים, ו (C) organosolv ליגנין יש מבנה דומה לזה של ליגנין עץ טחון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בדומה לליגנינים, טאנינים הם תרכובות פוליפנוליות הנמצאות בצמחים. סקירה עדכנית ומעודכנת על גישות החילוץ והיישומים של טאנינים פורסמה לאחרונה על ידי Das et al.21. את החשיבות של טאנינים בחיי היומיום ניתן להדגיש בהתחשב בשתי דוגמאות: הם להקנות טעם וצבע ליינות22; יתר על כן, המבנה הפוליטי שלהם מציע מאפיינים נוגדי חמצון והופך אותם לאידיאליים ליישום בתעשיית השיזוף23. טאנינים מחולקים לשני סוגים: הידרוליזה ולא הידרוליזה. טאנינים הידרוליזים יכולים להיחשב כפולימר של אסטרים גאליים, די-גאליים וחומצה אלגית(איור 3). אסטרים אלה נובעים אסתריות של חומצות פנוליות עם מולקולות סוכר (למשל, גלוקוז, rhamnose, ו arabinose).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig03.jpg"> איור 3: טאנינים הידרו-סבירים אופייניים: חומצה טאנית, ווסקלגין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טאנינים שאינם ניתנים ל hydrolyzable, הידוע גם בשם טאנינים מרוכזים, הם פולימרים ואוליגומרים הנובעים flavan-3-ols. בקרב פלוואן-3-ols, קטכינים וגאלוקאטצ'ין הם הנפוצים ביותר. מדובר בתרכובות גבישיות חסרות צבע(איור 4). פילמור יוצר פולימר המאופיין במבנה הליקוידאלי. קבוצות ההידרוקסי הארומטיות מכוונות לחלקו החיצוני של הליקס, בעוד שהחמצן הפיראן נמצאים בפנים.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig04.jpg"> איור 4: מבני פרואנטוצ'יאנידין: R =H, OH, OCH3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
אפיון של ליגנינים וטאנינים באמצעות NMR שני סוגי מידע חיוניים באפיון ליגנין או טאנין: (א) מבנה כימי (למשל, תוכן קבוצת הידרוקסי, טבע ותדירות של חיבורים בין-איחודיים) ו-(ב) משקל מולקולרי ופולידיספרסיות. מאז המחקרים המוקדמים על ליגנין, טכניקות שונות שימשו להשגת מטרות אלה, ושני סוגים של שיטות הופיעו: שיטות כימיות ופיזיות.
בכימיה ליגנין, שיטות כימיות, כגון חמצון אלקליין ניטרבנזן, נגזרת ואחריו מחשוף רדוקטיבי, חמצון פרמנגנט, ותיאואצידוליזה, היו בשימוש נרחב מבחינה היסטורית24,25,26,27,28,29. עם זאת, גם אם הפרוטוקולים האנליטיים יושמו ומותאמו, הם תובעני זמן, מייגע, ודורשים מיומנויות ניסיוניות נרחבות30. לחלופין, מתחילת הניתוח האינסטרומנטלי, שיטות פיזיות שימשו לביצוע אפיוני ליגנין וטאנין31. טכניקות אלה מאפשרות להתגבר על הבעיות של שיטות קלאסיות מה שמקל על אפיון מבנה ליגנין.
תהודה מגנטית גרעינית (NMR) מאפשרת קבלת מידע על מבנה ליגנין והרכב כימי בין הטכניקות האינסטרומנטליות. בפרט, נתונים מספקטרום מונו-ממדי כמותי 1H NMR וס spectra כמותית של 13C NMR יכולים לספק מידע על סוגים שונים של מליטה בין-לאומית ליגנין32,33,34,35. למרבה הצער, ספקטרום חד-ממדי סובל מחפיפת אותות, שעלולה לפגוע קשות במאמצי שילוב האותות. גרסאות כמותיות של HSQC (קוהרנטיות קוונטית בודדת הטרונוקליארית), Q-HSQC (כמותית - קוהרנטיות קוונטית בודדת הטרונוקרית), שימשו להבנת מבנה ליגנין טוב יותר, ומספקות מידע מועיל על חיבורים פנימיים. עם זאת, לא ניתן להשתמש בהם באופן מלא כדי לקבוע את יחידות הבניינים השונות13,36,37 כמותית.
כדי להתגבר על הבעיות הקשורות NMR מונו ודו מימדי, נגזרת מצע נחשב. בין היתרונות של גישה זו היא כי תוויות ספציפיות ניתן להציג בתוך macromolecule המורכב ואין הפרעה ספקטרלית נובעת הממס שבו המצעים המסומנים מומסים1. Verkade היה החלוץ בתחום זה, ביצוע 31P NMR ניתוח של נגזרות זרחן, נגזרות פחם, ותרכובות הקשורות38. בפרסום שלה, הקרנה של ריאגנטים שונים המכילים זרחן (זרחן) בוצעה, ואת השינוי הכימי של תרכובות אחרות מתויגות נרשם. הצוות של ארג'ירופולוס הציג לראשונה נגזרת לניתוח כמותי ואיכותי של קבוצות הידרוקסי בליגנין בשנת 1991. לאחר שחקר את ההפקה של תרכובות מודל ליגנין באמצעות ריאגנטים המכילים זרחן, הקבוצה שלו סללה את הדרך לאחת הטכניקות הנפוצות ביותר בכימיה ליגנין, 31P NMR ניתוח39,40,41,42,43. בין הפוספולנים השונים שנבדקו, ארג'ירופולוס הגיע לשימוש של 2-כלורו-4,4,4,5,5-טטראמתיל-1,3-2-דיוקספוסופלן (TMDP) כמתאים ביותר לביצוע ניתוח ליגנין44. TMDP מגיב באופן סלקטיבי עם קבוצות הידרוקסיות הגורמות להיווצרות כמותית של נגזרות המכילות זרחן המאופיינות במשמרות כימיות ספציפיות של 31P NMR (איור 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig05.jpg"> איור 5: כימיה של ליגנין וטאנין פוספיטיליציה. תיוג קבוצות ליגנין וטאנין labile H מושגת על ידי בתגובת situ. הפוליפנולים המסומנים מאופיינים ברצועות ספציפיות של 31P NMR המתאימות לסוגים שונים של קבוצות הידרוקסיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
נגזרת מדגם מבוצעת בתערובת פירידין/כלורופורם (1.6:1); בחירה זו נובעת מהערכה מדויקת. לפירידין יש שני יתרונות. ראשית, בחירת ממס המאופיין בפרמטר הילדברנד של כ 22.1 MPa1/2 מפשטת ומגבירה ליגנין סולוביליזציה45. כתוצאה מכך, התוספת של פירידין כממס, שפרמטר הילדברנד שלו שווה 21.7, הוא אפוא אופטימלי. שנית, התגובה של TMDP עם קבוצות הידרוקסיה מלווה בהיווצרות של חומצה הידרוכלורית (HCl) כמוצר לוואי עם השלכות שליליות במקביל להיווצרות facile של נגזרות ליגנין-פוסופלן. מסיבה זו, HCl וכתוצאה מכך צריך להיות מנוטרל. כאשר קיים עודף משמעותי, הבסיסיות של הפירידין, יחסית TMDP, מאפשר נטרול של HCl (באמצעות היווצרות של הידרוכלוריד פירידין).
השימוש במערכת הממס הבינארית המומלצת של הפירידין/כלורופורם מבוסס על שלוש סיבות. ראשית, הוא מעדיף פירוק מדגם. שנית, כמו פירידין הידרוכלוריד הוא מסיס בכלורופורם, זה יכול למנוע משקעים והידרדרות של הספקטרום הסופי. שלישית, כלורופורם מפורק נבחר עבור אות הסינגל הייחודי שלו, המאפשר נעילה של ספקטרומטר NMR במהלך תהליך הרכישה. נגזרת לדוגמה מבוצעת בנוכחות תקן פנימי. בדרך זו, כאשר המדגם ואת התקן נגזרים, ההשוואה של אינטגרלים של פסגות המדגם ואת התקן מאפשר כימות של הסכום עבור כל סוג של קבוצת הידרוקסי נוכח. תרכובות שונות נחשבו לסטנדרטים פנימיים. תרכובות אלה מאופיינות על ידי קבוצה הידרוקסית אחת לכל מולקולה, המציע אות חד יחיד בספקטרום 31P NMR לאחר derivatization. הבחירה של התקן חייב להיעשות בזהירות. האות שלה לא צריך לחפוף עם אלה של המדגם נגזר. כולסטרול היה בשימוש נרחב בימים הראשונים. עם זאת, חפיפה חלקית עם אותות הנובעים מקבוצת הידרוקסיה אליפטית מגבילה את השימוש בו. לניתוח שגרתי, פתרונות סטנדרטיים פנימיים של N-hydroxy-5-norbornene-2,3-dicarboximide (NHND) מועדפים. עם זאת, בשל חוסר יציבות NHND, הפתרונות הסטנדרטיים שלה ניתן לאחסן רק לכמה ימים46.

<table><tbody><tr><td>100 - 1000 ומיקרו; l מיקרופיפטה אפנדורף</td><td>VWR</td><td>613-0866</td><td></td></tr><tr><td>20 - 200 ומיקרו; l מיקרופיפטה אפנדורף</td><td>VWR</td><td>613-0865</td><td></td></tr><tr><td>2-כלורו-4,4,5,5-טטרמתיל-1,3-2-דיאוקסאפוספולן, 95%</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>447536</td><td></td></tr><tr><td>איזון אנליטי (רגישות ופלוסמן; 0.1 מ"ג)</td><td>Precisa</td><td>LX220 A</td><td></td></tr><tr>קלסר<td>תנור ואקום</td><td>קלסר</td> ערכת בקבוקון מוסמכת <td>VD53</td><td></td></tr><tr><td>, ספיחה נמוכה (LA), 2 מ"ל, pk של 100</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>29651-U</td><td></td></tr><tr><td>כלורופורם-d</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>151823</td><td></td></tr><tr><td>כולסטרול,</td> סיגמא-אולדריץ' <td></td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>מסננות מולקולריות בדרגת סיגמא, 4A</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>208604</td><td></td></tr><tr><td>N-הידרוקסי-5-נורבורנן-2,3-דיקרבוקסמיד, 97%</td> ספקטרומטר תמ"ג <td>226378</td> <td>סיגמא-אולדריץ</td>'<td></td></tr><tr><td>, 300 מגה-הרץ</td><td>ברוקר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>נורל&nbsp; קוורץ טבעי 3 מ"מ NMR צינורות</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>NORS33007</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה, 100-1000 ומיקרו; L UltraFine (כחול)</td> <td>VWR</td><td>613-0342</td><td></td></tr><tr><td>קצות פיפטה, 20-200 ומיקרו; L נקודת שיפוע (צהובה)</td> <td>VWR</td><td>613-0239</td><td></td></tr><tr><td>פירידין, נטול מים, 99.8%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>270970</td><td></td></tr><tr><td>מוטות ערבוב, מיקרו, אורך 3 מ"מ</td><td>VWR</td><td>442-0360</td><td></td></tr><tr><td>מוטות ערבוב, מיקרו, אורך 6 מ"מ</td><td>VWR</td><td>442-0362</td><td></td></tr><tr><td>תחמוצת טריפנילפוספין, 97%</td> <td>בקבוקוני סיגמא-אולדריץ'</td><td>T84603</td><td></td></tr><tr><td>לניתוח סביבתיWHEATON,&nbsp;, 20.00 מ"ל</td><td>DWK WHEAW224609</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדעי החיים נייר שקילה, כיתה 531</td><td>VWR</td><td>516-0318P</td><td></td></tr></tbody></table>

ניתוח כמותי 31p nmr של ליגנינים וטאנינים

Quantitative 31P NMR Analysis of Lignins and Tannins

הפיתוח של מוצרי ביו-רפינריה בני קיימא מתמודד, בין היתר, עם האתגר של ליגנין וגבורת טאנין. ביופולימרים ארומטיים שופעים ומתחדשים אלה לא נוצלו באופן נרחב בשל מורכבותם המבנית הטבועה ודרגות גבוהות של שונות ומגוון מינים. היעדר מבנה ראשוני מוגדר עבור פוליפנולים אלה מורכב עוד יותר עם שינויים כימיים מורכבים המושרה במהלך העיבוד, בסופו של דבר להקנות מגוון גדול של תכונות מבניות של משמעות קיצונית עבור כל מאמצי ניצול נוספים.
כתוצאה מכך, פרוטוקול לזיהוי וכימות מהירים, פשוטים וחד משמעיים של הקבוצות התפקודיות השונות הקיימות בפוליפנולים טבעיים, הוא תנאי בסיסי להבנה ובהתאם להתאים את תגובתם ואת התועלת הסופית שלהם.
כמותי 31P NMR מציע את ההזדמנות לזהות במהירות ובאופן אמין לא מוגדר, o-מונו מוחלף, ו o-disubstituted פנולים, OHs aliphatic, ו moieties חומצה קרבוקסילית בליגנינים וטאנינים עם פוטנציאל יישום רחב.
המתודולוגיה מורכבת מהליך ליגנין כמותי במקום או טאנין באמצעות בדיקה המכילה 31P מתאימה, ואחריה רכישת ספקטרום כמותי של 31P NMR בנוכחות תקן פנימי. השפע הטבעי הגבוה של גרעין 31P מאפשר כמויות קטנות של המדגם (~ 30 מ"ג) וזמנים קצרים רכישת NMR (~ 30-120 דקות) עם אותות 31P נפתר היטב כי הם תלויים מאוד בסביבה הכימית שמסביב של קבוצות OH שכותרתו.

הפרוטוקול המתואר ניתן להחיל הן לניתוח של ליגנינים וטאנינים. בכימיה ליגנין, שיטה זו היא בסיסית כי זה מאפשר זיהוי וכימות של סוגים שונים של קבוצות הידרוקסיה. איור 8A-D מציג דוגמאות לספקטרום 31P NMR של ליגנינים וטאנינים שנרכשו עם ספקטרומטרים הפועלים בתדרים שונים. הספקטרום המוצג באיור 8A נרשם באמצעות ספקטרומטר NMR של 300 מגה-הרץ, ואילו איור 8D נרשם עם מכשיר NMR של 700 מגה-הרץ.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62696/62696fig8v2.jpg"> איור 8: ספקטרום כמותי של 31P NMR של (A) קראפט ליגנין מעץ רך (ספקטרום שנרשם בספקטרומטר 300 מגה-הרץ על 30.8 מ"ג ליגנין), (B) חומצה ליגנוסולפונית מעץ רך (ספקטרום שנרשם בספקטרומטר 300 MHz ב-30.1 מ"ג ליגנין לאחר שימור ליגנוסולפונט לחומצה ליגנוסולפונית), (C) שיטה טאנין (ספקטרום נרשם בספקטרומטר 300 מגה-הרץ על דגימה של 30.3 מ"ג) ו-(D) קראפט ליגנין מעץ רך (ספקטרום שנרשם בספקטרומטר 700 MHz על 7.2 מ"ג ליגנין). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62696/62696fig8v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
ספקטרום אלה נרשמו בקפידה ועובדו באופן ידני. האותות הטיפוסיים לאליפטי (150-145 ppm), ארומטיים (145-137 ppm) וקבוצות הידרוקסיות קרבוקסיות (136-134 ppm) נפתרות היטב וככאלה משולבות בקלות. אם החלון הספקטרלי נפתח (מ-95 עד 190 ppm, איור 8),שלוש פסגות חדות וחזקות (175, 144 ו-132 ppm) נראות לעין. אלה נובעים עודף של TMDP, התקן הפנימי (כולסטרול או NHND), ואת hydroxylated-TMDP (נגרמת על ידי עקבות מים), בהתאמה.
בניגוד קראפט ו organosolv ליגנין, ליגנוסולפונטים הם מסיסים בתערובת פירידין / כלורופורם. כדי להשיג ספקטרום אמין של 31P NMR, מסיסות היא חובה. כדי להתגבר על בעיה זו, ליגנוסולפונטים ניתן להמיר חומצות ליגנוסולפוניות המתאימות לפני derivatization. טיפול בתסמי ליגנוסולפונט עם חומצות חזקות (כלומר, חומצה גופרתית), או שרף להחלפת חומצה (למשל, Dowex 1H, מחליף קטיונים חומצי חזק) מניע את ההמרה של כל קבוצות הגופרתיות בצורות החומציות שלהן. ניתן להסיר את המוצרים המתקבלים מהפתרון החומצי באמצעות שרפים סוחפים סלקטיביים (XAD-7, סופח קוטב המשמש לבידוד תרכובות המאופיינות במשקלים מולקולריים של עד 60,000 u.m.a) שנותחו באמצעות פרוטוקול זה. איור 8B מציג את הספקטרום הכמותי של 31P NMR של חומצה ליגנוסולופונית שמקורה ב-TMDP. גם במקרה זה, האותות השונים של קבוצות ההידרוקסי ניכרים. איור 8C מציג ספקטרום כמותי טיפוסי של 31P NMR של דגימת טאנין המופקת באמצעות TMDP. אות אופייני מן ה- OH האליפטי השונה (טבעת C), פירוגאלול ויחידות קטכול בטבעת B ויחידות בטבעת A נראות היטב.

31 P NMR הוא כלי רב עוצמה עבור ההבהרה המבנית של פוליפנולים. הליך אנליטי מהיר, קל, מדויק, כמותי ושחזורי מאוד זה, המאפשר כימות ובידול של סוגים שונים של קבוצות הידרוקסיות, פנוליות וקרבוקסיליות בליגנינים וטאנינים הפך כעת לכלי אנליטי שגרתי.

ניתוח כמותי 31P NMR של ליגנינים וטאנינים

The development of sustainable biorefinery products is confronted, among others, with the challenge of lignin and tannin valorization. These abundant, ...

זרחן כמותי NMR מייצג את אחת פריצות הדרך המשמעותיות ביותר בכימיה אנליטית ליגנין וטנין במהלך שלושת העשורים האחרונים. טכניקה זו מציעה מידע מהיר, אמין וכמותי עבור קבוצת ההידרוקסיה השונה במדגם. שיטות NMR אלה יש ערך עצום בהבנת המבנה של ליגננים וטאנינים.זה גם הוחל על מגוון רחב של מערכות אחרות שיש להם קבוצות הידרוקסיל תגובתי. התחל על ידי טיפול מראש 100 מיליגרם של מדגם ליגנין או טאנין על ידי ייבוש לילה בתנור ואקום ב 40 מעלות צלזיוס. לאחר הייבוש, מעבירים במהירות את הדגימה למייבש סידן גופרתי נטול מים עד שהוא מגיע לטמפרטורת החדר.כדי להכין את המדגם לספקטרוסקופיית NMR, לשקול במדויק כ -30 מיליגרם של המדגם במין שני מיליליטר מצויד בר ערבוב. לאחר מכן, להוסיף 500 microliters של פתרון ממס מוכן טרי לחקירה מדגם ולאטום את הקרבון עם כובע. באמצעות מיקרופיפט, להוסיף 100 microliters של הפתרון הסטנדרטי הפנימי לפקעת המדגם, ולאחר מכן מערבבים מגנטית את הפיזור וכתוצאה מכך ב 500 סיבובים לדקה.כאשר המדגם מומס לחלוטין, להעביר 100 microliters של tetramethyl dioxyphospholane או TMDP לפתרון המדגם תוך כדי עבודה מתחת למכסה המנוע ולאטום את פתרון המדגם לפני הצבת המדגם עבור ערבוב מגנטי נמרץ. בשלב זה, התגובה המצוינת מתרחשת על דגימות ליגנין וטאנין. באמצעות פיפטה פסטר, להעביר את הפתרון לדוגמה לתוך צינור NMR לניתוח.אם משקעים צהובים נצפים במדגם, לחזור על ההליך על ידי הבטחת כל זיהום לחות אפשרי נמנע. טען את צינור הדגימה למכשיר NMR המצויד בבדיקת פס רחב והגדר את הפרמטרים הניסיוניים. באמצעות תדר התהודה של כלורופורם מפורק, הגדר את התדירות בספקטרומטר.שים את הדגימה וכוון את הספקטרומטר לפני תחילת הרכישה. התחל לעבד נתונים גולמיים מפרטטרוסקופיית P31 NMR על-ידי ביצוע טרנספורמציה של פורייה. התאם את השלב לפי תיקון פאזה ידני על-ידי הרחבת לשונית העיבוד ובחירת תיקון פאזה ותיקון ידני.תקן את תוכנית הבסיס באופן ידני על-ידי הגדרת נקודות אפס בזהירות לאחר לחיצה על עיבוד ובחירה של תיקון בסיסי וקו בסיס מרובה נקודות. לכיול האות, הגדר את האות עבור המים הזרחניים בערך ההזזה הכימית של 132.2 חלקים למיליון על-ידי פתיחת לשונית הניתוח ולאחר מכן בחר הפניה בכרטיסיית הייחוס. לשילוב אותות, פתח חלק בלתי נפרד מתפריט הניתוח.כדי לנרמל את האינטגרציה, הגדר את התקן הפנימי ל- 1.0 על-ידי לחיצה על הפסגה כדי לבחור ערוך אינטגרל והזן ערך 1.00 בכרטיסייה מנורמלת, ולאחר מכן בצע שילוב ספקטרום בהתאם לשינויים הכימיים המדווחים בכתב היד. השתמש במשוואה כדי לחשב את הריכוז הטוחן של תקן פנימי, או IS, פתרון ולהשתמש בערך המחושב כדי להעריך את הסכום המקביל של האות הספציפי לכל גרם של המדגם. כימות הספקטרום של קבוצות הידרוקסיות שונות בליגנין מלאכה רך הנגזר עם TMDP נרשם באמצעות ספקטרומטר NMR 300 מגה-הרץ ו-700 מגה-הרץ.בספקטרום NMR, שיאים חדים וחזקים זוהו ב 144 ו 132 PPM בשל התקן הפנימי וההידרוקסיליקציה של TMD בהתאמה. האותות השונים של קבוצות ההידרוקסי ניכרו בכל הספקטרום הכמותי P31 NMR של ליגנינים. בספקטרום P31 NMR כמותי של דגימת טאנין נגזר באמצעות TMDP, אות אופייני מן pyrogallol או אליפטי שונים יחידות catechol היו גלויים היטב.ההשוואה בין ספקטרום NMR של ליגנין לפני ואחרי חמצון נרשמה באמצעות ספקטרומטר NMR 300 מגה-הרץ מראה את הירידה בעוצמת הפסגות של קבוצות הידרוקסיה. השלבים המכריעים הם אלה הנוגעים לייבוש ולשוקול המדגם ופרמטרי עיבוד NMR שיש להשתמש בהם. והכי חשוב, ההדגשה של הספקטרום המתקבל.כאשר שיטה זו מצוידת עם כרומטוגרפיה דו-ממדית של NMR וג'ל, עשויה לצוץ תמונה מפורטת מאוד של פוליפנולים טבעיים, המציעה מידע מבני חסר תקדים ותובנות חדשות.

quantitative-31p-nmr-analysis-of-lignins-and-tannins

Research

JoVE Journal

Chemistry

כימיה

ביומסה הצמח הוא משאב מרכזי פחמן ניטרלי מתחדשת שיכול לשמש לייצור דלק ביולוגי. ביומסה הצמח מורכב בעיקר קירות התא, חומר מרוכב מורכבות מבנית כינה lignocellulosics. כאן אנו מתארים פרוטוקול לניתוח מקיף של התוכן הרכב ליגנין polyphenolic.

ניתוח מקיף של ההלחנה קירות התא הצומח (ביומסה Lignocellulosic) חלק א: ליגנין

השיטה מבוססת על מיקרוסקופיה ראמאן confocal מוצג שמקנה ללא תווית להדמיה של ליגנין בדפנות תא הצמח והשוואת lignification ברקמות, מדגמים שונים או מין.

ללא תווית באתרו הדמיה של Lignification בתוך קירות התא הצמח

טכניקת התערבות RNA פעמיים תקועה (dsRNAi) היא מועסק ללמטה להסדיר את אנזים cinnamoyl תירס רדוקטאז גן (ZmCCR1) לתוכן ליגנין צמח נמוך יותר. ליגנין למטה תקנה מקיר התא דמיינו ידי ניתוח מיקרוסקופי ולכמת בשיטת Klason. שינויי הלחנה בhemicellulose ותאיים גבישים מנותחים.

ליגנין Down-תקנה של<em&gt; Zea mays</em&gt; באמצעות dsRNAi וKlason ליגנין ניתוח

מבנה דופן התא של הצמח ותכונות הכימיה מוערכים כדי לזהות חומרי גלם אידיאליים לדלקים ביולוגיים וביו-חומרים. לשיטות סטנדרטיות יש מגבלות כאשר הן מיושמות על ערכות נתונים גדולות. שיטות טיפול מקדים בתפוקה גבוהה, סכריזציה של אנזימים וספקטרומטריית מסה של קרן פירוליזה-מולקולרית משוות מספר רב של דגימות ביומסה עם ירידה בזמן הניסוי ובעלות.

הקרנת תפוקה גבוהה של וריאציות סרבנות בlignocellulosic יומסה: סה&quot;כ ליגנין, מונומרים ליגנין, ואנזימתי שחרור סוכר

פרוטוקול זה נועד להציג שיטה כללית לדמיין ליגנין, תאית, hemicellulose בקירות תא הצמח באמצעות הדמיה ראמאן ניתוח רב משתני.

שילוב ראמאן הדמיה ניתוח רב משתנים לדמיין ליגנין, תאית, ו Hemicellulose בקיר תא צמחים

אנו מציגים פרוטוקול לסינתזה של C5 סוכרים (xylose, אראבינוז) מ מתחדשת שאינם מיועדים לאכילה lignocellulosic ביומסה (קרי, יוטה) עם הנוכחות של Brønsted נוזלים יוניים חומצי (ביצים) כזרז במים. הזרז ביילס הציג כדאי קטליטי ביצועים יותר קונבנציונליים המינרל זרזים חומצה (H2אז4 ו- HCl).

שיטה לניתוח Pentosan נוכח יוטה ביומסה והמרה שלה לתוך מונומרים סוכר באמצעות נוזל חומצי יוניים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבצע הפקת אתנול ליגנין ממספר מקורות ביומסה. השפעת התנאים החילוץ על התשואה ליגנין ותוכן β-O-4 מוצגים. Depolymerization סלקטיבית מבוצעת על lignins שהושג להשיג מוצרים גבוהה מונומר ארומטי.

מיצוי של ליגנין עם תכולה גבוהה של β-O-4 על-ידי הפקת אתנול מתון והשפעתו על התשואה Depolymerization

OrganoCat היא שיטה לטיפול מראש ופירוק של ליגנוקולוז בתנאים קלים לתוך ליגנין, סוכרים מותססים, עיסת תאית. במערכת ממס ביוגנית, דו-פאזית של מים ו-2-מתיל-טרהידרופורן עם 2,5-furancarboxylic חומצה כזרז, מוצרי OrganoCat מופרדים במקום להתאוששות מוצר פשוטה.

שבר ביומסה ליגנוקולוסית באמצעות תהליך OrganoCat

טיפול מקדים מבוסס אוטקטי עמוק בסיוע מיקרוגל הוא תהליך ירוק, מהיר ויעיל לשברים ליגנוקלוסיים והתאוששות ליגנין בטוהר גבוה.

מיצוי ליגנין מהיר במיוחד משאריות ליגנוקלולוסיות ים תיכוניות יוצאות דופן

כאן, אנו מציגים שיטת TGA שונה להערכת תוכן ליגנין בביומסה צמחית עשבוני. שיטה זו מעריכה את תוכן ה-lignin על ידי יצירת קשרים תיותרים ספציפיים עם ליגנין ומציגה יתרון על פני שיטת קלסון, שכן היא דורשת מדגם קטן יחסית להערכת תוכן ליגנין.

הערכת תכולת ביומסה ליגנין צמחית באמצעות חומצה תיוגליקולית (TGA)

אנו מתארים מתודולוגיות חדשניות ופשוטות של סינתזה ואפיון של חלקיקי ליגנין מיקרו ותת-מיקרון תואמים ביולוגית. ניסוחים אלה מספקים גישה קלה לשימוש בהטרופולימר, כמו גם חלופה לתכנון רציונלי של מטריצות נשא רב תכליתיות עם ישימות פוטנציאלית בביו-רפואה, טכנולוגיה פרמצבטית ותעשיית המזון.

סינתזה ירוקה, אפיון, אנקפסולציה ומדידה של פוטנציאל השחרור של חלקיקי מיקרו-/תת-מיקרון אלקליים ליגנין חדשים

למד ניתוח כמותי של ליגנינים וטאנינים באמצעות ספקטרוסקופיית NMR פוספור-31. שיטה זו מאפשרת כימות מהיר ומדויק של קבוצות הידרוקסיל שונות במבנים פוליפנוליים.

ניתוח כמותי ³¹P NMR של ליגנינים וטאנינים

גלה סרטונים נוספים